实验一动物细胞培养液消化液和冷冻液的配制

实验一动物细胞培养用液的配制培养液：维持动物细胞生存和生长所需要的基本溶液

平衡盐溶液（BalancedSaltSolution,BSS）用作洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液天然培养基（NaturalMedium）主要来自动物体液（如血清）或组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。在细胞培养中使用最早，也最有效。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响实验产物的提取和实验结果的分析。

合成培养基（SyntheticMedium）根据细胞生存所需物质的种类和数量，人工模拟合成，配方恒定。

优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。需补充部分天然培养基，多用血清，效果更好。消化液：分离组织、分散细胞的细胞分离液胰蛋白酶液：使细胞间的蛋白质水解、细胞分散常用浓度为0.25%

血清可终止其对细胞的消化作用

EDTA液：鳌合Ca2+、Mg2+，使细胞分离，对细胞毒性小常用浓度为0.02%冷冻液：用于细胞的冷冻保存在细胞培养的基础液中加入一定剂量的血清和冷冻保护剂，如二甲亚砜（DMSO）、甘油或乙二醇。

冷冻保护剂可使冰点降低，提高细胞膜对水的通透性，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。培养细胞生长的条件1细胞的营养需要基本营养物质：氨基酸，维生素，碳水化合物，无机离子。促生长因子等物质：血清中含多种促细胞生长所需的物质。2细胞的生存环境温度：37℃

气体：O2和CO2，CO2常用浓度为5%pH值：7.2-7.4

渗透压：260－320mmol/L3无污染及无毒常用实验用品培养器皿：培养瓶，血清瓶，吸管，离心管，冻存管超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪培养瓶血清瓶培养板配制培养液必须使用三蒸水或Millipore超纯水，不可用无离子水配制。纯水仪全自动高压灭菌锅滤器

原理用比细菌直径(一般为0.5-5μm)小的微孔滤膜(直径0.22μm)将细菌从培养液中除去，实际上为除菌而非灭菌。CO2培养箱

设定的条件为37℃，5％CO2

应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内蒸馏水槽中灭菌蒸馏水3000毫升以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。倒置显微镜液氮罐1.浸泡（自来水）:初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶液掉。2.刷洗（洗涤液）：刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。3.酸泡（24小时）：浸泡在由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成的清洁液中。浸泡时间一般为过夜，不应少于6小时。4.冲洗：需流水冲洗10次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次，50℃烘干备用。常用玻璃器皿清洗基本步骤：洗瓶子消毒培养液抽滤除菌分装培养液质量鉴定水：三蒸水或Millipore超纯水，不可用无离子水配制。细胞培养用液的配制配洗涤液1600、消化液300配培养液1600、基础液剩余除菌保存冷冻液以后再配用4袋DMEMDMEM基础液配方（1000ml）DMEM13.5g（一个包装的干粉培养基）NaHCO33.7gHEPES2.38g青霉素0.1g链霉素0.075g

调节pH值至7.2

加水定容至1L用无菌0.22μm滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中4℃冰箱保存。消化液DMEM基础液＋0.25％胰蛋白酶(trypsin)＋0.02％EDTA-Na2洗涤液DMEM基础液＋5％胎牛血清（终浓度）培养液DMEM基础液＋10％胎牛血清（终浓度）用无菌0.22μm滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中4℃冰箱保存。注意事项1.由于培养液是细胞赖以生存的环境，制备过程要操作严格，避免混入杂质，使用的成分应精心选择，必须用分析纯试剂。2.配制培养液时必须使用干净的药匙，在称取完一种试剂后必须用干净纸擦拭干净，在条件允许时每种试剂单独使用一把药匙，避免不同试剂间的交叉混合，影响培养效果。3.所有存放培养液的容器都必须事先严格清洗和高压灭菌；制备好的培养液要标注培养液名称、配制日期，并按不同培养液的要求妥善贮存。4.使用非一次