实验七 大肠杆菌检测

实验七

大肠菌群的测定一实验目的1、掌握大肠杆菌的鉴定和计数方法2、巩固无菌操作技术二大肠杆菌鉴定原理大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否染肠道致病菌的可能。样品中大肠菌群系以100mL（g）检样内大肠菌群最大可能数（MPN)表示。

细菌学检验程序

样品

细菌总数

大肠菌群

水样稀释或不稀释

水样稀释或不稀释第一步------初步发酵试验倾注平板培养（乳糖发酵）

37℃24小时37℃24小时

菌落计数第二步------平板分离培养（取平均数报告）（转种鉴别培养基）

37℃24小时革兰染色镜检第三步-------乳糖复发酵试验

报告结果

三、实验器材

1、恒温培养箱（36℃±1℃）、高压灭菌锅]、天平、灭菌培养皿、试管。

2、培养基及试剂：乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂平板（EMB）四、实验步骤——大肠菌群的检测

检品胆盐乳糖发酵管伊红美兰平板大肠杆菌菌落纯培养乳糖复发酵管（-）乳糖复发酵管（⊕）1、检样稀释①以无菌操作将检样1mL放于含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。②用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。③另取1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液。④根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种3管，每支试管接种1ml。2.乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置36℃±1℃温箱内，培养24h±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行。3.分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃温箱内，培养18h—24h，然后取出，观察菌落形态并做革兰氏染色和证实试验。4.证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1—2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃的温箱内培养24h±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性。5.报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）食品中大肠菌群的MPN

值。表1大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数

MPN100mL(g）

95%可信限1mL(g)×30.1mL(g)×30.01mL(g)×3下限上限

0000

0000

0123

<30306090

<5

90

0000

1111

0123

306090120

<5

1300000

22220123

60901201600000

3333

0123

90130160190

1111

0000

0123

4070110150<5102002101111

11110123

7011015019010302303601111

22220123

110150200240303601111

33330123160200240290

222200000123901402002601030360370

2222111101231502002703403070440890

222222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407015012001300380033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000≥240003607101500130002400048000大肠菌群测定

挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；红色、粉红色菌落。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。

产酸判断：紫色培养液变成黄色产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。饮用水、乳、冷饮食品卫生标准的细菌指标指标细菌总数大肠菌群

饮用水＜100个/ml＜3个/L

消毒牛奶≤30，000个/ml≤40个/100ml

瓶装汽水、果味水及果汁类饮料