第十一章-荧光分析法

第十一章荧光分析法

Fluoreometry荧光1/15/20238:20:11PM/bbs荧光的产生发射与激发光谱荧光仪器定量关系荧光效率概述用荧光来进行定性定量的分析方法——荧光分析法。

无辐射跃迁放出热能或动能物质基态光照射激发态光致发光发射荧光和磷光物质基态吸收特定光可见-紫外光源分子荧光分析

由荧光波长可确定物质分子结构

由荧光强度可测物质的含量

§1荧光分析法基本原理

一、分子荧光（一）、分子荧光的产生分子在辐射能的照射下，电子跃迁至单重激发态，并以无辐射弛豫方式回到第一单重激发态的最低振动能级，由此再跃回基态或基态中其它振动能级时所发出的光。

基态和激发态单重态和三重态辐射跃迁（光）和无辐射跃迁（热）概念单重态：singletstate三重态：tripletstate电子能级的多重性M:M=2S+1；S为总自旋量子数续前ABC单重态和三重态电子分布能量ππππ*π*π*A：基态单重态B：激发单重态C：激发三重态激发三重态T激发单重态S*基态单重态S0激发单重态S与激发三重态T的不同点：

1.能量高2.激发单重态平均寿命短，tS=10-8s,3.基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁1.能量低2.激发三重态平均寿命长，tS=10-4--1s,3.基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁激发单重态S激发三重态T去活化过程辐射跃迁无辐射跃迁振动弛豫内转换体系间跨越猝灭荧光磷光回基态途经荧光形成机制单重态第二激发态第一激发态三重态荧光磷光内转换体系跨越振动弛豫基态振动弛豫荧光磷光处于第一电子激发单重态最低振动能级的分子发射光量子回到基态各振动能级，这一过程为荧光发射处于第一电子激发三重态最低振动能级的分子发射光量子回到基态各振动能级，这一过程为磷光发射。不同点起源不同波长不同寿命不同吸收峰磷光峰荧光峰(二)、荧光的激发和发射光谱激发波长发射波长激发光谱(excitationspectrum)：F~ex

荧光光谱(fluorescencespectrum)：F~em光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器荧光光谱固定发射波长，改变激发波长，测荧光强度和激发光波长的关系。固定激发波长，（为最大激发波长），测不同波长时的荧光强度。荧光的激发光谱和发射光谱激发光谱200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱荧光光谱特征Stokes位移：荧光波长一般比激发波长要长(前者能量较低)荧光光谱形状与激发波长无关；荧光光谱与激发光谱形状相似，呈镜像对称。蒽的激发光谱和荧光光谱S0S1*ν=4ν=3ν=2ν=1ν=0ν=4ν=3ν=2ν=1ν=0b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4ΔE4ΔE3ΔE2ΔE1ΔE4ΔE3ΔE2ΔE1蒽的能级跃迁图镜像关系的原因基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似返回

荧光产生的必要条件有吸收结构有高的荧光效率二、荧光与分子结构（一）、荧光效率（fluorescenceefficiency）

分子结构与荧光的关系长共轭结构分子的刚性取代基类型共轭高荧光效率高刚性平面使荧光效率高1、给电子基团使荧光增强-OH,-OCH3,-NH2,-CN,-NR2;2、吸电子基团使荧光减弱-COOH,-NO2,-SH,-C=O,-X;3、-R,-SO3H,-NH3+等基团对荧光影响不明显。共轭效应产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光越容易产生。化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.62荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。刚性平面结构芴联苯F=1F=0.2荧光黄不产生荧光产生荧光产生荧光不产生荧光F=0.92荧光黄酚酞偶氮菲偶氮苯1）给电子取代基加强荧光.取代基效应—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN产生p→π共轭二苯甲酮：弱荧光S1→T1的系间窜跃产率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm）278~310285~365310~405280~390285~345相对荧光强度10182020202）吸电子取代基减弱荧光—C=O，—COOH，—NO2不产生p→π共轭硝基苯：不产生荧光.金属螯合物的荧光1.螯合物中配位体的发光8-羟基喹啉弱荧光8-羟基喹啉-Zn螯合物黄绿色强荧光2,2`-二羟基偶氮苯无荧光2,2`-二羟基偶氮苯-Al螯合物强荧光三、影响荧光强度的外部因素

