临床生物化学检验与分子诊断学

临床生物化学检验与分子诊断学自编实验指导（供五年制医学检验、卫生检验、国境卫生检疫等本科专业使用）广东医学院临床生物化学教研室201012目 录实验一 生物化学检验实验基本操作 1实验二 Hanes作图法测定兔血红细胞过氧化氢酶的Km值 6实验三 凝胶过滤法分离蛋白质 8实验四 PCR扩增DNA 11实验五 分子诊断学实验基本操作及样品蛋白定量 17实验六 Western–blot技术：SDS 18实验七 Western–blot技术：电转移 21实验八 质粒DNA的转化 23实验九 质粒DNA的制备 28实验十 DNA的限制性内切酶酶切分析 34实验十一RT-PCR法钓取小鼠肝脏β-actin基因 38实验十二全血基因组DNA提取 41实验十三核酸定量 43PAGEPAGE22/45实验一生物化学与分子生物学实验基本操作一、实验记录及实验报告的书写生物化学与分子生物学实验是在生物化学与分子生物学理论及有关理论指导下的实践。实验目的在于经过实践掌握科学观察的基本方法和技能，培养科学思维、分析判断及解决实际问题的能力，培养尊重科学事实和真理的学风和科学态度。当然，通过实验还可以加深和扩大对生物化学与分子生物学理论的认识。为了达到实验的目的，要求学生在实验前进行预习，通过预习对实验的内容、目的要求、基本原理、基本操作及注意事项有初步的了解；要求学生在实验中合理组织安排时间，严肃认真地进行操作，细致观察各种变化并如实做好实验结果的记录；还要求学生在操作结束后认真进行计算或分析，写好实验报告。（一）实验记录实验记录应及时、准确、如实、详尽、清楚。“及时”是指在实验中将观察到的现象、结果、数据及时记录在记录本（或《实验指导》合适位置）上。回顾性的记录容易造成无意或有意的失真。实验结果的记录不可掺杂任何主观因素，不能受现成资料及他人实验结果的影响。若出现“不正常”的现象，更应如实详尽记录。表格式的记录方式简练而清楚，值得提倡使用。如无专用的记录本，可分项记录于《实验指导》中相应的操作项目之下。记录时字迹必须清楚，不提倡使用易于涂改及消退的笔、墨做原始记录。完整的实验记录应包括日期、题目（内容、目的、操作、现象及结果（括计算结果及各种图表。使用精密仪器进行实验时还应记录仪器的型号及编号。（二）实验报告实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。完整的实验报告应包括实验名称、实验日期、目的要求、实验原理、试剂、仪器设备、操作方法、实验结果、讨论等多项内容。其中，目的要求、原理、设备、试剂及操作方法等项只要求作简明扼要的叙述，不必也不应将《实验指导》原版抄录一遍。但对实验的条件、操作要点等实验成败的关键环节应作清楚描述。据及计算做出的各种图表（如曲线图、对照表等。讨论部分不是对结果的重述，而是对实验结果、实验方法和异常现象进行探讨和评论，以及对实验设计的认识、体会及建议。一般要有实验结论。结论要简单扼要，以说明本次实验所获得的结果。如在临床生化检验项目中，可评价样本检出值与相应正常值之间的异同及其临床意义。二、仪器操作（一）刻度吸量管：于取液量，同时必须看清楚吸量管的刻度读数，以免弄错。刻度数字要向着自己。切忌用大拇指堵住管口，控制流量。处。用洗耳球的下端出口对准吸量管上口，将液体轻轻吸上，眼睛注视上升液面，当液面上升至所需取量稍高一些刻度时，立即用右手食指按紧管口。调准刻度：吸管从溶液中取出后（如标准溶液或粘性较大的液体）须用小滤纸片将吸管尖端外部溶液擦干。然后用食指控制流量，使液面缓慢下降至所需刻度时（此时，液体弯月面底部、刻度和视线同在一水平线上，右手食指立即按紧吸管上口，使液体不再流出。内壁，但不能插入受器内原有液体之中，以免污染吸管及试剂。稍稍松动右手食指，使液体自然流出。放液后吸管尖端残留的液体是吹出或不吹出，则视选用吸量管种类要求而定。（二）微量移液器：使用方法：将吸嘴（Tip头）装在吸液杆上，应套牢避免间隙。依据所需容量旋转“手轮”，使“数轮”显示所需值。轻轻地将推动按钮下压，使推动按钮从“起始位置”推移到“置”。2～3cm2～3缓慢放松按钮,即回到“起始位置”，溶液吸入后稍停即可将吸嘴移出液面。至“第一停点位置”，稍停继续按压至“第二停点位置”。同时将吸嘴在容器内壁往复移动几次，排尽溶液。松开按钮移出容器。移液完毕，按压卸尖按钮将吸嘴脱卸。使用注意事项：“数轮”其标称的容量范围，否则使螺旋拧出壳体造成计数结构损坏。吸不同类型的溶液应更换吸嘴，以防止试样之间的交叉污染。新吸嘴在使用前应吸、排溶液几次，浸渍吸嘴以消除测量误差。移液器吸液后严禁倒置、平放，以免溶液流入内腔，损坏活塞。“数轮”腔的弹簧变形，导致读数出现较大的误差。长时间不用或刚从箱中取出的新移液器应轻轻用手将推动按钮上下按（三）离心机：检查各开关是否处于零位，放平机器。注意离心机的金属（或塑料）离心套管必须完整。管底应垫好软垫（花或胶垫。离心前将两支装有标本的离心管放入离心套管内，在天平称量，使之重量平衡（0.1g）好的离心管连同离心套管一起分别置于离心机对称位置上，以保持平衡。逐步加快至所需转速。切不可将转速一下调至最大，以免引起剧烈振动、损坏电机或使离心管破碎。减速，待离心机停稳后方可取出离心物。切勿用手或其他物件强行减速。水冲洗后再擦干，以免金属离心管被腐蚀、生锈而损坏。在使用中如发现声音不正常，应立即切断电源，待检查修复后再使用。（四）紫外可见分光光度计：WFZUV2100浓度值或斜率测量样品浓度等测量方式，可根据需要选择合适的测量方式。该546nm，测量方式自动设定在透射率方式100％T0%。在开机前，需先确认仪器样品室内是否有物品挡在光路上，光路上有阻挡物将影响仪器自检甚至造成仪器故障。