不同碳源的生物除磷效率及合成HAs结构

不同碳源的生物除磷效率及合成PHAs结构分析摘要由于PHB的加工性能欠佳，目前对PHAs的合成研究多集中在中短链PHAs共聚共混物上。针对食品、发酵厂废水含多种可发酵基质的特征，分别采用乙酸钠、乙醇、葡萄糖、可溶性淀粉和谷氨酸钠为唯一碳源，研究了SBR反应器中生物除磷的能力及合成PHAs的特性。这5种碳源在厌氧阶段的磷释放量分别为10.12、1.63、7.88、2.44和5.00mg/L，在好氧阶段的吸磷量分别为0.64、6.37、8.10、1.21和3.05mg/L，总吸磷效率的次序为乙醇（乙酸）>葡萄糖>可溶性淀粉>谷氨酸钠。反应液碱性不断增加导致乙酸钠吸磷能力受破坏，4h好氧吸磷量仅为0.64mg/L，较多的小分子有机酸生成有利于好氧吸磷能力的提高。用GC-MS解析了这5种碳源合成PHAs的结构，分别由乙酸钠、乙醇和谷氨酸钠为唯一碳源所合成的PHAs主要为PHB，以葡萄糖和可溶性淀粉所合成PHAs主要为PHBV，分析了不同碳源合成PHAs的代谢途径，PHAs产物中琥珀酸的检出证实了三羧酸循环参与了合成代谢。在谷氨酸钠和可溶性淀粉合成产物中，混有菌体内长链烷酸和烯酸如硬脂酸、软脂酸和油酸。关键词：碳源，除磷，PHAs，结构1前言PHAs（poly-hydroxyalkanotes，聚羟基脂肪酸酯）是活性污泥中重要的碳源储存物质，由许多原核微生物在不平衡生长条件下合成，担当生物除磷过程的能量转化作用。它是一种性能良好的高分子聚合物，具有完全可生物降解性，是替代化学合成塑料消除“白色污染”的理想新型塑料，也是医疗植入用的理想可降解性高分子材料。该领域的研究涉及环境科学、生物化学、分子生物学和高分子化学多个学科。能产生PHAs的微生物种属有产碱杆菌属、假单胞菌属、甲基营养菌、固氮菌属、红螺菌属和重组大肠杆菌等[1]。在真养产碱杆菌及多数微生物中，合成PHB（poly-3-hydroxybutyrate，聚3-羟基丁酸酯）的碳源有糖类、有机酸、乙醇和二氧化碳等多种含碳化合物。PHB是PHAs中最常见且被研究最多的一种，但它的结构单一规整，结晶度高（65－80％），质脆，抗冲击强度低，熔点高（171－182℃），熔融状态下易降解为烯酸，加工温度区间窄，混合菌种或混合碳源生成的PHAs共聚共混物将会明显改善其加工性能。食品、发酵厂废水含有大量可发酵碳源，本研究以此类废水的代表性成分如葡萄糖、乙酸钠、乙醇、可溶性淀粉及谷氨酸钠为唯一碳源，探讨在厌氧/好氧释磷吸磷过程的效率，通过所合成PHAs结构分析，阐明不同碳源合成PHAs的代谢途径，为中长链PHAs的生物合成提供理论依据。2实验装置、材料及方法2.1实验装置自制SBR有机玻璃反应器，圆柱状部分直径14.5cm，高20cm，锥底部分高10cm，总有效体积3.5L。砂芯曝气头从反应器下部供气，由中控器完成厌氧/好氧、进水/排水/排泥的状态切换，装置图如图1所示。1－反应器主体2－进水阀3－出水阀4－排泥阀5－空气阀6－氮气阀7－DO仪8－pH计9－水位计10－中控器图1反应装置示意图2.2实验材料活性污泥：广州市猎德污水处理厂；废水：生活污水、人工配制废水；化学试剂：均为市售分析纯。3-羟基丁酸酯PHB标准样品：购自ICI公司。人工配制废水主要成分见表1，5种主要碳源分别按照800mg/L的浓度加入，其组成及含量见表2。表1人工配制废水成分（不含碳源）成分乙酸铵KH2PO4MgSO4·7HH2OFeSO4·7HH2O浓度（mg/L）5515.35105表25种碳源的含量成分葡萄糖乙酸钠乙醇可溶性淀粉谷氨酸钠浓度（mg/L）7501040384687823污泥驯化方法：加水，通氮气5min，厌氧2h；开始曝气，好氧4h，静置30min后排去上清液，补加生活污水，循环多个周期，定期排泥。2.3分析方法总磷（TP）：硝酸-高氯酸法消解，钼锑抗分光光度法；CODCr：重铬酸钾法；SS：重量法。[2]PHAs色谱分析样品制备：取适量污泥冻干，将定量污泥装入螺纹封口管中，加入2ml含3％（v:v）浓硫酸的甲醇及2g/L苯甲酸（作为内标），加入2ml氯仿后，盖紧盖子，100℃水浴，酯化4h冷却。