DNA重组技术的基本工具

会计学1DNA重组技术的基本工具你还记得我们吗？氢键磷酸二酯键DNA聚合酶第1页/共47页第2页/共47页别名：操作环境：原理：操作水平：结果：

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因重组DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。基因工程的概念：第3页/共47页基因工程的产物第4页/共47页普通棉花抗虫棉第5页/共47页基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫基因)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)转基因棉花植株第6页/共47页

1.1、DNA重组技术的基本工具“分子手术刀”--“分子缝合针”--“分子运输车”--限制性核酸内切酶DNA连接酶运载体第7页/共47页1、简称：

2、分布：

一、限制性核酸内切酶

——“分子手术刀”主要在原核生物中限制酶寻根问底(P4)你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？第8页/共47页

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。限制酶在原核生物中的作用第9页/共47页

3、特点:

一、限制性核酸内切酶

——“分子手术刀”识别特定核苷酸列,特定位点切割（专一性）断裂：磷酸二酯键第10页/共47页第11页/共47页限制酶的识别特点以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列

如：GAA

TTCCCCGGG

CTT

AAGGGGCCC第12页/共47页第13页/共47页

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback中心轴线两侧切开第14页/共47页什么叫黏性末端？

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。第15页/共47页SmaⅠ平末端平末端中心轴线处切开第16页/共47页

④作用：

⑤结果：一、限制性核酸内切酶

——“分子手术刀”切割DNA产生黏性未端和平末端第17页/共47页

3、特点:

4、作用：

5、结果：1、简称：2、分布：工具1：限制性核酸内切酶

主要在原核生物中限制酶识别特定核苷酸列,切割特定切点（专一性）切割DNA产生黏性未端或平末端小结第18页/共47页要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？

会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。思考?第19页/共47页Goback……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切第20页/共47页思考与探究P72、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？

通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。第21页/共47页1、作用:

把DNA片段拼接成新的DNA，2、作用原理：催化磷酸二酯键形成,不是氢键二、DNA连接酶

——“分子缝合针”第22页/共47页

可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键第23页/共47页

T4DNA连接酶第24页/共47页3、类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端第25页/共47页DNA聚合酶DNA连接酶用途寻根问底

(P6)DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键作用对象DNA复制基因重租4、

DNA连接酶与DNA聚合酶比较第26页/共47页3、类型①E·coli

DNA连接酶

来源：大肠杆菌作用特点：只连接黏性末端

②T4DNA连接酶

来源：T4噬菌体作用特点：连接黏性末端和平末端

2、作用原理：催化磷酸二酯键形成1、作用:：工具2：DNA连接酶

把DNA片段拼接成新的DNA，4、

DNA连接酶与DNA聚合酶比较小结第27页/共47页P7.思考与讨论：限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段:你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？…CTGCA

…G

①…AC…TG②

CG…GC…③…G

…CTTAA

④G…

ACGTC…

⑤…GC…CG⑥GT…

CA…

⑦AATTC…G…⑧②和⑦能连接形成…AC…TGGT…

CA…

④和⑧能连接形成…G

…CTTAA

AATTC…G…

CG…GC…

…GC…CG

③和⑥能连接形成①和⑤能连接形成…CTGCA

…G

G…

ACGTC…

反向对称第28页/共47页4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？

迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。思考与探究P7第29页/共47页

1、载体必须具备的条件：①能够在宿主细胞中复制或整合到受体细胞的染色体DNA上复制②具有一至多个限制酶切点，以便与外源基因连接③具有某些标记基因，便于进行筛选。④对受体细胞无害

三、基因进入受体细胞的载体

——“分子运输车”第30页/共47页2、常用的载体：

质粒（最常用)

λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等第31页/共47页能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因3、质粒本质：小型环状DNA分子。分布：许多细菌第32页/共47页工具3：运载体1、需要的条件：

⑴有1~多个限制酶切点

⑵能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的染色体DNA上复制

⑶有某些标记基因，便于筛选

⑷对受体细胞无害2、常用运载体：质粒、λ噬菌体的衍生物或某些动植物病毒3、质粒

小结第33页/共47页3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？

不可以，作为基因工程使用的载体必需满足一定条件,且都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。思考与探究P7第34页/共47页1、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶反馈练习：第35页/共47页2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是

A、能复制（）

B、有多个限制酶切点

C、具有标记基因

D、它是环状DNAD第36页/共47页3、下列不适合用于基因工程的运载体是（）

A、质粒B、噬菌体

C、细菌D、病毒选我C4、下列说法正确的是：（）

A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列

B、质粒是基因工程中唯一的运载体

C、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体

D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”选我D审题第37页/共47页5、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：①GC…②AATTC…③…GC④…CTTAACG…G…

…CG…G

(1)其中①和

是由一种限制酶切割形成的

末端，两者要重组成一个DNA分子，所用DNA连接酶通常是

。（2）

和

是由另一种限制酶切割形成的

末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常是

。反馈练习：第38页/共47页再见第39页/共47页1.1944年艾弗里(O.Avery)等进行了肺炎双球菌体外转化实验,证明了DNA是生物的遗传物质,并且证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,成为基因工程的先导基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路20世纪中叶，基础理论取得了重大突破第40页/共47页2.1953年沃森和克里克建立了双螺旋结构模型,使生物学进入分子水平。1958年梅塞尔松和斯塔尔,以大肠杆菌为实验材料,运用同位素示踪技术,用实验证明了DNA的复制是以半保留方式进行的.1957年克里克提出中心法则的确立第41页/共47页3.1963年尼伦伯格和马太做蛋白质体外合成实验,破译编码氨基酸的遗传密码.第42页/共47页1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明技术发明命使基因工程的实施成为可能1967年罗思和赫林斯基发现细菌质粒有自我复制能力,为基因转移找到一种运载工具.1970年阿尔伯(W.Arber)、内森斯(D,Nathans)、史密斯(H.C.Smith)