无论选用何种测量方式，都必须遵循以下基本操作步骤。连接仪器电源线，确保仪器供电电源有良好的接地性能。接通电源，至仪器自检完毕，显示器显示“546nm100.0”即可进行测试。用<MODE>键设置测试方式：透射率(T)，吸光度（A浓度值方式（C）和己知标准样品斜率（F）方式。用波长设置键，设置测定波长。每当测定波长改变时，必须重新调整0A/100%T。UV-2100晶屏会显示“BLA―――”335nm处。正常情况下，仪器开机后，钨灯和氘灯同时点亮。为延长光源灯的使用寿命，仪器特别设置了光源灯开关控制功能，测定波长在335nm-1000nm时，应选用钨灯。盖。一般情况下，参比样品放在第一个槽位中。仪器所附的比色杯，其透射率是经过配对测试的，未经配对处理的比色杯将影响样品的测试精度。比色杯透光部分表面不能有指印、溶液痕迹，被测溶液中不能有气泡、悬浮物，否则也将影响样品测试的精度。将参比样品推（拉）“0A/100%T”键调0A/100%T，此时液晶屏显示的“BLA―――”直至“100.0”或“0.000”为止。后，将被测样品推（拉）入光路，此时液晶屏显示被测样品的透射率或吸光度值，接着拉动拉杆使第二、第三比色杯对准光路，按相同的方法读取数值。注意事项：分光光度计为贵重的精密仪器、要防震、防潮、防光和防腐蚀。力过猛，以防损坏机件。仪器应放在干燥的地方。防光：光电池平时不应受光照射。使用时要防止强光照射，防止长时间的连续照射。防腐蚀：使用时要防止酸碱等物质侵入机件内部。盛装待测液时，达到比3/4要轻柔，以防溶液溅出、腐蚀机件。比色杯的磨面。比色杯用完后立即先用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净、晾干。每台分光光度计比色杯为本台专用，不可与其他分光光度计的比色杯互换。实验二Hanes作图法测定兔血红细胞过氧化氢酶的Km值【原理】应：222酶22O+2↑H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。2KMn4＋522＋3SO4 O4O22求出反应前后H2O2的浓度差并计算出反应速度。用Hanes作图法求出过氧化氢酶的米氏常数。Hanes作图法：将米氏方程式变换为[S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax形式，计算出相关数值后，以[S]/V为纵坐标，[S]为横坐标作图，直线在横轴上的截矩即为－Km。【试剂】1．0.05mol/L草酸钠标准液将草酸钠（AR）100～10512h0.67g100mlH2SO45ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。2．约0.02mol/LKMnO4储存液称取KMnO43.4g，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。mol/L0.05mol/L20H2SO41ml70KMnO4贮存液滴定至微红色，根据KMnO40.004mol/L须重新标定储存液。40.08mol/L20%0.004mol/L出准确浓度后，稀释至所需浓度。．0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0.2mol/LN2HPO4610ml，0.2mol/LNaH2PO4390pH7.00.2mol/L1000ml.6．25%H2SO4溶液（或肝素抗凝0.110ml，混匀。取此稀释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至10ml，得1:1000稀释血液。【操作步骤】取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。加入物(ml)H2O2(0.08蒸馏水

10.503.0

21.002.50

31.502.00

42.001.50

52.501.00室温下摇匀，每瓶依次加入1:1000稀释血液0.5ml，边加边摇，37℃保温525%H2SO42.00.004mol/L滴定各瓶至微红色KMnO4消耗量(ml)。[注意事项]硫酸的浓度较大，小心不要溅出。作图应该用坐标纸，标明有关参数。滴定操作：使用滴定管前要先检查滴定管是否漏水或有堵塞。滴定管使用前要润洗（KMnO424ml处。使用时，不能左右推动活塞（控制流量。0，尔后排除尖端气体。读数时，视线要与弯月面平行。实验三 凝胶过滤法分离蛋白质【原理】物。目前主要有葡聚糖凝胶（Sephadex，天然琼脂糖凝胶（商品名Sepharos、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Ge，其后还发展了凝胶的各种衍生物，如羧甲基交联葡聚糖（CM-Sephadex，二乙基氨乙基交联葡聚糖（DEAE-Sephadex）等种类。凝胶过滤就是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种色谱技术，当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛作用，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用，本实验高铁血红蛋白分子量大，不易渗入网络，被排阻在凝胶颗粒之外，因而所受到阻滞作用小，先流出色谱床。高铁氰化钾(K3Fe(CN)6分子量小，能渗透到网络的内部，洗脱流程长，因此所受到的阻滞作用大，后流出色谱床，这样就可以达到分级分离的目的。