加入2ml超纯水，充分混匀，离心或室温沉降30min以上，分层，取下层有机相作色谱分析[3]。仪器条件：岛津GCMS-QP2010气质联用，色谱柱型号DB-1，30m×0.25mm×0.25μm。升温程序：100℃保持2min后以10℃/min的速度升温至200℃，接着以20℃/min升温至250℃，保持1min。进样温度：260℃，GC-MS接口温度为260℃，MS质量扫描范围：20－550。3结果与讨论3.1污泥的驯化经过2个月的驯化，污泥颜色由棕黑色渐变为棕黄色，MLSS保持在3000－6000mg/L之间。污泥的沉降性能有了显著改善，SVI＝47.5ml/g，好氧曝气、静置后的上清液SS<10mg/L。3.2不同碳源的释磷吸磷能力模拟食品、发酵厂的废水，选择具代表性的乙酸钠、乙醇、葡萄糖、可溶性淀粉和谷氨酸钠（味精）为碳源，按照初始COD约为800mg/L配水，其余成分同表1，将污泥平分为5份分别接入，经过2h厌氧及4h好氧后的TP浓度变化见图2。图2不同碳源在厌氧/好氧条件下的TP浓度变化曲线将5种碳源在2h厌氧及4h好氧过程的TP浓度变化数值列于表2中。对图2及表2数据进行分析，在厌氧阶段，释磷量由大到小为乙酸钠>葡萄糖>谷氨酸钠>可溶性淀粉>乙醇；在好氧阶段，吸磷量由大到小为葡萄糖>乙醇>谷氨酸钠>可溶性淀粉>乙酸钠。葡萄糖在厌氧过程释放磷量为7.88mg/L，稍低于乙酸钠的10.12mg/L，但其好氧吸磷量却是最大为8.10mg/L。从全过程的绝对吸磷量计算，当乙醇作为碳源时，厌氧阶段释磷最少，有效吸磷量为6.00mg/L。至于乙酸钠在好氧阶段较少吸磷的原因，我们认为在配制人工废水时，采用了乙酸的钠盐来维持反应液的pH，当乙酸根作为碳源参与了微生物的代谢后，Na＋由此游离出来，反应液的pH值不断升高至9－10，而微生物吸磷的最佳pH值在5.5－6.5之间，过高的pH值使吸磷能力大大降低。当乙醇为碳源时，在厌氧条件下很难被微生物代谢，因此厌氧释磷最少，但在好氧条件下生成乙酸并随时被利用，反应液的pH比较稳定。因此，以乙醇为碳源实际上是乙酸在反应中起作用。可溶性淀粉为葡萄糖长链，其分子大小在240－3800葡萄糖单位范围，必须水解为葡萄糖后才能被微生物吸收利用。谷氨酸钠带有一个-NH2，也要先经过脱氨基才能进一步参加代谢，因此这两种物质的代谢速率比较慢。从吸磷量大小顺序分析也可得出较小的分子有利于吸磷且厌氧释磷多好氧吸磷也多的结论。在实际除磷工艺中，要根据不同来源废水的碳源性质，控制厌氧/好氧反应条件以生成尽量多的小分子有机物，力求达到较高的除磷效率。表2不同碳源在厌氧/好氧条件下的TP浓度变化单位：mg/L碳源种类乙酸钠乙醇葡萄糖可溶性淀粉谷氨酸钠初始TP5.776.776.406.456.77厌氧释磷量ΔP1110.121.637.882.445.00好氧吸磷量ΔP220.646.378.101.213.05*注：ΔP1＝第2h的瞬时总磷浓度－初始总磷浓度ΔP2＝第2h的瞬时总磷浓度－第6h的瞬时总磷浓度3.3不同碳源所合成PHAs的结构及代谢途径分析为实现污（废）水处理的资源化目标，将好氧后的富磷污泥排出，进行5种不同碳源合成PHAs的实验，并对产物进行GC-MS分析，以确定其结构。污泥的培养采用好氧6h，厌氧12h进行，PHB标准样品及5种碳源所合成PHAs的GC-MS图见图3。图3-aPHBV标准品的GC-MS图图3-b以乙酸钠为碳源所合成PHAs的GC-MS图图3-c以乙醇为碳源所合成PHAs的GC-MS图图3-d以葡萄糖为碳源所合成PHAs的GC-MS图图3-e以可溶性淀粉为碳源所合成PHAs的GC-MS图图3-f以谷氨酸钠为碳源所合成PHAs的GC-MS图经质谱解析不同保留时间所对应的物质列于表3，可以看出，由乙酸钠、乙醇为碳源所合成PHAs组分比较单纯，经过6h好氧过程，乙醇经氧化转变为乙酸，然后它们通过同样的代谢途径合成为PHB：乙醇乙酸乙酰CoA乙酰乙酰CoA3-羟基丁酰CoAPHB多糖作为微生物营养时，必须在微生物细胞外被相应的酶水解为单糖或双糖，才能被吸收和利用。