植物细胞悬浮培养技术讲解学习

植物细胞悬浮(xuánfú)培养技术第一页，共50页。单细胞的分离(fēnlí)由完整的植物器官分离单细胞由培养(péiyǎng)组织（如愈伤组织）中分离单细胞第二页，共50页。1由完整(wánzhěng)的植物器官分离单细胞机械(jīxiè)法酶解法叶片是分离(fēnlí)单细胞的最好材料第三页，共50页。1.1机械(jīxiè)法

方法A：用刀片刮叶片(yèpiàn)(花生成熟叶片(yèpiàn))第四页，共50页。具体方法:撕去表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞第五页，共50页。方法B：叶片(yèpiàn)研碎、离心轻轻研磨加研磨介质过滤、离心第六页，共50页。研磨介质(jièzhì)：40ml20umolSucrose10umolMgCl220umoltris—HCL(三羟甲基氨基甲烷)PH7.8注意：只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。第七页，共50页。注意：大麦、小麦和玉米很难通过酶解法(jiěfǎ)使细胞分离。（叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间形成一种互锁结构）第八页，共50页。事例分离篱天剑叶肉(yèròu)细胞的机械方法叶片消毒匀浆过滤离心植板75％酒精，7％次氯酸钠10ml培养基1.5克1cm2叶片(yèpiàn)低速(dīsù)，去碎屑，游离细胞沉降第九页，共50页。1.2酶解法(jiěfǎ)Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉(yèròu)细胞加果胶酶过滤、离心第十页，共50页。1.3机械(jīxiè)法和酶解法比较机械(jīxiè)法酶解法(jiěfǎ)细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离；细胞产量低；细胞易破。细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。第十一页，共50页。2由培养(péiyǎng)组织（愈伤组织）分离单细胞材料(cáiliào)：胡萝卜肉质根步骤(bùzhòu)：1诱导产生愈伤组织2愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；第十二页，共50页。摇床用于振荡(zhèndàng)继代悬浮3Subculture将愈伤组织在液体(yètǐ)培养基中培养，建立悬浮培养物优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气(kōngqì)交流。第十三页，共50页。植物细胞悬浮培养(péiyǎng)技术（Suspensionculture）特点：细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。必须指出(zhǐchū)：悬浮培养中既有单细胞，也有小细胞团。概念：是指一种在受到不断摇动的液体(yètǐ)培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统。第十四页，共50页。1、起始(qǐshǐ)悬浮液的制备愈伤组织液体培养基摇床振荡悬浮培养质地疏松，细胞分散程度大；质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养转速30～150rpm防细胞破裂第十五页，共50页。第十六页，共50页。2、悬浮培养的基本(jīběn)形式分批培养连续培养第十七页，共50页。2.1分批培养（Batchculture）2.1.1含义：将细胞分散在一定容积的培养基中进行培养。在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物(chǎnwù)可以同外界空气交换外，一切都是密闭的。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。第十八页，共50页。2.1.2特点(tèdiǎn)培养基体积固定当培养基中的营养物质耗尽时，细胞的分裂(fēnliè)和生长也停止必须适当搅拌第十九页，共50页。2.1.3继代(jìdài)的方法和最佳时期继代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。注意(zhùyì)：要适当稀释第二十页，共50页。继代第二十一页，共50页。最佳继代时期(shíqī)：选择指数生长期和直线生长期。第二十二页，共50页。2.1.4细胞(xìbāo)生长曲线在整个培养过程中，细胞数目不断(bùduàn)发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。