在含有血红蛋白(Mw＝64500)加入过量的高铁氰化钾(K3Fe(CN)6，Mw＝327.25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白 (methemoglobin，MetHb)。为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快而小分子高铁氰化（黄色洗脱较慢达到将MetHb完全分离出来的目的。【试剂】抗凝全血四氯化碳(CCl4)生理盐水G-25(细粒)5．0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)6．0.4%K3Fe(CN)6【操作步骤】5g60ml310倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡。装柱取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支，垂直装好。加入缓冲液，打开2cm左右高，G-25G-255cm3ml5～10min后，打开出口，用2样品处理3ml53000r/min5min，弃去上清液，重复3次。最后一次吸去上清液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再1/2CCl4000r/min5minHb10%(4℃暂存，一周用完)。样品血红蛋白液3K3Fe(CN)682滴混合，制成MetHb混合样品。上样、洗脱打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口。吸取混合样品0.5ml左右，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加入，切勿搅动床面。然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小，而样品又完全进入床内)切勿搅动床面凝胶，然后人工添加洗脱液(保持液面距柱床面距离不少于2cm)进行洗脱。分部收集用小试管，以5滴/min，10滴/管的速度进行收集。并且观K3Fe(CN)6色带完全洗脱下来后(6~7管关闭出口。测定 将每管收集液加入蒸馏水2ml，混匀，在425nm处测其吸光度以吸光度为纵坐标，管数为横坐标，绘出洗脱图谱。1～22cm高磷酸缓冲液浸泡。【注意事项】装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。样品上柱后应在凝胶柱表面形成一层薄液层。4．收集要及时，不能等红褐色物质流出之后再收集。尽量保持各管收集的液量一致。洗脱过程中要防止凝胶柱洗脱液流干。洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃。实验四 PCR扩增DNA【原理】PCRDNA增技术。PCR技术实际上是在模板DNA4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)DNA聚合酶的酶促合成反应。PCRDNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法，该技术可用于：①与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNAcDNADNA为模板获得已知目的cDNA文库或基因组文库中获得具有一定序列相cDNA文库或基因组文库中克隆基因。基因的体外突变PCR技术建立以前，在体外对基因进行各种突变是一费时费力的工作。PCR点突变等改造。PCRDNADNAcDNA）微量分析的最好方法。理论上讲，只要存在一分子的模板，就可以获得目的片段。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。PCRDNA3步：①变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系DNADNDNA双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA4dNTPMg2+DNA链延伸3DNA21067拷贝。蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白(αα')和两个调节亚基(β)RT-PCRCK2βcDNApT7-7CK2β亚基cDNA3087bppTCKBDNA的扩增模板，加入人蛋白CK2βcDNA4dNTPTaqDNA聚合PCR扩增。理论上扩增的PCR672bp。【试剂与器材】上游引物:5'AATCTAGACATATGAGCAGCTCAGAGGAGGT' 其序CK2βcDNA205'NdeI酶切位点。浓度为5pmol/μl5μmol/L，25μl12.5pmol。2．下游引物:5'AAGGATCCAAGCTTCAGCGAATCGTCTTGACTGGCK2β亚基cDNA215'5pmol/μl5μmol/L，25μl12.5pmol。CK2βcDNA质粒1ng/μl，25μl5ng。4．10×buffer浓度（购买Taq酶有配套的Buffer）:500mmol/LKCl，100mmol/LTriton-X5．10×MgCl2 25mmol/L。dNTP2.5mmol/L 10mol/LdCTP四种混合即成TaqDNA聚合酶（国产或进口5l，50μl1U,0.5U/μl8．消毒三蒸水9．6×载样缓冲液 0.25%二甲苯青FF，0.25%溴酚蓝，30%甘油。