生物工业下游技术应用

生物工业下游技术应用第五章萃取法萃取：指任意两相之间的传质过程。第一节、溶剂萃取法第二节、超临界流体萃取法

第三节、双水相萃取法第四节、反胶团萃取法第五节、浸取法生物工业下游技术应用第一节溶剂萃取

溶剂萃取法是利用一种溶质组分(如产物)在两个互不相溶的液相(如水相和有机溶剂相)中竞争性溶解和分配性质上的差异来进行分离的操作。优点：比化学沉淀法分离程度高；比离子交换法选择性好、传质快；比蒸馏法能耗低。另外它还有生产能力大、周期短、便于连续操作、容易实现自动化控制等优点。生物工业下游技术应用一、溶剂萃取过程的理论基础

1．物质的溶解和相似相溶原理从热力学角度考虑，一个过程要能自动进行，体系的自由能应下降，自由能的变化包括焓变化和熵变化两部分：

为了简单起见，忽略熵的变化，井忽略压力和体积变化(一般溶解过程压力和体积的变化很小)，这样只要考虑体系能量的变化即可。生物工业下游技术应用

溶解过程的三个能量变化过程(1)溶质B各质点的分离；原先是固态或液态的溶质B．先分离成分子或离子等单个质点。此过程需要吸收能量，这种能量的大小通常与分子之间的作用力有关，一般顺序为：非极性物质＜极性物质＜氢键物质＜离子型物质(2)溶剂A在溶质B的作用下形成可容纳B质点的空位；此过程也需要吸收能量，其大小与溶剂分子A之间的相互作用力有关，一般顺序与上述相同：非极性物质＜极性物质＜氢键物质该能量还与溶质分子B的大小有关。(3)溶质质点B进入溶剂A形成的空位；此过程放出能量，放出能量的大小有以下规律：

A、B均为非极性分子＜一非极性分子、另一极性分子＜均为极性分子＜B被A溶剂化生物工业下游技术应用“相似相溶”原理

分子之间可以有两方面的相似：一是分子结构相似，如分子的组成、官能团、形态结构的相似；二是能量(相互作用力)相似，如相互作用力有极性的和非极性的之分，两种物质如相互作用力相近，则能互相溶解。与水“相似”的物质易溶于水，与油“相似”的物质易溶于油就是相似相溶原理的表现。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用

2．溶剂的互溶性规律

物质分子之间的作用力与物质种类有关，包括较强的氢键力和较弱的范德华力。氢键力与化合键能相比较弱，但比范德华力要强得多。按照生成氢键的能力，可将溶剂分成四种类型。(1)N型溶剂不能形成氢键，如烷烃、四氯化碳、苯等,称惰性溶剂。(2)A型溶剂只有电子受体的溶剂，如氯仿、二氯甲烷等，能与电子供体形成氢键。(3)B型溶剂只有电子供体的溶剂，如酮、醛、醚、酯等，萃取溶剂中的TBP(磷酸三丁酯)、叔胺等。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用2．溶剂的互溶性规律(4)AB型溶剂同时具备电子受体A—H和供体B的溶剂,可缔合成多聚分子，因氢键的结合形式不同又可分成三类：

AB(1)型：交链氢键缔合溶剂，如水、多元醇、多元羧酸、多酚等。

AB(2)型：直链氢键缔合溶剂，如醇、胺、羧酸等．

AB(3)型：生成内氢键分子，例如邻硝基苯酚等，这类溶剂中的电子受体A—H因已形成内氢键而不再起作用。故AB(3)型溶剂的氢键性质与N型或B型相似。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用

3．溶剂的极性

溶剂萃取的关键是萃取溶剂的选择，而选择的依据是“相似相溶”的原则。“相似”有两个方面：一是分子结构相似，这相对容易考察；另一个是分子间作用能相似，即分子问相互作用力相似。在生物工业上，对后一点考察较多的是分子极性。介电常数是一个化合物摩尔极化程度的量度，如果已知介电常数，就能预测该化合物是极性的还是非极性的。物质的介电常数可通过测定该物质在电容器二极板间的静电容量C来决定。根据萃取目标物质的介电常数，寻找极性相接近的溶剂作为萃取溶剂，也是溶剂选择的重要方法之一。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用一个良好溶剂要满足的要求：(1)有很大的萃取容量，即单位体积的萃取溶剂能萃取大量的产物；(2)有良好的选择性，理想情况是只萃取产物而不萃取杂质；(3)与被萃取的液相互溶度要小，且粘度界面张力小或适中，这样有利于相的分散和两相分离；(4)溶剂的回收和再生容易；(5)化学稳定性好，不易分解，对设备腐蚀性小；(6)经济性好．价廉易得；(7)安全性好，闪点高，对人体无毒性或毒性低。生物工业下游技术应用4．分配定律和分离因数分配定律：在一定温度一定压力的条件下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中，达到平衡时溶质在两相中的活度之比为一常数。如果是稀溶液，活度可用浓度代替，则达到平衡时溶质在两相中的浓度之比为一常数。称之为分配系数K，即有应用条件：(1)稀溶液；(2)溶质对溶剂之互溶度没有影响；(3)必须是同一种分子类型，即不发生缔合或离解。生物工业下游技术应用分离因数(β)

