目的基因的获得

第3章目的基因的获得basicprocessofDNArecombinationinvitro

体外DNA重组的基本步骤2.重组体的制备：将目的基因的DNA片断连接到能自我复制并带有选择性标记（如：抗菌素抗性标记）的载体分子上（DNA重组过程，需要各种工具酶的参与）3.重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物*1.目的基因的获得：从复杂的生物基因组中，经过PCR扩增或基因组文库筛选、cDNA文库筛选等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。

2contents化学合成法构建基因组DNA文库筛选目的基因构建cDNA文库筛选目的基因聚合酶链式式反应(PCR)法1化学合成法多用于合成短的DNA片段，如引物、DNA探针等。DNA合成仪2构建基因组文库筛选目的基因Genomiclibraries：acollectionofclones,representativeoftheentirestartingpopulation某种生物的基因组的全部遗传信息切割成一定长度的DNA片段，再通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个集合即为该生物的基因组文库构建时遗传信息供体是基因组DNA，因而无发育时期及组织器官特异性；一个完全的基因组文库中包含着基因组DNA上的所有编码区及非编码区序列的克隆。生物有机体的每一个基因在文库中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列，所以基因组文库可真实地显示基因组的全部结构信息。基因组文库的大小一个理想的基因组文库，包含完整基因组的所有DNA序列理论上的克隆子数目＝基因组DNA总长度/DNA插入片段的平均长度实际的克隆子数目：大于理论666载体能够容载的DNA片段大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，构建文库所要求的DNA片段数目越少，所需的重组子越少。777Processconstructingagenemiclibrary

（基因组文库的构建流程）①物理切割法：超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。②酶切法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片段。888（1）染色体DNA大片段的制备直接连接、人工接头（adapter）或同聚物加尾。如：Sau3A与BamHI的酶切末端相同（二者是同尾酶）。（2）载体分别与得到的基因组DNA大片段进行连接（3）重组载体各自转导受体细胞，扩大培养，得到基因组文库*（4）筛选重组子形成一个含有所有片段的菌群，这个菌群就是一个基因组文库靶DNA未测序或未定位时，可通过基因组文库筛选靶DNA。Q：什么是adapter？Linker？同尾酶？（第2、5章）999采用λ噬菌体载体进行基因组文库的构建示意图Sau3AI和BamHI是同尾酶。101010基因组DNA的处理：用两种酶对基因组进行部分酶切；EcoRI甲基化酶封闭EcoRI位点；EcoRI连杆(linker)与平末端连接；EcoRI酶切产生粘性末端；Λ噬菌体置换型载体的处理：Cos位点退火，载体成环；用EcoRI酶切产生1个大片段，2个小片段；去掉小片段，保留大片段；连接反应：大片段与基因组片段连接形成噬菌体基因组的串联体；在cos位点酶切成噬菌体大小后包装进噬菌体头部；感染宿主并在宿主中增殖。Producingrepresentativegenomiclibrariesinλcloningvectors(1978年，最早用两种不常见的酶酶切基因组，进行克隆。)111111CreationofagenomicDNAlibraryusingthephage-λvectorEMBL3A.(1983年，采用一种酶对基因组进行切割。该克隆策略方便高效。)Aconvenientsimplificationcanbeachievedbyusingasinglerestrictionendonucleasethatcutsfrequently,suchasSau3AI.

Sau3AIandBamHIcreatethesamecohesiveends.Inplaceofphage-λderivatives,anumberofhigher-capacitycloningvectorssuchascosmids,BACs,PACsandYACsareavailablefortheconstructionofgenomiclibraries.Theadvantageofsuchvectorsisthattheaverageinsertsizeismuchlargerthanforλreplacementvectors.Butsuchlibrariesaregenerallymoredifficulttoprepare,andthelargerinsertscanbelessthanstraightforwardtoworkwith.除了λ噬菌体衍生载体之外，还有其他许多的高容量克隆载体（如BAC、PAC、YAC等）都可以用于基因组文库的构建。这些载体的优点是平均插入片段的大小远大于λ置换载体，但文库较难制备，插入片段较大，不容易直接操作。1212123构建cDNA文库筛选目的基因mRNAcDNA反/逆转录DNA转录AcDNAlibraryisprepared

byreverse-transcribingapopulationofmRNAsand

thenscreenedforparticularclones.cDNA

library：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。*CharacterofcDNA

library

（cDNA文库的特点）分离的目的基因可直接用于表达比DNA文库小的多，容易构建，文库的筛选比较简单易行；以mRNA为材料，反映的是该生物特定发育时期、特定组织(或器官)在某种环境条件下的基因表达情况，有一定的时效性；只与编码序列有关，因此不能反映内含子、启动子、终止子以及与核糖体识别等的序列的结构和功能特征141414*ProcessconstructingacDNAlibrary