SYBR®GreenI荧光染料为避免溴化乙锭的污染，本实验指导中所有涉及DNASYBR®GreenI荧光染料（参看后面所附的知识介绍EBSYBR®GreenIDMSO10000DMSO5060μl1ml6×5μlDNA1μlSYBR®GreenI荧光染料的载样缓冲液，电泳后可直接于紫外分析仪上观察结果，激发光最好用254nm紫外光以获得最高灵敏度。上述SYBR®GreenI10000倍浓DMSO50倍的稀释液须避光保存于-20℃，含SYBR®GreenI荧6×4℃。SYBR®GreenI6×配制方法见上，也可参考实验十一。12．50×TAE电泳Buffer 12.2gTris，2.85ml冰醋酸，10ml0.25加水至50ml。13．DNAMarker14．各种国产或进口移液器150.2mlPCR管，10μl，100μltips16．小型离心机PCR仪水平电泳槽和电泳仪紫外分析仪【操作步骤】PCR0.2mlPCR管，按下表操作（PCR2个人做一管：试剂消毒三蒸水10×buffer加入量7μl2.5μl最终浓度(或含量)1×buffer10×MgCl22.5μl2.5mmol/LdNTP2μl各0.2mmol/L上游引物2.5μl（5μmol/L）12.5pmol下游引物2.5μl（5μmol/L）12.5pmolDNA模板(pTCKB)5μl(1ng/μl)5ngTaqDNA聚合酶1μl(0.5U/μl)0.5U总体积 25μlPCRPCR反应。PCRPCR30s94℃，5min72℃，10min。【琼脂糖凝胶电泳】制备琼脂糖凝胶称取1g1×TAEBuffer100ml1%琼脂糖凝胶。灌胶取洁净的电泳内槽(又称托盘)，用透明胶带将内槽的两端边缘封好(定要封严，不能留缝隙)。将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。602μl入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。1×TAE缓冲液至电泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。加样取6×5μlEP10μl上样。另外，每排孔需加一份DNAMake做对照（DNAMaker3μl1μl混匀,将其加入凝胶的点样孔即可。电泳接通电源槽与电泳仪的电源(正极移动)100V2/3段凝胶，停止电泳。PCR3.5英寸磁盘,便于在电脑下观察。[注意事项]EP管。PCRDNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样DNATaqDNA聚合酶。加样过程中所有试剂用完后均应置于冰上。PCRPCRPCR反应。附：SYBR®GreenI核酸荧光染料介绍SYBRGreenI烯酰胺凝胶中的核酸。根据AmesSYBRGreenI没有溴乙啶（ethidiumDNA有较强的亲和力，当其结合到DNA上时，会产生很强的荧光及高量子产额，DNA/SYBR®GreenⅠ复合物的量子产额约为EB10倍。由于与核酸结合后能产生很强的信号，背景极低，并且对核酸的亲和力很SYBR染料可在低浓度条件下使用。如果用300nmSYBRGreenIshDNA的最低检测量为或6×10-11254nm光源从上往下照射，最低可以检测到20pg的dsDNA。SYBRGreen大约比EB灵敏25到100倍。如果用300nm的透视法照射，检测寡核苷酸的极限12pg。SYBRGreenI的高灵敏度特性使其在检测微量DNADNA（PCR）SYBR的高灵敏度特性使其可以在某些时候甚至可以取代放射性同位素和银染染料。SYBR®GreenDNASYBR®GreenDNADNA转移至膜上，进DNA的结合对多种常用的限制性内切酶活性无抑制作用，可直接进行消化或连接。SYBR®GreenDNA检测（即实时PCRSYBR®GreeDMSO10,000、TETBE缓冲液，或直接加于上样缓冲液中。10,000DMSO10100倍后，再加于各种水溶液中。SYBR®Green-204存于密封聚丙烯容器。20pgdsDNA，灵敏度比EB25到100倍。高亮度：在较暗的背景下发出亮绿色的荧光，比EB10使用简单：不需要清洗。价格便宜：比银染更便宜。不比EB贵。实验五分子诊断学实验基本操作及样品蛋白定量第一部分：分子诊断学实验基本操作（教师示教，学生练习操作）一、垂直板电泳装置二、电转移三、超净台无菌操作第二部分：样品蛋白定量（Bradford法定量蛋白质）原理考马斯亮蓝G-250465～595nm最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比，检测595nm吸收值可计算蛋白的含量。Bradford法操作方法空白管标准管样品管生理盐水0.1ml--1.0mg/ml标准蛋白质溶液-空白管标准管样品管生理盐水0.1ml--1.0mg/ml标准蛋白质溶液-0.1ml-样品液--0.1ml考马斯亮兰G-250试剂5.0ml5.0ml5.0ml每加完一管，立即在旋涡混合器上混合。加完试剂2~5分钟后，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A59595%色。样品蛋白质含量样品管吸光度值/标准管吸光度值51.0（mg/ml。注意事项样品制备过程应注意保持低温。离心时对称放置，集体离心，离心机由带教老师操作。因考马斯亮蓝G-250染色能力强,易地将比色杯清洗干净。实验六SDS器材垂直板电泳装置试剂SDS加样缓冲液30％凝胶贮备液(3)10％(W/V)SDSTEMED10％(W/V)过硫酸胺溶液Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3)分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液考马斯亮蓝R-250R-250450ml，100ml过滤，常温保存；洗脱液：甲醇45ml，冰醋酸10ml45ml操作方法 说明安装好。按表1、表2选择及配制PAGE分离胶，厚度为1mm。表1 蛋白质在聚丙烯酰胺胶的有效分离范围凝胶浓度％15107.55.0Bis：Acr的分子比为1：29