萃取剂对溶质A和B分离能力的大小可用分离因数(β)来表征：若原来料液中除溶质A以外，还含有溶质B，则由于A、B的分配系数不同，萃取相中A和B的相对含量就不同于萃余相中A和B的相对含量。如A的分配系数较B大，则萃取相中A的含量(浓度)较B多，这样A和B就得到了一定程度的分离。

β越大，A、B的分离效果越好，即产物与杂质越容易分离。生物工业下游技术应用

5．水相条件的影响

发酵液中存在与产物性质相近的杂质、未完全利用的底物、无机盐、供微生物生长代谢的其他营养成分等。必须考虑这些物质对萃取过程的影响。(1)pH值直接影响表观分配系数。对选择性有影响。

pH值还应尽量选择在使产物稳定的范围内。(2)温度温度会影响生化物质的稳定性，所以一般在室温或低温下进行。影响分配系数K。(3)盐析硫酸铵、氯化钠等可降低产物在水中的溶解度，有机溶剂在水相中的溶解度。但过多可能促使杂质一起转入溶剂相，必要时要考虑回收。(4)带溶剂能和产物形成复合物，使产物更易溶于有机溶剂相中，提高分配系数。复合物又要容易分解。生物工业下游技术应用二、工业萃取方式和理论收得率

工业上萃取操作通常包括三个步骤：

(1)混合(2)分离(3)溶剂回收1．单级萃取萃取操作理论收得率的计算须符合以下两个假定：

(1)萃取相和萃余相很快达到平衡，即每一级都是理论级；(2)两相完全不互溶，在分离器中能完全分离。理论收得率E为：1—æ＝E／(E+1)2．多级萃取（1）多级错流萃取，特点：溶剂消耗量大，萃取液产物平均浓度较稀，但萃取较完全。（2）多级逆流萃取，特点：萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率最高。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用三、乳化和去乳化1．乳化乳化是一种液体(分散相)分散在另一种不相混溶的液体(连续相)中的现象。害处：乳化产生后会使有机溶剂相和水相分层困难，发酵液废液中夹带有机溶剂微滴和溶剂相中夹带发酵液的微滴，前者意味着发酵单位的损失；后者会给以后的精制造成困难。原因：表面活性剂的存在。蛋白质是引起乳化的最重要的表面活性物质。生物工业下游技术应用

2．破乳化

由蛋白质引起的乳化多为O/W型，其粒径在2.5—30微米之间。亲水基团强度大于亲油基团。破乳方法：

1.过滤或离心分离破乳法；

2.化学法：加电解质中和离子型乳油液的电荷；

3.物理法：加热、稀释、吸附等；

4.顶替法：加入表面活性更大，但因其碳链较短难以形成坚固的保护膜的物质，取代界面上的乳化剂；

5.转型法：如在O/W中加入亲油性乳化刑，使乳化液有生成W/O的倾向，但又不稳定，从而达到破乳目的。最好的方法是防止乳化，如蛋白质是乳化起因，就应设法去除蛋白质。生物工业下游技术应用四、萃取设备简介

1．单级萃取设备在单级萃取基本完全的情况下，用一套混合器和分离机即可。混合、萃取和分离也可在同一台设备(如Alfa—Laval萃取机)内完成。

2．多级萃取设备

(1)脉动筛板塔

(2)转盘塔生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用第二节超临界流体萃取一.序言超临界流体萃取：是将超临界流体作为萃取溶剂的一种萃取技术，它兼有传统的蒸馏和液液萃取的特征，是适用面更广的一门新型分离技术。超临界流体：是状态超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点——临界点后的流体。也有人将超临界流体萃取称为“超临界气体萃取”或“高密度气体萃取”的，这虽不如前者严格，但有时却有利于理解超临界流体的萃取原理。生物工业下游技术应用二、超临界流体的萃取原理

