第十章 基因定位和基因克隆

医学遗传学第十章基因定位与基因克隆本章节重点基因定位和基因克隆的概念连锁分析遗传标记基因定位的策略基因定位(genemapping)：利用一定的方法将一个基因确定到染色体上的实际位置上。1911年，Wilson将红绿色盲基因定位到X染色体1968年，Duffy血型基因定位于1号染色体基因定位(genemapping)：利用一定的方法将一个基因确定到染色体上的实际位置上。基因克隆(genecloning)：用一定的方法把不同位点上的基因分离出来。连锁分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。第一节连锁分析在基因定位中的作用连锁分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。第一节连锁分析在基因定位中的作用连锁分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。第一节连锁分析在基因定位中的作用连锁分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。第一节连锁分析在基因定位中的作用重组值(recombinationfraction)：是基因定位时两个基因间遗传图距的量度，即基因间的遗传距离。

如果两个基因之间有1％的重组值，其遗传图的距离就是1厘摩(centimorgan，cM)。第一节连锁分析在基因定位中的作用遗传标记(geneticmarker)：基因定位是确定某一基因在染色体上的未知位置，用连锁分析法进行基因定位需要一些遗传位点，这些位点应按孟德尔方式遗传，且具有多态性以显示其连锁关系，这些标记位点称为遗传标记。连锁分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。第一节连锁分析在基因定位中的作用EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ3.0Kb1.7Kb探针第一节连锁分析在基因定位中的作用神经纤维瘤，NF1RFLP标记ⅠⅡⅢ1212345678123456783.0Kb1.7Kb4.7Kb第一节连锁分析在基因定位中的作用神经纤维瘤，NF1RFLP标记ⅠⅡⅢ1212345678123456784.7Kb3.0Kb第一节连锁分析在基因定位中的作用神经纤维瘤，NF1RFLP标记ⅠⅡⅢ121234567812345678Lod法Lod(logarithmoftheodds)，是Morton在1955年提出的优势对数法。Lod分值为＋3，连锁:不连锁＝1000:1，表示连锁存在第一节连锁分析在基因定位中的作用Lod分值为－2，不连锁:连锁＝100:1，表示连锁不存在第一节连锁分析在基因定位中的作用多点连锁定位(multipointlinkagemapping)利用三点交叉法(threepointcrosses)，可将某一致病基因定位于遗传标记的框架内，更精确的进行基因定位。第一节连锁分析在基因定位中的作用多点连锁定位(multipointlinkagemapping)子代类型重组位置数目ABC/abc非重组体853abc/abcABc/abc(A，B)-X-C5abC/abcaBC/abcA–X–(B，C)47Abc/abcAbC/abcB–X–(A，C)95aBc/abc第二节体细胞杂交与基因定位体细胞杂交(somaticcellhybridization)：又称细胞融合(cellfusion)，是将两个同种和/或不同种的细胞融合成一个新细胞，即杂种细胞(hybridcell)。病毒诱导的细胞融合——仙台病毒化学融合技术——聚乙二醇(PEG)电融合技术——电穿孔法细胞融合第二节体细胞杂交与基因定位细胞融合第二节体细胞杂交与基因定位异核细胞合核细胞第二节体细胞杂交与基因定位细胞融合两个同种的动物细胞融合后形成的杂种细胞，细胞核一般保留双亲的染色体；不同种动物的细胞融合后，细胞核含有双亲的的染色体，但随着增殖传代的过程，会出现保留一方染色体，另一方染色体逐渐丢失的现象。第二节体细胞杂交与基因定位第二节体细胞杂交与基因定位HAT选择系统

1962年，利用缺乏HPRT酶为遗传标记的人突变细胞株发展起来的HPRT系统；1964年，加入缺乏TK(胸苷激酶)的小鼠细胞株TK－系统，结合发展为HAT系统。第二节体细胞杂交与基因定位HAT选择系统

H：次黄嘌呤(Hypoxanthine)A：氨基喋呤(Aminopterin)T：胸腺嘧啶(Thymidine)氨基喋呤阻断DNA合成；融合细胞中含有TK和HPRT，可使次黄嘌呤转变为次黄核苷酸，鸟嘌呤转变为鸟苷酸。第二节体细胞杂交与基因定位杂种细胞的选择和分离HPRT－TK－第二节体细胞杂交与基因定位TK－HPRT－第二节体细胞杂交与基因定位杂种细胞的选择和分离基因产物的检测与染色体定位TK：17号染色体第二节体细胞杂交与基因定位第二节体细胞杂交与基因定位基因产物的检测与染色体定位微细胞融合(microcellfusion)第二节体细胞杂交与基因定位染色体畸变和区域定位(regionalassignment)第三节原位杂交和荧光原位杂交原位杂交(InSiteHybridization，ISH)：利用同位素标记的DNA探针，与玻片上的中期染色体进行杂交。是一种直接进行基因定位的方法。荧光原位杂交(FISH)：用特殊的荧光素标记DNA探针，与玻片上的染色体或细胞组织标本进行杂交。第三节原位杂交和荧光原位杂交X染色体Y染色体13号染色体18号染色体21号染色体第三节原位杂交和荧光原位杂交13号染色体21号染色体第四节放射杂种放射杂种(radiationhybrid)：用含有辐射切割的人类染色体片段的细胞与啮齿类细胞融合产生的杂种克隆细胞，是体细胞杂种的另一种类型。1975年，Goss和Harris提出1990年，Cox构建单染色体杂种细胞1994年，Walter建立全基因组放射杂种第四节放射杂种第四节放射杂种•Genebridge4

radiationdose:3,000Radsnumberofhybrids:93

averagefragmentsize:~10Mb第四节放射杂种HumanWhole-GenomePanels•StanfordG3

radiationdose:10,000Rads

numberofhybrids:83averagefragmentsize:~4Mb•StanfordTNG4(TheNextGeneration)

radiationdose:50,000Radsnumberofhybrids:90averagefragmentsize:~800kb/123456789101112ABCDEFG10000100000000001000001000000000100000000000000001000000000000000000000010001000000

10000100000000001000001000000000100000000000000001000000000000000000000010001000000

第四节放射杂种第五节基因克隆一、功能克隆(functionalcloning)先研究功能，再定位克隆基因。血红蛋白病HbS——血红蛋白缺陷(1949)

——β链

谷氨酸6缬氨酸

GAG→GTG

——11p(70年代)第五节基因克隆第五节基因克隆第五节基因克隆二、定位克隆(positionalcloning)ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCG