生物化学-生化下课件34章-dna

华中科技大学生命科学与技术学院生物物理与生物化学研究所陆婕 生物化学第34章

DNA的复制和修复生物多样性生物稳定性DNA：生命的控制器.rm反中心法则中心法则DNAdependentDNApolymerase——DDDPDNAdependentRNApolymerase——DDRPRNAdependentRNApolymerase——RDRPRNAdependentDNApolymerase——RDDP第一节DNA复制的特点

DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。

一、半保留复制

1958年Meselson和Stahl的实验首次有力地支持了半保留复制方式。实验步骤：１.大肠杆菌放在15NH4C1培养基中生长15代２.再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养３.裂解细胞４.将裂解液放在CsC1溶液中进行密度梯度离心５.在紫外光下可以看到形成的区带Bacterialculture15NH4Cl(SoleNsource)GrowforseveralgenerationsBacterialculturewithdenseDNAThisisthestartingmaterialfortheexperimentHarvestcellsandresuspendinmediawith14NH4Cl

asthesoleNsourceBacterialculturewithdenseDNAGrowfor1generationHarvestsomecells“1stgeneration”GrowforanothergenerationHarvestsomecells“2ndgeneration”GrowforanothergenerationetcBacterialculture“0generation”14NH4ClMeselsonandStahlOriginalData意义：遗传稳定性遗传过程相对保守性复制起点:

DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点(Originofreplication)，用ori表示。

复制子:

DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。复制叉:

DNA复制的生长点形状如同分叉故称为复制叉。二、有一定的复制起始点用遗传学和生物化学的方法可以确定大肠杆菌染色体DNA的复制起点在基因图谱上的位置。*复制起点oriC*复制终点trpＣ、Ｂ、Ｆ允许反时针复制而阻止顺时针复制,复制终点、Ａ、Ｄ、Ｅ则正相反参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。三、需要引物

1、DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合，而RNA聚合酶可以催化游离的NTP聚合。2、RNA引物可供dNTP延长之用。3、RNA引物以后被降解，减少复制初始的错误率。问题：为什么以RNA为引物？

DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。

四、双向复制

DNA复制的不同方式：*直线双向*多起点双向*θ型双向*θ型单向*

滚环复制

（rollingcirclereplication）简单低等生物或染色体以外的DNA采取的特殊复制形式*Ｄ环(D-loop)复制由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为3'→5'。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。

五、半不连续复制以3‘→5’方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5‘→3’，这一条链被称为领头链(leadingstrand)。而以5‘→3’方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5‘→3’，这条链被称为滞后链(laggingstrand)。由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由滞后链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。

冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

第二节DNA复制的条件

一、底物(Substrate)

以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotidetriphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi

DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。

二、模板(template)

引发体(primosome)由引发前体与引物酶（primase）组装而成。引发前体是由若干蛋白因子聚合而成的复合体。在原核生物中，引发前体至少由六种蛋白因子构成。三、引发体和引物酶引物酶，催化引物合成的一种RNA聚合酶，本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA链能够开始聚合。

1956年，Kornbereg在大肠杆菌提取液中发现DNA聚合酶，以后陆续在其他原核生物及微生物中找到。DNA聚合酶的反应特点：※以四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为底物;※反应需要模板的指导;※反应需要有引物3'-OH存在;※DNA链的生长方向是5'→3'※产物DNA的性质与模板相同。四、DNA聚合酶

(DDDP)DNA聚合酶催化的反应复制中的碱基配对（一）理化性质：纯化的DNApolⅠ由一条单一多肽链组成，多肽链中含有一个锌原子。酶分子空间结构近似球体。DNApolⅠ约含1000个氨基酸残基，MW为109KD。经蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段：大片段（Klenow片段）有聚合酶和3'→5'外切酶活性，小片段有5'→3'外切酶活性。（A）、DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ)（二）功能：

1．聚合功能:通过核苷酸聚合反应使DNA链沿5‘→3’方向延长（ＤＮＡ聚合酶）在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。2．3'→5'外切酶活性──校对作用:这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸（对单链作用）。3．5'→3'外切酶活性──切除修复作用:5‘→3’外切酶活性就是从5‘→3’方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5‘-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部份(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5‘→3’。每次能切除10个核苷酸。这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用（切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体）。对冈崎片段5'末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。4．焦磷酸解作用:DNApolⅠ的这种活性可以催化3‘末端焦磷酸解DNA分子。5．焦磷酸交换作用:催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。

４和５两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。

（B）、DNA聚合酶Ⅱ

DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突变株仍能生存，这表明DNApolⅠ不是DNA复制的主要聚合酶。1970年发现了DNApolⅡ。此酶MW为88KD，每个细胞内约有100个酶分子，活性比DNApolⅠ高。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ的催化特性如下：5’→3’聚合酶活力:该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链DNA而中间有空隙(gap)的单链DNA部份，而且该单链空隙部份不长于100个核苷酸。有3’→5’外切酶活性，但无5’→3’外切酶活性。以四种脱氧核糖核苷酸为底物。该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。（C）、DNA聚合酶Ⅲ（一）、组成