细胞的生长呈S形曲线第二十三页，共50页。滞后(zhìhòu)期(lagphase)指数(zhǐshù)生长期(exponentialphase)直线(zhíxiàn)生长期(linearphase)减慢期(progressivedecelerationphase)静止期(stationaryphase)培养时间培养细胞数目1234512345第二十四页，共50页。滞后(zhìhòu)期(lagphase)细胞很少分裂，其时间长短(chángduǎn)取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少培养时间培养细胞数目123451第二十五页，共50页。指数(zhǐshù)生长期(exponentialphase)细胞(xìbāo)分裂活跃，细胞(xìbāo)数目迅速增加培养时间培养细胞数目123452第二十六页，共50页。直线(zhíxiàn)生长期(linearphase)细胞(xìbāo)生长和发育最快的时期培养时间培养细胞数目123453第二十七页，共50页。减慢(jiǎnmàn)期(progressivedecelerationphase)由于(yóuyú)培养基中某些营养物质已经耗尽，或是由于(yóuyú)有毒代谢产物的积累，细胞的增长逐渐减慢培养时间培养细胞数目123454第二十八页，共50页。生长几乎处于停止状态(zhuàngtài)，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。静止(jìngzhǐ)期(stationaryphase)培养时间培养细胞数目123455第二十九页，共50页。小结：（1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。（2）加入条件培养基可以缩短滞后期。条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。（3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持指数生长期。（4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡(sǐwáng)和解体。第三十页，共50页。操作注意事项：对悬浮(xuánfú)培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2～4细胞），使用吸管或注射器。继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮(xuánfú)液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮(xuánfú)培养物。第三十一页，共50页。2.2连续培养（Continuousculture）加入(jiārù)培养基排出(páichū)培养基及其培养物二者体积(tǐjī)相等分：开放式连续培养封闭式连续培养第三十二页，共50页。开放式和封闭式区别(qūbié)封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目(shùmù)不断增加；开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一起流出。第三十三页，共50页。连续培养意义：植物细胞代谢调节的研究(yánjiū)某种生长限制因子对细胞生长的影响次生物质的大量生产紫杉醇是获得美国FDA(1992)认证的优良抗肿瘤药物。红豆杉树皮中紫杉醇的含量为万分之二，其在国际市场上售价为20万美元/kg第三十四页，共50页。由悬浮(xuánfú)细胞再生植株的途径由悬浮细胞直接形成体细胞胚先将悬浮细胞在半固体培养基上诱导(yòudǎo)形成愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株第三十五页，共50页。3细胞(xìbāo)悬浮培养的培养基3.1悬浮培养(péiyǎng)对培养(péiyǎng)基的要求能用来建立生长快、易散碎的愈伤组织的培养(péiyǎng)基，一般也适用于建立该物种的悬浮培养(péiyǎng)。在活跃生长的悬浮培养(péiyǎng)物中，无机磷酸盐的消耗很快，不久成为限制因子。

第三十六页，共50页。Noguchi等(1977)证明，把烟草悬浮培养物保存在一种含有标准的MS无机盐培养基中，培养开始3d之内无机磷酸盐的浓度就几乎下降为零，即使把培养基中磷酸盐的浓度提高到原来(yuánlái)的水平的3倍，5d之内也会被细胞全部用完。高等植物的悬浮培养，B5和ER培养基。第三十七页，共50页。3.2条件(tiáojiàn)培养基把在液体培养(péiyǎng)基里培养(péiyǎng)4～6周的高浓度细胞滤掉，而用他的培养(péiyǎng)基制成悬滴或薄层来培养(péiyǎng)单细胞或低密度细胞群体。第三十八页，共50页。3.3培养基的振荡(zhèndàng)防治细胞缺氧死亡(sǐwáng)防治大的细胞团的形成第三十九页，共50页。3.4悬浮(xuánfú)培养细胞的同步化同步培养(péiyǎng)：指在培养(péiyǎng)中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。

应用：为了便于研究细胞分裂和细胞代谢第四十页，共50页。3.4.1物理(wùlǐ)方法A按细胞团的大小通过对细胞物理特性（细胞或小细胞团的大小）的控制，以实现高度的同步化B低温(dīwēn)休克法通过对生长环境条件（光照、温度等）的控制，以实现高度的同步化第四十一页，共50页。3.4.2化学(huàxué)方法A饥饿法先对细胞断绝一种细胞分裂所必须的营养物质成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步(tóngbù)进入分裂。第四十二页，共50页。细胞周期（cellcycle)是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。

间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。细胞分裂期：前期，中期(zhōngqī)，后期，末期第四十三页，共50页。3.4.2化学(huàxué)方法B抑制法使用DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶(mìdìnɡ)、羟基尿和胸腺嘧啶(mìdìnɡ)脱氧核苷当细胞受到化学药物抑制时，细胞周期只能进行到G1，细胞滞留在G1期S期的边界上。第四十四页，共50页。4悬浮培养中细胞(xìbāo)生长量的计算细胞计数细胞密实(mìshi)体积（PCV）5％铬酸或0.25％果胶酶使悬浮细胞团分散(fēnsàn)用血球计数板进行。将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一个15ml的离心管中，3000rpm离心，用每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。细胞鲜重细胞干重第四十五页，共50页。细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培养基，真空抽滤，称重。细胞干重：60℃干燥(gānzào)12h，称重。以每毫升培养物或106个细胞的重量表示。第四十六页，共50页。5培养细胞活力(huólì)的测定相差显微术法

TTC法（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）FDA法（荧光(yíngguāng)素双醋酸酯法）伊凡蓝法(Evan’sblue)（FDA的互补法）根据细胞质环流(huánliú)和细胞核存在与否，鉴别细胞的死活。环流(huánliú)正常、核存在表明有活力；在活细胞中，TTC被还原成红色甲鐟，提取甲鐟用分光光度计检测。活力受损的细胞能够摄取这种染料，完整的活细胞则不能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞第四十七页，共50页。FDA法的原理(yuánlǐ)FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞(xìbāo)膜。在活细胞(xìbāo)中，FDA被酯酶裂解，释放出有极性的荧光素。荧光素不能