分离范围12～4316～6839～9457～212表2 配制Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝放电泳分离胶所用溶液溶液成份6％

5ml

不同体积凝胶液中各成分所需体积10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50mlH2O2.65.37.910.613.215.921.226.530％丙烯酰胺溶液1.02.03.04.05.06.08.010.01.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸胺溶液0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.048%H2O2.34.66.99.311.513.918.523.230％丙烯酰胺溶液1.32.74.05.36.78.010.713.31.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸胺溶液0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.0310%H2O1.94.05.97.99.911.915.919.830％丙烯酰胺溶液1.73.35.06.78.310.013.316.71.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸胺溶液0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02层加入几毫升蒸馏水，以阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用。纸吸干凝胶顶端残存的液体。按表3配制浓缩胶，并注入分离胶上端，插入梳子应小心避免气泡。表3 配制Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳5％浓缩胶所用溶溶液成份1ml2ml溶液成份1ml2ml3ml4ml5ml6ml8ml10ml0.681.42.12.73.44.15.56.830%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.831.01.31.71.0mol/LTris(pH6.8)0.130.250.380.50.630.751.01.2510%SDS0.010.020.030.040.050.060.080.110%过硫酸胺溶液0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01静置待胶凝。取0.1ml样品液，加入0.1ml样品缓冲液混合，沸水加热3分钟,1000转/心3分钟，准备上样。电极缓冲液，检查是否泄漏。驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔。20l样品和标准物最好将1×样品缓冲液加入未使用梳子孔中。电泳:开始时电压为50V，染料进入分离胶后，将电压增加到100V泳到染料抵达分离胶底部，断开电源。好无损。注意事项Acr和Bis单体溶液及过硫酸铵为有毒成份（勿入口）。配好胶后应尽快灌胶，及时清洗仪器。灌分离胶时要注意防止胶液渗漏.灌胶时要注意排除气泡。加水隔氧时动作轻柔，小心勿冲击到液面.器材

实验七电转移电转移装置、Whatman3mm滤纸、硝酸纤维素膜(NC膜)试剂转移缓冲液0.1％丽春红染液操作方法戴手套剪6块3mm滤纸和一块NC膜，其大小与SDS大小相同。将剪好的上述物品在转移缓冲液中浸泡3～5分钟。按下列过程安装转移装置：①将塑料支架平放在含有转移缓冲液的托盘中，3抉3mm滤纸对齐放在海绵上，依次放置纤维3块3mm滤纸及海绵。在放置每一层时，均要去除它们之间放入电转移槽内，注意纤维素膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。接通电源，电压40V电流0.17～0.2A，低温下转移1.5～6小时，转移时间可根转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层，用铅笔或剪刀在NC膜的上缘作好标记，将NC膜放入盛有丽春红的培养皿中,再经洗脱液脱色,果。凝胶放入氨基黑染液中染色0.5分钟,再经洗脱液脱色,观察转移结果。(注意电泳缓冲液、转移缓冲液、丽春红染色液氨基黑染色液要回收)注意事项3mm滤纸及NC泌物会影响转移效果。安装转移装置时，避免滤纸或膜比凝胶大，形成短路，影响转移效果。22/45PAGEPAGE43/45实验八 质粒DNA的转化【原理】质粒是存在于细菌染色体以外的小型环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。