基因工程的操作程序

专题一基因工程双城市第三中学基因工程的基本操作程序1.获取目的基因2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测和鉴定1.2 基因工程的基本操作程序1）目的基因：主要是指能编码特定蛋白质的结构基因，

也可以是一些具有调控作用的因子

。如：苏云金芽孢杆菌的抗虫基因 植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因 种子贮藏蛋白的基因 人的胰岛素基因、干扰素基因……1.2.1 获取目的基因①从基因文库中提取②人工合成基因：已知氨基酸序列合成基因2）目的基因的提取方法包括：基因组文库＞

cDNA文库生物DNA经限制性内切酶切割得到提取mRNA经反转录得到③利用PCR技术扩增

目的基因用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再利用一定发方法将目的基因的DNA片段分离出来。①鸟枪法（散弹射击法）：生物体中提取出现成的mRNA单链DNA双链DNA(cDNA)反转录合成②反转录法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的脱氧核苷酸序列推测推测目的基因化学合成此方法合成的目的基因与真实基因一样吗？有何差别？只含外显子和部分已知的非编码区因同义密码子有很多，所以mRNA有多种可能③人工合成目的基因法：利用PCR技术扩增目的基因概念体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。特点短时间扩增目的基因。原理

DNA半保留复制原理。条件目的基因序列、引物、Taq酶、脱氧核苷酸、温度、pH等1.2.2 基因表达载体的构建（核心）（1）基因表达载体的组成

目的基因、启动子、终止子、标记基因等RNA聚合酶识别、结合的位点如何才能把这些序列连接在一起？（2）构建工具：同种限制性内切酶、DNA连接酶目的基因与运载体结合的结果可能有几种情况？目的基因与目的基因结合；运载体与运载体结合；目的基因与运载体结合√思考：可以被筛选出来实质：不同来源的基因进行重组质粒含目的基因的DNA分子限制性内切酶一个切口，两个黏性末端两个切口，获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种（1）导入植物细胞（受精卵或体细胞）农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法其T-DNA可将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上1.2.3 将目的基因导入受体细胞经组培，得到

转基因植物基因枪法：

10000个整合细胞/枪 气压300-600米/秒

脱氧核糖核酸随机插入，原理不明1987年，周光宇中国的转基因棉花原理不明显微注射法如何才能知道含有目的基因的运载体是否成功导入受体细胞？（2）导入动物细胞 ？经胚胎移植，得到转基因动物（受精卵为主）Ca2+处理，形成感受态细胞如何才能知道含有目的基因的运载体是否成功导入受体细胞？（3）导入细菌细胞——繁殖快经微生物培养，得到工程菌能吸收周围环境中的DNA四环素抗性基因青霉素抗性基因如何通过检测受体细胞中运载体上标记基因的表达，确定连锁的目的基因是否导入？对于这个重组质粒，该如何检测它是否被导入受体细胞？目的基因与标记基因连锁在一起普通质粒目的基因（抗虫基因）标记基因（四环素抗性基因）标记基因（青霉素抗性基因）加入四环素的培养基如何挑选出导入目的基因的受体细胞？加入氨苄青霉素的培养基菌落中的所有细菌都具有氨变青霉素抗性基因，也同时具有目的基因受体细胞摄入重组DNA分子，就意味转基因成功吗？受体细胞（1）是否插入染色体1.2.4 目的基因的检测与鉴定（2）是否转录（3）是否翻译（4）是否表现特定性状分子水平检测——个体水平检测1.2.4 目的基因的检测与鉴定检测水平步骤检测内容检测方法结果显示第一步第二步第三步1.2.4 目的基因的检测与鉴定检测水平步骤检测内容检测方法结果显示分子水平检测第一步转基因生物染色体DNA上是否插入目的基因分子杂交（DNA与DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交（DNA与RNA之间）是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否被翻译成蛋白质抗原-抗体杂交是否成功显示出杂交带个体水平检测目的基因控制的性状是否出现等①目的基因产物是否出现2）检测目的基因是否表达（如：抗虫棉是否具有 ）②检测目的基因控制的性状是否出现

（如：抗虫棉中是否能检测到

）毒蛋白抗虫性翻译水平的检测个体水平的检测若不能表达，要对目的基因（抗虫基因）进行修饰后，再次拼接、导入。1.提取目的基因2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测和表达（重组DNA）生物体外操作各自需要的特殊工具?重组DNA发生在哪一步？操作在哪里完成？限制性内切酶DNA连接酶借助运载体小结：基因操作的四个基本步骤同种限制酶1）以下说法正确的是（）

A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列

B、质粒是基因工程中唯一的运载体

C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接

D、基因控制的性状都能在后代表现出来C练习每种酶具有各自的特异性病毒等目的基因表达后才能表现出性状2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是

（

）

A、能复制

B、有多个限制酶切点

C、具有标记基因

D、它是环状脱氧核糖核酸D练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）

A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来

B、限制性内切酶可用于目的基因的获得

C、目的基因须由运载体导入受体细胞

D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A练习4）有关基因工程的叙述正确的是（）

A、限制酶只在获得目的基因时才用

B、重组质粒的形成在细胞内完成

C、质粒都可作为运载体

D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D练习还用于对质粒等运载体的剪切对基因的剪切、拼接都在生物体外进行具有标记基因的质粒根据已知的氨基酸序列可推测基因外显子的脱氧核苷酸对序列5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因与运载体结合

C、将目的基因导入受体细胞

D、目的基因的检测和表达C练习黏性末端基因的双链的碱基对转录、翻译（上海卷39）A、以重组DNA技术为核心的基因工程正在改变着人类的生活。请回答下列问题。⑴获得目的基因的方法通常包括_______和_________。⑵切割和连接DNA分子所使用的酶分别是______和____。⑶运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或

，后者的性状呈

。⑷由于重组DNA分子成功导入受体细胞的频率

，所以在转化后通常需要进行

操作。⑸将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和

序列上是相同的。答案：（1）化学合成（人工合成）酶切获取（从染色体DNA分离/从生物细胞（2）限制性核酸内切酶（限制酶）DNA连接酶（连接酶）（3）质粒小型环状（双链环状、环状）（4）低筛选（5）氨基酸（海南卷26）（选修模块3：现代生物科技专题）图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。据图回答：（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_____、____、_____三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行_________。（2）用上述3种连接产物与任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是____________;接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是________。（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是____________，其合成的产物是_________。（4）在上述实验中，了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是____________________。答案：（1）目的基因-载体连接物载体-载体连接物目的基因-目的基因连接物分离纯化/筛选（其他合理答案也得分）（2）载体-载体连接物目的基因-载体连接物载体-载体连接物（3）启动子mRNA（4）EcoRI和BamHI（只答一个酶不给分）病毒注入DNA分子限制性内切酶切割入侵的DNA切割限制性内切酶限制性内切酶对抗外来DNA1）DNA序列自动测序仪：2）PCR技术：

对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。

使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E.coliDH5α菌株。由于pBS上带有Ampr和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。

因pBS带有Ampr基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBSDNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。

pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E.coliDH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去α-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。重组质粒的筛选抗生素：由真菌产生，能抑制或杀灭细菌的一类物质。常用的抗生素包括：青霉素、四环素、土霉素等。绝大多数细菌不能在有抗生素的环境中生活，但也有少数突变体，其质粒上具某种抗生素抗性基因，则含这样质粒的细菌，能表现出对相应抗生素的抗性。如：质粒上带有青霉素抗性基因，则