某些能利用淀粉的微生物可以向胞外分泌淀粉酶，使淀粉水解成葡萄糖后才被吸收入细胞内进一步降解。因此，在以可溶性淀粉为基质的PHAs合成过程中，主要产物与葡萄糖的相同。乙酰CoA乙酰乙酰CoAD(-)3-羟基丁酰CoA淀粉葡萄糖丙酮酸PHBV丙酰CoA丙酰乙酰CoAD(-)3-羟基戊酰CoA味精的主要成分是谷氨酸钠，谷氨酸是一种有代表性的氨基酸，在动、植物、微生物中普遍存在的是L-谷氨酸脱氢酶，催化L-谷氨酸脱氢脱氨基，生成α-酮戊二酸，这些分解产物可进一步参加代谢，进入三羧酸循环、转变成糖和脂肪或合成新的氨基酸。Dionisi[4]等在以谷氨酸为唯一碳源合成PHAs的研究中，未发现PHAs或糖原积累现象，而本研究从GC-MS图谱中，可以发现由谷氨酸钠合成了PHAs且为PHB，代谢途径如下：琥珀酸谷氨酸α-酮戊二酸琥珀酰CoA乙酰乙酰CoAPHB在所有合成PHAs的产物中都检测出了HOOC-CH2-CH2-COOH（琥珀酸），也间接证明了三羧酸循环对PHAs合成的参与。值得注意的是在以可溶性淀粉和谷氨酸钠为碳源合成的PHAs产物中检测出了3-羟基癸酸（3-hydroxydecanoate，HD）和3-羟基十二酸（3-hydroxydodecanoate，HDD），可能是外加碳源与菌体内原有脂肪酸共同参与了PHAs的合成。同时其中还混有一些长链脂肪酸（烷酸和烯酸），表明菌体内原有的脂肪酸在用氯仿提取时也被提取出来。在微生物菌体内脂肪酸的碳原子大都为偶数，含量最多且普遍存在的高级脂肪酸有硬脂酸、软脂酸和油酸[5]，本研究结果与之相当吻合，它们对PHAs的性能影响还需进一步研究，如以PHAs为产品的生产也需考虑提取分离技术对纯度的影响。表3图3a－f中各峰所对应物质图名峰名结构式物质名称图3-a1CH3-CH（OOH）-CH2COOH3-羟基丁酸（PHBB单体）2C6H5COOH苯甲酸（内标物）图3-b1CH3-CH（OOH）-CH2COOH3-羟基丁酸（PHBB单体）2HOOC-CH22-CH2-COOHH琥珀酸3C6H5COOH苯甲酸（内标物）图3-c1CH3-CH（OOH）-CH2COOH3-羟基丁酸（PHBB单体）2HOOC-CH22-CH2-COOHH琥珀酸3C6H5COOH苯甲酸（内标物）图3-d1CH3-CH（OOH）-CH2COOH3-羟基丁酸（PHBB单体）2CH3-CH2--（CH）（OH）-CH2COOH3-羟基戊酸（PHVV单体）3HOOC-CH22-CH2-COOHH琥珀酸4C6H5COOH苯甲酸（内标物）图3-e1CH3-CH（OOH）-CH2COOH3-羟基丁酸（PHBB单体）2CH3-CH2--（CH）（OH）-CH2COOH3-羟基戊酸（PHVV单体）3HOOC-CH22-CH2-COOHH琥珀酸4C6H5COOH苯甲酸（内标物）5CH3-（CH22）6-（CH）（OH）-CH2COOH3-羟基癸酸6CH3-（CH22）14COOHH十六碳酸（软脂酸酸）7CH3-（CH22）8-（CH）（OH）-CH2COOH3-羟基十二酸8CH3-（CH22）7-CH＝CH-（CH2）7COOH十八烯酸（油酸）9CH3-（CH22）16COOHH十八碳酸（硬脂酸酸）图3-f1CH3-CH2（OH）-CH2COOH3-羟基丁酸（PHBB单体）2HOOC-CH22-CH2-COOHH琥珀酸3C6H5COOH苯甲酸（内标物）4CH3-（CH22）6-（CH）（OH）-CH2COOH3-羟基癸酸5CH3-（CH22）14COOHH十六碳酸（软脂酸酸）6CH3-（CH22）8-（CH）（OH）-CH2COOH3-羟基十二酸7CH3-（CH22）7-CH＝CH-（CH2）7COOH十八碳烯酸（油酸酸）8CH3-（CH22）16COOHH十八碳酸（硬脂酸酸）综合以上分析，活性污泥作为混合菌群，其中存在大量微生物。