质粒可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2~300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。质粒（autonomousreplicoDNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制control）1个到十几个拷贝；另一类是松弛控制（relaxedcontrol）DNAori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。质粒对宿主生存并不是必需的。DNA1943DNA与无毒肺炎双球菌共培养后产生有毒性的肺DNA进入细胞的效率很低，在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNADNA接触，就能提高转化效率。DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种-切酶和甲基化酶（R-，M-。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处DNA分子进入的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（DNA分子的细胞。本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-4290s热激处理，促进细胞吸收DNAAmp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。CaCl2CaCl2与质粒DNA形成羟基DNA免受细胞DNACaCl2溶液可使大肠杆菌膨胀成球状，细胞膜间隙增加，易于接受外源性2+带正电荷可消除质粒带负电荷与细胞膜（含磷酸基团带负电荷）之间的静电排斥作用。Bcl-2DH5αAmp基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。Bcl-2DH5αDNADNA。【试剂与器材】LB10g5g10gNaCl加蒸500ml5mol/LNaOHpH7.41L瓶（1/3）103.4Kpa20min。LBLB液体培养基（液体约占瓶体1/31.5不烫手背时（50℃，平铺于灭菌处理的培养皿。3．0.1mol/LCaCl2溶液称取11.1g无水氯化钙，加超纯水溶解，倒入容量瓶定容至1L。随后分装于三角锥形瓶中，用棉塞或锡纸封好瓶口，高压灭菌消毒；或者直接过滤除菌。4．100mg/ml1g的氨苄青霉素瓶中直接用注2ml无菌水或生理盐水，溶解氨苄青霉素白色粉剂，吸取全部溶液于10ml1.5ml-20使用时需化冻。Bcl-2Bcl-2EcoRpBluescriptⅡKS(-)EcoRBcl-2cDNA重组而成的，大小为4861bp，前pUC192961bpEcoRⅠpBluescriptⅡKS(-)载体(2.96kb)Bcl-2cDNA片段(1.9kb)2ng/μl。大肠杆菌DH5α 此为DNA扩增菌恒温水浴箱，超净工作台，高速冷冻离心机，恒温摇床，恒温培养箱消毒离心管，消毒tips，玻璃培养皿直径9021个，玻璃涂布器（1个，标记笔9．75%乙醇和燃烧酒精10．细菌感受态细胞的制备（）DH5αLB在恒温培养箱里培养过夜或时长12~16h。5ml不含氨苄青霉素的LB100~200r/min12~16h苏。1ml100mlLB培养基（1:100）的三角锥形瓶（1/3口用灭菌处理过的棉塞或锡纸封好）中，37200~300r/min2～3A6000.25~0.3（A6002~3A6000.25-0.4小时以上15min。50ml离心机，4000×g，410min液体流尽。加预冷的已过滤除菌(过滤膜微孔直径为22μm)或高压灭菌的0.1mol/LCaCl2溶液（用无水氯化钙和超纯水配制）中用移液枪轻轻吹打，重悬菌体，置冰浴30min。使用冷冻高速离心机，4000×g，4℃离心10min，弃培养基。4ml0.1mol/L溶液，轻轻重悬菌体，置4h【操作步骤】30min30min4290s2min。加入不含氨苄青霉素的LB液体培养基200μl200μl37℃、100~150r/min15min，使细菌复苏并表达抗性基因。200μl加至含氨苄青霉素（Amp）LB琼脂平板上（平板侧面用标记笔写好班级，姓名，日期，实验组或对照组，用玻璃涂布器涂布均3712～16h无菌条件下分别加入：实验组阴性对照组新鲜感受态DH5α细菌50μl50μl人Bcl-2重组质粒2ng/μl5μl——灭菌水——5μl【注意事项】摇或吹打。10倍。44～6倍。感受态细胞热休克时间要准确，中途不要摇动离心管。细菌铺板密度过高或培养时间过长，会使一些未转化（不含Amp抗性）的细100μg/ml彻底根治。2次。稍冷后，再涂此步实验切记用火安全！特别是在超净台上使用时，更应注意，可安排每个实验台由一人专门负责安全。生长有菌落的平板密封倒置存放于4℃（可放在4℃冷柜中）DNA的制备。实验九 质粒DNA的制备DNA的方法众多，其分离的依据可根据分子DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点进行。目前常用的有碱裂解法(又称碱变性抽提法)、羟基磷灰石柱层析法、质DNA释放法、酸酚法、两相法以及溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法。以上方法各有利弊。但总结多数实验室的实践经验，认为碱裂解法效果良好，经济DNA的方法，也是当今分子生物DNAPCR【原理】细菌在碱液(pH12.6)中裂解，NaOHDNA变DNA相互交联缠绕形成网状结构。但质粒DNADNA易与变性蛋白质缠绕。pH4.8KAcpHDNASDSSDS-DNASDS了溶解度低的十二烷基硫酸钾(PDS)DNAPDS-DNA留在上清中，再经酚/DNA。碱裂解法中一些试剂的生化原理：,维持渗透压,DNAMg2+,Ca2+,DNase;有利于溶菌酶作用(环境)。③溶菌酶：溶菌,pH＜8.0该酶受抑制（从大肠杆菌中提取质粒可以不加溶菌酶。溶液Ⅱ：①NaOHpH5～9稳定,pH＞12或＜3则变性,IIpH12.6SDS-溶液Ⅲ：KAc-HAc缓冲液(pH4.8)pH12.6pH至中性,使变性DNA复性,并稳定存在,SDS中的钠后形成了水不溶的十二烷基硫酸钾(PDS)KAcPDS-蛋白质复合物中的染色体DNADNA与蛋白质复合物一起沉淀下来而被除去。DNA3DNADNA或多处断裂；③复制中间体，即没有复制完全的两个质粒连在了一起。在电泳DNA3种形式泳动速度：超螺旋＞开环＞复制中间体。【试剂】菌种含pBR322DNA的大肠杆菌工程菌如HB10，JM109DNEcoRDNA转化的大肠杆菌，如本实验Bcl-2DH5α。LB10g5g10gNaCl500ml5mol/LNaOHpH7.41L瓶（1/3）103.4Kpa20min。3．10mg/ml氨苄青霉素(Amp)溶液在规格为1g的氨苄青霉素瓶中直接2ml100ml5ml的离心管中，封口纸封口，置-20℃保存，使用时需化冻。AmpLB100mlLB培养液在临高压灭菌前加入1.5g103.4KPa20min养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基50℃(用手背碰一下Amp100ml10mg/mlAmp1100μg/ml，然后在超净台上铺平板，90mm直径的培养皿约需25ml培养基。Tris-HCl饱和酚(pH8.0) 将市售的苯酚置于65℃水浴中溶解，用空气冷凝管进行重蒸馏，当温度升高至183℃时开始收集于数个棕色瓶中(每瓶约200贮存于－20℃可保存数年使用前取一瓶重蒸酚于室温放置一段时间后，移至65℃水浴融化(冰箱取出后勿立即放入65℃水浴中，以防玻璃炸)。融化后加8-羟基喹啉至终浓度为溶解混匀此时溶液呈黄色小心将酚倒入分液漏斗中。加入等体积的1mmol/L立即加盖，剧烈振荡并加入固体Tris摇匀(一般加1g固体Tris/100ml酚)静置分层后从分液漏斗中放出下层黄色酚相，弃上层。将酚重新加至分液漏斗中，加入等体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/L剧烈振荡直至酚相将酚装入棕色试剂瓶中，加入0.1倍酚体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)覆盖酚相，置4℃贮存备用。由于酚重蒸和平衡费时，操作有一定危险，因此也可直接从试剂公司购买Tris-HClTris-HCl6．溶液Ⅰ①0.1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)母液Tris1.211mol/LHClpHml0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)母液；②0.05mol/L的EDTA-Na2母液1.86g，加蒸馏水溶解，定容至100mlmol/L母液。Tris-HCl(pH8.0)50ml，EDTA-Na240ml1.98g6126.200ml50mmol/L葡萄糖，10mmol/mmol/LTris-HCl2mg/ml20min，4℃保存。溶液Ⅱ①10mol/L氢氧化钠溶液称取40g氢氧化钠，加蒸馏水溶解，定容至100ml；②400mol/L氢氧化钠溶液量取10mol/L氢氧化钠溶液4ml，加蒸馏水定容至100ml；③20g/LSDS溶液称取2gSDS，加蒸馏水溶解，定容至100ml；400mol/L20g/LSDS200mmol/Lg/L℃保存。溶液Ⅲ①5mol/L醋酸钾溶液称取49g醋酸钾，加蒸馏水溶解，定容至100ml；5mol/L60ml(29.4g60ml)，冰醋酸11.5ml和双蒸水28.5ml，混匀，即可得溶液Ⅲ，5mol/L醋酸钾℃保存9．10 mg/ml RNase A 称取RNase A 10 mg 溶于10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl10015minDNase，℃。如为Sigma需加热煮沸。TE缓冲液(pH8.0)①1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液6.05g1mol/LHClpHml。②0.05mol/LEDTA-Na2(pH8.0)溶液1.86g5mol/LNaOHpH100ml。量取1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液2ml，0.05mmol/LEDTA-Na2(pH8.0)溶液4ml，加蒸馏水定容至200ml，使得样品终浓度Tris-HCl(pH8.0)溶液为101mmol/L,103.4Kpa12020高压蒸汽灭菌后，4℃保存。其他试剂氯仿、异丙醇、无水乙醇。【操作步骤】2mlLB(100μg/ml的试管中，37℃摇荡培养过夜。1ml1.5mlEP000r/min2100μl5min。100μl5次，溶液变透明，粘稠。100μl，颠倒混匀，溶液出现白色沉淀。6．12000r/min2minEP管中。