真空“溶解”物质的能力极低。加入超临界气体萃取溶剂（接近于液体密度），溶质的溶解度与真空中的溶解度相比，大幅度增加（一亿多倍）。物质之间的溶解能力主要取决于物质分子之间的相似性，一是分子结构相似，二是分子间的作用力相似。而分子结构之间的相似相溶在很大程度上也可以归结到作用能相似上。真空或萃取剂分子密度极低，溶剂对溶质的作用能极小，溶质的溶解度也就极小了。在超临界流体萃取中，主要是溶剂流体密度的大幅度增加导致溶剂对溶质的作用力大幅度增加，从而形成了溶解物质的能力，这个特性给溶剂流体回收、溶剂与溶质分离带来方便。在超临界萃取后的分离操作中．可在与萃取温度相同的条件下，降低压力使溶剂的密度下降，引起其溶解物质的能力下降，就可以方便地进行萃取物与溶剂的分离。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用三、超临界CO2的溶剂特征１、超临界CO2

的相图：在临界点附近，密度线聚集于临界点周围，压力或温度小范围的变化，就会引起CO2

密度的大幅度变化。由于CO2溶解、萃取物质的能力与CO2

本身的密度成正比，这就意味着只要通过改变压力或温度来改变溶剂CO2

的密度，就可以改变其对物质的溶解能力。特性：通过压力或温度的改变可有效地萃取和分离溶质。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用２、萃取溶剂CO2的性质

无毒，无腐蚀性，不可燃烧，纯度高且价格低。有优良的传质性能，扩散系数大；粘度低，与其他超临界流体溶剂相比，CO2

具有相对较低的临界压力和临界温度，适于处理热敏性生物制品和天然物产品。生物工业下游技术应用

四、SC—C02萃取以及拖带剂的作用１、SC—C02萃取：天然产品中通常含有许多不同的化学成分；对同一天然产品用不同方法或不同萃取剂提取得到的制品，其组分是不同的。逐步增加溶剂C02

的溶解能力，可以获得各种质量不同的萃取产物。２、拖带剂的作用：添加拖带剂即辅助溶剂，可增加物质的溶解度和萃取选择性。如在C02

中添加约14％的丙酮后，甘油酯的溶解度增加22倍。纯C02几乎不能从咖啡豆中萃取咖啡因，但在加湿(水)的SC—C02

中，因为生成了具有极性的H2CO3，在一定的条件下，能选择性地溶解萃取极性的咖啡因。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用五、超临界流体萃取的热力学基础简介１、固体溶质在超临界流体中的溶解度：

y2＝(p2*／p)Ey2—固态组分2在气相中的溶解度；

p2*—体系温度下纯固态组分2的饱和蒸气压；

p—体系总压

E—增强因子，直接影响溶解度的大小。溶质2在气相中的逸度系数2对其影响最大；溶质与溶剂之间相互作用能越大，E就越大。2、液体溶质在超临界流体中的溶解度：

x2r2f2*＝y22p式中x2—溶质2在液相中的组成

r2—溶质2在液相中的活度系数

f2*—体系温度下纯溶质2的逸度生物工业下游技术应用六、SC—C02萃取流程

及在生物、食品工业中的应用

１．SC—C02萃取流程：萃取流程基本上是由萃取工段和分离工段(溶质和C02的分离)组合而成。代表性的三种流程模式图。２．在生物、食品等工业中的应用：

1）生物活性物质和生物制品的提取

2）超临界状态下的酶促反应

3）SC—C02的细胞破壁技术生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用SC—C02作为酶促反应介质的优点①与水相比较，脂溶性底物和产物可溶于SC—C02

中，酶蛋白不溶解，有利于三者的分离。②产品回收时，不需要处理大量的稀水溶液，因而不产生废水污染问题。③与其他非水相有机溶剂中的酶催化反应相比，SC—C02更适合与生物、食品相关的产品体系，产物分离简单。④与萃取一样，SC—C02中的质量传递速度快，在临界点附近，溶解能力和介电常数对温度和压力敏感，可控制反应速度和反应平衡。生物工业下游技术应用3）SC—CO2的细胞破壁技术SC—CO2的以下一些性质有利于细胞破碎：①在近临界点，SC—CO2