（cDNA文库的构建流程）151515*(i)isolatemRNA（提取总RNA并分离mRNA）;(ii)first-strandDNAsynthesisonthemRNAtemplate,carriedoutwithareversetranscriptase（用Oligo(dT)（或随机引物）作引物，以RNA为模板，逆转录酶合成cDNA的第一链）;(iii)removaloftheRNAtemplate（去除RNA/DNA杂合链中的RNA，碱处理或RNaseH处理）;(iV)second-strandDNAsynthesisusingthefirstDNAstrandasatemplate,carriedoutwithaDNA-dependentDNApolymerase,suchasE.coliDNApolymeraseI（以cDNA第一链为模板，用DNA依赖性的DNA聚合酶合成cDNA第二链）.1：分离mRNA，通过反转录的方式合成cDNA161616*2：cDNA与载体连接，形成重组载体在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。（通过接头形成粘性末端而连接）或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。（通过寡聚化形成粘性末端而连接）3：噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖），得到cDNA文库注：刚合成的cDNA双链的末端几乎不可能正好是内切酶的酶切位点，因此这里肯定不存在由粘性末端直接相连的例子。这一点与基因组DNA与载体的相连有所区别。4：从cDNA文库中筛选目的重组子171717181818HowtoisolatemRNA？利用mRNA都含有一段polyA尾巴的特点，采用亲和层析柱将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。合成12－20个dT组成oligo（dT）作为引物与mRNApoly（A）尾巴杂交，用反转录酶引导可合成cDNA第一链。1919cDNA克隆中使用的反转录酶AMV：来源于禽类的成髓细胞瘤病毒MMLV：大肠杆菌中克隆的莫罗尼氏鼠白血病病毒NativeenzymeshavepoorprocessivityandintrinsicRNaseactivity,whichleadstodegradationoftheRNAtemplate.天然来源的酶缺乏持续合成能力，但具有内在的RNA酶活力，容易使RNA模板降解，不利于生产全长的cDNAThenativeenzymesfunctionoptimallyat37℃andthereforetendtostallatsequencesthatarerichinsecondarystructure,asoftenfoundin5’and3’untranslatedregions.(天然来源的酶，发挥功能的最适温度是37℃，且通常会在富含二级结构的序列出转录终止——这些结构往往出现在5端或3端的非翻译区（这样就不容易形成全长cDNA）)*2020现在常用的酶：天然的酶改造过以利于生产全长cDNASeveralcompaniesproduceengineeredmurinereversetranscriptasesthatlackRNaseHactivity,andthesearemoreefficientintheproductionoffull-lengthcDNAs.（现在常用突变了的反转录酶（老鼠病毒来源的），它们缺乏RNaseH活性，因此更有利于生产全长cDNA）AnexampleistheenzymeSuper-ScriptII,marketedbyLifeTechnologies(Kotewiczetal.1988).Thisenzymecanalsocarryoutreversetranscriptionattemperaturesofupto50℃.(如：LifeTechnologies公司生产的改造后的Super-ScriptII可以在50℃下进行反转录。)DevelopmentofcDNAcloningstrategiesAnearlycDNAcloningstrategy,involvinghairpin-primedsecond-strandDNAsynthesisandhomopolymertailingtoinsertthecDNAintothevector.(早期的策略：发卡方法：引导cDNA第二链的合成)212121ImprovedmethodforcDNAcloning.Thefirststrandistailedwitholigo(dC)allowingthesecondstrandtobeinitiatedusinganoligo(dG)primer.(改进的策略：寡聚加帽法：对cDNA第一链同聚物加尾后，设计相对应的引物合成cDNA第二链)*早期cDNA策略222222mRNA的分离Oligo(dT)引物与mRNA退火，cDNA第一链合成降解mRNA模板，cDNA3’末端形成双链发夹结构以发夹结构为引物，合成cDNA第二链用S1核酸酶去掉发卡结构缺点：S1核酸酶的作用，会使cDNA5’端的序列部分丢失232323AnearlycDNAcloningstrategy,involvinghairpin-primedsecond-strandDNAsynthesisandhomopolymertailingtoinsertthecDNAintothevector.（合成的cDNA双链通过同聚物加尾的方式与载体相连后导入宿主细胞中）AseriousdisadvantageofthehairpinmethodisthatcleavagewithS1nucleaseresultsinthelossofacertainamountofsequence