21010minDNA12000r/min5min，弃乙醇。70乙醇洗涤沉淀（5次，小心不让沉淀脱落，120005min，弃乙醇，室温下静置使乙醇挥发或真空干燥。50μl含RNaseA的TE缓冲液溶解DNA20min20℃冰箱。【注意事项】21天晚上进行单菌落液体培养min(用移液嘴沾吸没有丝状物出现)是否正确。溶液Ⅰ中的溶菌酶宜临用前加入。溶液Ⅱ也应临用前用母液配制。1~3注意分清哪一步弃上清，哪一步留上清。DNA不被限制性内切酶切割。加入溶液Ⅰ时可用力振荡，而加入溶液Ⅱ5min后，如溶液不变粘稠(移液嘴沾吸没有丝状物出现)，则应终止实验。检查使用的试剂是否正确，加量是否正确。溶液Ⅰ和溶液Ⅲ要冰预冷，溶液Ⅱ要新鲜配制。加入溶液Ⅱ时禁止涡旋振荡（DNA断裂10minDNA。实验十 DNA的限制性内切酶酶切分析【原理】限制性内切酶(restrictionendonuclease，RE)是由细菌自己产生的能识别双DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核REDNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。它是基因工程中剪切DNARE酶切位点的改变，故当用一定RE切割时，其切开的片段(分子量)DNA限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的。EcoRⅠ(λDNARE21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp3530bp片段。本实验是将实验十一制备的人Bcl-2重组质粒DNA作为EcoRBcl-2EcoRpBluescriptⅡKS(-)EcoRⅠ单酶切Bcl-2cDNA4pUC19质粒衍生2961bppBluescriptⅡKS(-)载体(2.96kb)Bcl-2cDNA(1.9kb)＋pBS-Bcl-2(4.86kb)

pBS(2.96kb) Bcl-2(1.9kb)EcoEcoRⅠ酶Bcl-2重组质粒的酶切模式图【试剂】DNA底物λDNADNAEcoRBcl-2DNA。EcoRⅠ及其缓冲液只需购买国内试剂公司的产品即可RE2RE100%酶切活性。3．50×TAE电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L(pH8.0)20ml100ml1×TAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。SYBR®GreenI荧光染料工作液的配制10000×SYBR®Green I 荧光染料原液，用TE 溶液稀释成20×或30×SYBR®GreenI荧光染料工作液。详见实验八。SYBR®GreenI6×loadingdyebuffer的配制20×30×SYBR®GreenI10ul6×loadingbuffer10uSYBGreenIdyebuffer20ul。详见实验九。DNA0.5μg/μl。【操作步骤】11μ(10×buffer2μ20EcoRⅠ2μl，λDNA(2μg)DNA(2μg)DNA5μl(2μg)，加至200ulEP20μl，加盖，混匀后稍离心，371h制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA含量，见表。表琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系凝胶中的琼脂糖含量[%(w/v)] 线性DNA分子的有效分离范围0.3 5～600.6 1～200.7 0.8～100.9 0.5～71.2 0.4～61.5 0.2～32.0 0.1～20.48g1×TAE60ml至完全熔化，取出摇匀。灌胶取洁净的电泳内槽(又称托盘)，用透明胶带将内槽的两端边缘封好(定要封严，不能留缝隙)。将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。60内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。加入1×TAE缓冲液至电泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。4．加样取6×3μlEP15μl样。另外，每排孔需加一份DNAMake做对照（DNAMaker3μl1μl混匀,将其加入凝胶的点样孔即可。电泳接通电源槽与电泳仪的电源(片段是从负极向正极移动)。DNA5V/cm1～2cm处，切断电源，停止电泳。存在处应DNA带的泳动位置。3.5英寸磁盘,便于在电脑下观察。【注意事项】本实验可先进行酶切反应，酶切过程等时间的间隙灌好琼脂糖凝胶。DNA酶切时，要在其最适温度下(37℃)进行。最好是用2种酶酶切应先用低盐缓TE400μl，再进行酚乙醇沉淀，重新建立第二个酶切反应体系。RE一定要在低温(－20℃)50%20℃，应避免结冰。新购的大包装酶，RE管放在冰盒内，用完后立即放在－20℃，每tip，避免污染。RE1URE37℃条件下作用DNA1h1μgDNA2～3DNA尤其如此。DNADNADNADNA实验十一 RT-PCR法钓取小鼠肝脏β-actin基因一、TRizol试剂提取小鼠肝脏总RNA【原理】TrizolRNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能在迅速RNA的完整性。Trizol既用于小量样品50-100mg5106细胞，也可用于大量样品1g组织/≥107细胞。可同时