在好氧阶段一方面可以实现微生物的增殖，另一方面，可以氧化生成大量能量物质（CoA），作为PHAs合成的前体。在厌氧阶段，一部分厌氧微生物通过丁酸型发酵途径生成β-羟酰CoA，然后PHAs聚合酶将各个β-羟酰CoA通过酯键连接成聚酯。由于活性污泥是多菌群体，不同的微生物的代谢途径不尽相同，本研究还将对其中的主要储磷、合成PHAs菌种进行纯化培养，以明确各个菌种在单一及混合碳源下累积PHAs的特性。4结论4.1在以乙酸钠、乙醇、葡萄糖、可溶性淀粉和谷氨酸钠为碳源厌氧/好氧释磷吸磷的研究中发现，吸磷效率是乙醇（乙酸）>葡萄糖>可溶性淀粉>谷氨酸钠。可溶性淀粉需先水解为葡萄糖、谷氨酸钠需先脱氨基才能进一步代谢，在厌氧阶段生成较多的小分子有机酸如乙酸等有利于好氧阶段的吸磷。4.2分别以乙酸钠、乙醇、谷氨酸钠为唯一碳源合成PHAs为PHB，以葡萄糖、可溶性淀粉为唯一碳源合成PHAs为PHBV。4.3在PHAs产物中检测出了琥珀酸，证实三羧酸循环参与了PHAs的合成代谢。4.4在以可溶性淀粉和谷氨酸钠为碳源的合成产物中均提取到了硬脂酸、软脂酸和油酸，说明用氯仿提取的脂肪酸是PHAs与菌体内的其它高级脂肪酸的混合物。参考文献[1]YupLee,Sang.Bacterialpolyhydroxyalkanoates.Biotech.&Bioeng.1996,49(1):1-14[2]国家环保局《水和废水监测分析方法》编委会。水和废水监测分析方法（第三版）[M]。北京：中国环境科学出版社，1989[3]RiisV.,MaiW.Gaschromatographicdeterminationofpoly-β-hydroxybutyricacidinmicrobialbiomassafterhydrochloricacidpropanolysis.JournalofChromatography.1988,445:285-289[4]D.Dionisi,C.Levantesi,V.Renzietal.PHAstoragefromseveralsubstratesbydifferentmorphologicaltypesinananoxic/aerobicSBR.WaterSci.&Tech.,2002,46(1-2):337-344[5]大连轻工业学院主编。生物化学[M]。北京：轻工业出版社，1981BiologicalphosphorusremovalefficiencyandstructuralanalysisofPHAsbydifferentcarbonsourcesAbstractThemachiningperformanceofmiddle-chain-length-co-short–chain-lengthPHAsisbetterthanpurePHAs.Anactivatedsludgecultivatedon5differentsubstrates(Sodiumacetate,ethanol,glucose,solublestarchandsodiumglutamine)astheonlycarbonsourcesimulatedtypicalfoodandfermentationfactoriestostudythebiologicalphosphorusremovalefficiencyandthecharacteristicsofPHAssynthesizedinananaerobic/aerobicSBR.Thephosphorusreleasedinaerobicperiodwas10.12、1.63、7.88、2.44and5.00mg/Lrespectively,thephosphorusuptakewas0.64、6.37、8.10、1.21和3.05mg/Linanaerobicperiod.Thetotalphosphorusuptakeefficiencywasethanol(acetate)>glucose>solublestarch>sodiumglutamine.Thegraduallyalka