的微小压力变化导致其体积变化很大，其能量变化很大，所以SC—CO2可破坏较厚的细胞壁，如常见的酵母等。②SC—CO2

对细胞壁中的少量脂类有萃取作用，会破坏细胞壁的化学结构，造成细胞壁在某些位置上的损坏。这种方式破坏的细胞壁碎片较大，使下游分离过程易于进行。③SC—CO2

节流膨胀是吸热降温过程，这个性质可防止通常破碎过程升温而引起的热敏性物质的破坏。生物工业下游技术应用第三节、双水相萃取技术

溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。聚合物的不相溶性：主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的水相，所以具有强烈的相分离倾向。另外，某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓度达到一定值，也会形成两相，即聚合物—盐双水相体系，成相机理尚不清楚，一种解释为“盐析”作用。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用一、双水相分离理论1、双水相的形成当两种聚合物互相混合时，究竟是否分层或混合成一相，取决于两种因素：一为体系熵的增加，二为分子间作用力。熵的增加涉及到分子数量，与分子大小无关。当分子的物质的量相同时，大分子与小分子间的混合，熵的增加是相同的。

分子间的作用力可看作分子中各基团间相互作用力之和。分子量越大，分子间的作用力也越大。大分子间混合，分子间作用力决定混合效果。混合分子间如存在空间排斥力，它们的线团结构无法互相渗透，则在达到平衡后就有可能分成两相，形成双水相。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用2、相图

水性两相的形成条件和定量关系常用相图表示。它是一条双节线。双节线下方为一相区，双节线上方即为两相区，两相分别有不同的组成和密度。上相组成用T(Top)表示，下相组成用B(Bottom)表示。由图7-2可知，上相主要含PEG，下相主要含Dex。生物工业下游技术应用3、物质在两相中的分配

和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数K表示。

CTK=——CBCt、CB——分别代表上相、下相中溶质的浓度

K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。1）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大)2）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大)3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验）4）影响分配平衡的参数

(1)聚合物的影响；(2)体系中无机盐离子的影响；

(3)体系PH的影响；(4)体系温度的影响；

(5)体系中微生物的影响。生物工业下游技术应用二、双水相萃取技术的应用

双水相萃取技术目前较多地应用于胞内酶的提取和精制上。要成功地运用双水相萃取法，应满足下列条件：

(1)欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；

(2)酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过—次萃取，就能得到较高的收率；

(3)两相用离心机很容易分离。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用双水相提取胞内酶的具体操作

基本流程：（图、表）

1.萃取和平衡（虽黏度高，但表面张力低，故时间短、能耗小）

2.上下相的分离

(1)重力沉降

(2)离心分离（图）

3.多聚物的分离（加盐，形成新的双水相，蛋白质入盐相，PEG得回收，再将盐相超滤或透析除去少量PEG）生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用三、双水相苹取技术的发展

双水相萃取应用得最多的是胞内酶的提取。这种温和的萃取不仅有利于保护目的物的生物活性，而且目的蛋白得率高，纯度高，但目的物还含有少量的核酸和多糖，进一步提高目的蛋白的纯度，可从双水相体系和萃取操作方式两方面进行改进。

PEG衍生物：在PEG上引入亲和基团或离子基团；采用多级萃取。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用第四节、反胶团萃取一、概述反胶团(ReversedMicelles)是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。反胶团的微小界面和微小水相具有两个特异性功能：

(1)具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能；

(2)在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性。生物工业下游技术应用反胶团萃取的优点(1)有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；(2)分离、浓缩可同时进行，过程简便；(3)能解决蛋白质(如胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题；(4)由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；(5)反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。生物工业下游技术应用二、反胶团的形成1、反胶团的构造：在胶体化学中我们知道，如向水溶液中加入表面活性剂，并使其浓度超过一定数值时，表面活性剂就会在水相中形成胶体或微胶团，它是表面活性剂的聚集体。其亲水性的极性端向外指向水溶液，疏水性的非极性“尾”向内相互聚集在一起。当向非极性溶剂中加入表面活性剂，并使其浓度超过一定数值时，也会在非极性溶剂内形成表面活性剂的聚集体。与在水相中不同的是，其疏水性的非极性尾部向外，指向非极性溶剂，而极性头向内，与在水相中形成的微胶团方向相反，因而称之为反胶团或反向胶团。生物工业下游技术应用

几种可能的表面活性剂聚集体的微观构造。表面活性剂的类型：

1、阴离子型；

2、阳离子型；

3、非离子型。分离蛋白质时，使用最多的是阴离子型表面活性剂AOT。生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用2、反胶团的物理化学特性及制备（1）．反胶团的物理化学特性①反胶团的临界胶团浓度②反胶团含水率W（2）．反胶团的制备①注入法②相转移法③溶解法生物工业下游技术应用生物工业下游技术应用三、生理活性物质的分离农缩1、反胶团萃取原理2、蛋白质的溶解3、反胶团萃取

1）氨基