DNApolⅢ全酶是由多种亚基组成的蛋白质，而且容易分解。现在认为它是大肠杆菌细胞内真正负责从新合成DNA的复制酶。

α、ε和θ三种亚基组成全酶的核心酶，称为polⅢ。α亚基具有5’→3’聚合DNA的酶活性，ε亚基具有校对功能，可提高聚合酶Ⅲ复制DNA的保真性。核心酶的活力较低，只作用于带缺口的双链DNA；加上τ亚基后就成为polⅢ’，它可以利用带有引物的长单链DNA。再加上延长因子γ和δ成为polⅢ*，也即是“天然的”聚合酶Ⅲ。β亚基与对引物的识别和结合有关，一旦全酶结合到DNA复制的起始部位，它即被释放出来，这一亚基又称为共聚酶Ⅲ。组成（二）、功能1．聚合:以模板作指导，以四种脱氧核糖核苷酸作为底物，并且需要有3’－ＯＨ的引物链存在，通过核苷酸聚合反应使DNA链沿5’→3’方向延长。催化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是DNA聚合酶Ⅱ的15倍和30倍。与DNA聚合酶Ⅱ相同，最适模板也是双链DNA中间有小段缺口（＜100个核苷酸）的单链DNA。2．3‘→5’外切酶活性和DNA聚合酶Ⅱ一样，其3‘→5’外切酶活性的最适底物是带有小段缺口（小于100个核苷酸）的双链DNA。（ε亚基具有3‘→5’外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关）3．无5'→3'外切酶活性Nucleotide_Polymerization大肠杆菌DNA聚合酶原核生物中的三种DNA聚合酶

延长随从链

备用，只在其他聚合酶无活性时才发挥作用线粒体DNA复制延长领头链校读、修复和填补缺口主要功能真核生物DNA聚合酶DNA聚合酶αDNA聚合酶βDNA聚合酶γDNA聚合酶δDNA聚合酶ε名称为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：

1．遵守严格的碱基配对规律；

2．DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；

3．对复制过程中出现的错误及时进行校正。

DNA复制的保真性：DNA连接酶(DNAligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。五、DNA连接酶

DNA连接酶催化的条件是：①需一段DNA片段具有3‘-OH，而另一段DNA片段具有5’-Pi基；②未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③需要消耗能量ATP。

酶－AMP复合物AMP－DNAATP（动物中）（细菌中）磷酰胺键单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为：①使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；②保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

六、单链DNA结合蛋白

解螺旋酶（unwindingenzyme）

，又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解螺旋酶。

七、解螺旋酶

核酸的拓扑结构是指核酸分子的空间结构。两条互相缠绕的双螺旋核酸分子表现出许多拓扑学的关系。DNA的复制、重组、转录和组装等过程牵涉到拓扑结构的转变。八、拓扑异构酶(topoisomerase)

当将线性过旋或欠旋的双螺旋DNA连接形成一个环时，都会自动形成额外的超螺旋(supercoil)来抵消过旋或欠旋造成的应力，目的是维持B构象。过旋DNA会自动形成额外左手螺旋，这样的超螺旋称为正超螺旋(positivesupereoil)；而欠旋形成额外右手螺旋，称为负超螺旋(negativesupereoil）。正超螺旋：盘绕过分负超螺旋：盘绕不足通过切断分子中的一条链或两条链中的磷酸二酯键后，消除或增加扭转张力，然后重新缠绕，再缝合切口，可以改变一个ＤＮＡ分子的连环数。催化这一过程的酶由于能够改变DNA的拓扑异构特性，称为拓扑异构酶。DNA拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。拓扑异构酶Ⅰ通过切断DNA的一条链，减少负超螺旋，增加连环数，每作用一次使连环数增加一个。反应无需供给能量。拓扑异构酶Ⅱ可切断DNA双链，引入负超螺旋，使连环数减少，每作用一次使连环数减少两个。反应需要由ATP供给能量。两种拓扑异构酶协同作用控制着DNA的负超螺旋水平，从而影响其功能。DNA双链穿过DNA双链重新连接DNA的释放重复起始DNA双链断裂拓扑异构酶Ⅱ的作用机制第三节DNA生物合成过程DNA合成期（S期）有丝分裂期：（前、中、后、末期）间期：两次分裂之间的一段时期（静止期）DNA合成后期（G2）DNA合成前期（G1）Life_Cycle_of_a_Cell1．解旋解链，形成复制叉：

DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。

一、复制的起始

DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。

（一）预引发：

2．引发体组装：

由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。

DnaA蛋白辨认E.coli上的复制起点并结合于重复序列的位点上DNA蛋白质复合体促使邻近的DNA进行解链DnaB蛋白在DnaC蛋白的协同下结合于初步打开的双链，并用解螺旋酶活性开链SSB参与作用（二）引发：

在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。

二、复制的延长

（一）聚合子代DNA：

由DNA聚合酶催化，以3‘→5’方向的亲代DNA链为模板，从5’→3’方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延长随从链)和δ（延长领头链）。