A、温度影响温度上升，荧光减弱

B、溶剂的影响增大溶剂的极性使荧光增强含重原子的溶剂（e.g.CBr4）使荧光减弱溶剂粘度降低荧光强度减弱

C、酸度的影响

D、荧光熄灭剂激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用，使能量转移，荧光强度减弱甚至消失。.E、散射光.散射光干扰及消除散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的光。散射光包括瑞利散射光和拉曼光瑞利散射光：无能量的交换，λ散射≈λ激发拉曼光：有能量转移，λ散射><λ激发硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b)荧光光谱散射光谱瑞利光320nm拉曼光360nm拉曼光400nm荧光448nm激发320nm激发350nm瑞利光350nm干扰的消除1）改变激发光的波长；2）更换溶剂；CCL4的拉曼光与激发光波长相近，其拉曼光几乎不干扰荧光测定。§2荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系

I0I

F①

在ECl≤0.05时，F=KC,溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；②在ECl＞0.05，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度不呈线性关系；③荧光分析法的测定灵敏度高。三.分子荧光强度与荧光物质浓度的关系1.荧光强度与浓度的关系光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相应的吸光分数为：荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：按照级数展开式：对于稀溶液，当bc<0.05时：IF----荧光强度F-----荧光量子产率k--与仪器灵敏度有关的参数I0--入射光强度。l--吸收光程--摩尔吸光系数C--荧光物质浓度通常A<0.05If与A

的关系A与c正比，低浓度泰勒级数展开，仅取一项，x越小越符合定量关系荧光分析法的应用一.工作曲线法荧光分析的灵敏度比紫外－可见分光光度法高103～104.直接荧光标准曲线法FCsFxCx二.荧光分析法的灵敏度比例法分光法与荧光法定量比较

UV-VIS分光法

荧光法定量基础A=lgI0/IFC灵敏度 与有关与有关检测限 10-6-10-9 10-9-10-12

灵敏度高选择性好垂直方向§3

荧光光度计

光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制荧光分光光度计:光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器

与分光光度计的主要差别①

垂直测量方式,消除透射光影响②两个单色器，激发和发射，常用光栅荧光仪特点一.光源1.光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命2.氙灯光源常用气体放电灯类型：

氙灯光源高压汞光源波长范围：200~1000nm工作压力：5~20atm启动电压：20~40KV使用寿命：1000~2000h最广泛应用的连续光源：发射波长范围宽发射光强度大二.单色器：两个三.检测器光电倍增管放大倍数：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109四.样品池1.形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围2.使用注意事项容易破碎问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？沾污问题2.发射单色器：置于样品池后和检测器之间1.激发单色器：置于光源和样品池之间，其作用是提供所需要的单色光，以激发被测物质。紫外-可见分光光度计

测量池(吸收池)荧光分光光度计样品池I0ItI0ItIF,p§4分子荧光分析法的在药学中的应用1.无机阳离子发生荧光的很少，但很多能与一些有机试剂形成荧光络合物而被测定；2.一些阴离子能使荧光减弱，可利用荧光猝灭法测定；3.脂肪族有机物分子能发生荧光的也不多，可与某些有机试剂反应后生成会发射荧光的衍生物加以测定；4.芳香族化合物因有共轭结构，多数能发射荧光；5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成强荧光衍生物以提高测量灵敏度。故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚广。芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（）。思考题4.荧光光谱分析中的最主要光谱干扰是().A.激发光;B.磷光;C.拉曼光;D.容器表面产生的散射光5．测量荧光强度时,要在与入射光成直角的方向测量,这是因为().A.只有在与入射光成直角的方向上才有荧光;B.在成直角方向测量可以避免散射光的影响;C.在成直角方向测量可免除透射光的影响;D.荧光的强度比入射光强6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。7.荧光光谱的特征？1.所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射光()。

A.波长长的光线B.波长短的光线

C.能量大的光线D.频率高的光线2.下列说法正确的是()A荧光发射波长永远大于激发波长

B荧光发射波长永远小于激发波长

C荧光光谱形状与激发波长无关

D荧光光谱形状与激发波长有关3．荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是()