引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。

（二）引发体移动：三、复制的终止

在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。

（一）去除引物，填补缺口：DNA聚合酶Ⅰ水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。（二）连接冈崎片段：Bidirectional_Replication拓扑异构酶rep蛋白DNA结合蛋白(SSB）引发体随从链领头链DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅢDNA连接酶RNA引物5’3’5’3’DNA复制体上的活动（1）双链的解开（2）RNA引物的合成（3）DNA链的延长（4）切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（5）切除和修复掺入DNA链的脱氧尿苷酸和错配碱基线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。

（三）真核生物端粒的形成：

端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。

端粒酶的作用机制Telomere_Replication总结生物细胞DNA复制的分子机制的基本特点：1．复制是半保留的。2．复制起始于细菌或病毒的特定位置，真核生物有多个起始点。3．复制可以朝一个方向，也可以向两个方向进行，后者更为常见。4．复制时，DNA的两条链都从5’端向3’端延伸。5．复制是半不连续的。6．冈崎片段的合成始于一小段RNA引物，这一小段RNA以后被酶切除，缺口由脱氧核苷酸补满后再与新生DNA链连在一起。7．复制有多种机制，即使在同一个细胞里，也可因环境——酶的丰富程度、温度、营养条件等的不同而具有不同的起始机制和链延长的方式。Sanger提出的DNA核苷酸顺序测定法：双脱氧末端终止法突变的意义

第四节DNA的损伤(突变)与修复

1、突变是进化、分化的分子基础由于DNA碱基顺序的改变引起生物遗传性状显著变化的现象，称为基因“突变”。一切生物的变异和进化都可以认为是由于DNA结构的改变而引起蛋白质组成和性质变化的结果。2、只有基因型改变的突变

DNA多态性分析技术3、致死性的突变4、突变是某些疾病的发病基础血友病、地中海贫血病等一、DNA的损伤（突变）

由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。

（一）引起突变的因素：

1．自发因素：

(1)自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。

(2)自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。

(3)复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。

2．物理因素：

能够引起基因突变的物理因素主要包括：紫外线（UV）、高能射线和电离辐射等。当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如TT二聚体。X-射线以及放射性物质产生的辐射具有很高的能量，能直接引起DNA物理或化学性质的改变。另外，电离辐射将也能使DNA周围环绕的其它分子（主要是水）产生具有很高活性的自由基，这些自由基能够进一步与DNA分子反应，导致DNA结构发生变化。3.化学因素化学因素是引起DNA结构发生变化的最常见因素，主要包括：烷基化试剂，亚硝酸盐以及碱基类似物等。烷基化试剂能够与DNA分子中的氨基或氧作用，生成烷基化DNA。除了碱基上有多个位置可被烷基化外，DNA链上磷酸二酯键中的氧也容易被烷基化，从而导致DNA链的断裂。亚硝酸盐能够与碱基环外氨基作用，引起碱基的改变。例如A经亚硝酸盐作用后变成次黄嘌呤（I），C经亚硝酸盐作用后，则转变成U。碱基类似物是一类结构与核酸碱基相似的人工合成或天然化合物，由于它们的结构与核酸的碱基相似，当这些物质进入细胞后能够掺入到DNA链中，干扰DNA的正常复制和转录。常见的有碱基衍生物及稠环、稠杂环类化合物。例如5-溴尿嘧啶（5-BU），它与胸腺嘧啶碱基的结构相似，能取代T与A配对。又如一种称为二恶英的含氯芳香杂三环化合物（2,3,7,8-四氯-二苯-二恶英，简称TCDD），是一种具有强烈致癌和致畸物质。它能够进入细胞并与DNA结合，导致DNA复制发生错误，从而可能诱发癌变。（二）DNA突变的类型：

碱基的转换AC次黄嘌呤H1．同义突变：基因突变导致mRNA密码子第三位碱基的改变但不引起密码子意义的改变，其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变，但有时可引起翻译效率降低。

2．误义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，其意义发生改变，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。

（三）DNA突变的效应：

3．无义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换而改变成终止密码子，引起多肽链合成的终止。

4．移码突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，引起突变点之后的氨基酸残基顺序全部发生改变。

二、DNA损伤的修复

DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。

这是一种广泛存在的修复作用。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。（一）直接修复：

1．光复活（lightrepairing）：

光修复过程：光复活酶（photo-lyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物在300～600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复光复活酶从DNA上解离。

2．转甲基作用：

在转甲基酶的催化下，将DNA上的被修饰的甲基去除。此时，转甲基酶自身被甲基化而失活。

3．直接连接：

DNA断裂形成的缺口，可以在DNA连接酶的催化下，直接进行连接而封闭缺口。

这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。该修复机制可以分别由两种不同的酶来发动，一种是核酸内切酶，另一种是DNA糖苷酶。

（二）取代修复：

1．切除修复(excisionrepairing)：

结构缺陷切开切除修复连接碱基缺陷或错配碱基丢失切开切除碱基取代N－糖苷酶DNA损伤的切除修复过程2．重组修复(binationrepairing)：这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。许多能造成DNA损伤或抑制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOSresponse）。这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以SOS借喻细胞处于危急状态。3．SOS修复：DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。（1）SOS反应诱导的