一种基于SARS冠状病毒S蛋白的新型靶向输送生物仿真系统的研究

一种基于SARS冠状病毒S蛋白的新型靶向输送生物仿真系统的研究研究背景严重急性呼吸综合症（severacuterespiratorysyndrome,SARS）于2002年11月首先在我国广东省出现，此后该症于2003年初在全球传播。至2003年6月SARS流行被控制为止，全球被确诊的患者达到8098人，死亡人数774人；该病造成了巨大的经济损失。SARS出现不久，经过全球科学家多中心协作努力，鉴定出导致SARS的元凶是一种新型的冠状病毒（SARScoronavirus，SARS‑CoV）。SARS冠状病毒(SARS-Cov)，属于巢状病毒目(Order:Nidovirales),冠病毒科(Family:Coronaviridae)，冠状病毒属(Genus:Coronavirus)。根据其基因组结构分类，它属于单链正义RNA病毒[(+)sense,ssRNAVirus]。成熟的冠状病毒颗粒直径约为60至220nm不等。其形态学上最显著的特征在于，在病毒包膜(envelope)外，有明显的棒状膜外粒子(‘club-shaped’peplomers)。这一酷似中世纪欧洲帝王王冠(crown)的结构，正是其”名字”-Coronavirus

的来源。研究背景S蛋白（spike-protein）即伸出包膜的棒-球形的糖蛋白，它在病毒与宿主细胞表面受体结合及介导病毒包膜和细胞膜融合并进入细胞的过程中，起关键性作用，也是冠状病毒主要的抗原蛋白。HE蛋白构成包膜的短突起，其可能与冠状病毒早期吸附有关，某些CoV的HE蛋白可引起红细胞凝集及对红细胞产生吸附M蛋白则是一种跨膜蛋白，在病毒的包膜形成与出芽(budding)过程中起重要作用。E蛋白是一种相对较小的蛋白质，主要散在分布于病毒包膜上。N蛋白是一种碱性磷蛋白，其中央区同基因组RNA结合，形成卷曲的核衣壳蛋白研究背景S1能够与细胞受体特异性结合，S2介导病毒与细胞膜发生融合作用研究背景DNA测序结果表明SARS-CoV的S蛋白长度为1256个氨基酸，S2蛋白约600个氨基酸。S2包括三个螺旋结构（helix）和一个穿膜区（1197~1218aa）S2的三个螺旋结构是介导病毒包膜与细胞融合（membranefusion）的关键结构；而穿膜区则将S蛋白固定在病毒包膜上S1与特异性受体的高亲和力结合并不能直接介导细胞融合，但却可有效地驱动S2介导的细胞融合反应。如果能找到细胞/组织特异性的高亲和力结合肽，就有可能模仿或替代S1的功能，为S2介导的细胞融合反应提供动力，同时又可避免S1作为病毒抗原介导的免疫病理反应。研究背景研究背景利用噬菌体展示技术（phagedisplay）筛选细胞/组织特异性的高亲和力结合肽FusionproteinPIIIphenotypegenotype噬菌体展示技术的本质就是在一个单一的噬菌体粒子当中遗传基因表型和蛋白表型的直接的对应关系。利用这种对应关系人们可以将各种自然界存在或不存在的DNA整合到噬菌体基因中，以重组蛋白的形式表达在噬菌体表面，从中筛选出人们所需的目的片断。研究背景外源基因融合于噬菌体不同区段外壳蛋白基因的表达模式3~4轮筛选将噬菌体文库铺在固定的诱饵上洗脱未结合的噬菌体加入宿主菌，扩增和富集洗脱的噬菌体铺富集文库铺盘分离单个克隆验证结合实验3-4轮经典噬菌体展示技术筛选流程图研究背景噬菌体展示技术最初被广泛应用于从复杂的重组文库中筛选和特定靶分子结合的蛋白或多肽。随着发展，该技术也已经被应用到细胞系、组织和疾病模型水平，筛选和鉴定靶向特定细胞系、组织和疾病模型的结合蛋白和多肽。目前，恶性肿瘤治疗的关键问题之一就是缺乏特异性攻击肿瘤细胞的有效药物。噬菌体展示技术已经被用来筛选和表达与不同肿瘤细胞表面的特异性大分子结合的多肽或蛋白，以期将这些蛋白或多肽应用到肿瘤靶向药物的设计中。研究背景培养人肺腺癌A549细胞筛选随机12肽库Ph.D.-12TM生物信息学聚类阳性克隆分离S2基因片段（S2）构建pET-14b-S2质粒

确定多条靶向多肽（TP）绿色荧光蛋白基因（GFP）构建pET-14b-S2-TP质粒MKK6活性诱变体MKK6(E)基因构建pET-14b-S2-GFP-TP质粒构建pET-14b-S2-MKK6-TP质粒表达蛋白评价蛋白定向输入功能实验流程基于SARS冠状病毒S蛋白介导细胞膜融合机制的生物仿真靶向输送系统的设计理念实验流程实验流程评价蛋白定向输入功能

该靶向输送系统中融合蛋白后接绿色荧光蛋白（greenfluoresenceprotein，GFP），可在荧光显微镜下动态观察细胞内绿色荧光强度的变化，可用于研究这一系统携带外源蛋白特异性靶向进入细胞的能力。融合蛋白后接诱导细胞凋亡的蛋白或多肽，如MKK6(E)，检测A549细胞的凋亡情况，用于研究这一系统携带凋亡诱导蛋白靶向导入肺癌细胞，从而杀灭肺癌细胞的能力。近年来我国的肺癌发病率明显上升，在一些大中城市肺癌已占常见恶性肿瘤的首位。生物靶向治疗已逐渐成为一种新的肿瘤治疗策略。本靶向输送系统，巧妙地利用了SARS-CoV特异性侵袭肺组织的分子进化机制，结合肿瘤靶向多肽和可诱导肺癌细胞凋亡的蛋白或多肽，靶向输送杀灭肿瘤细胞，具有良好的开发应用前景和实践意义。研究意义研究进展T载体中保存的S1，S2片段S1markerS2T-S1T-S2digestion(T-S1)digestion(T-S2)1500bp_2000bp_3000bp_4000bp_1000bp_750bp_研究进展pET-14b-S2质粒的构建markerS2pET-14b-S2digestion(pET-14b-S2)pET-14bVector1500bp_2000bp_3000bp_4000bp_1000bp_750bp_BRASIL法（Biopanningandrapidanalysisofselectiveinteractiveligands

）是一种通过差异离心的方法将细胞-噬菌体复合物从亲水环境分离到疏水性有机相中，从而与未结合细胞的噬菌体分离的过程。与细胞结合的噬菌体和细胞一起被离心沉淀到有机相中，而未结合的噬菌体仍以可溶形式保存于上层水相中。该法仅需一步离心分离就可完成，比当前细胞筛选方法更加快速、简单；而且筛选得到的多肽更加敏感和特异。最常用的有机相是9:1[v:v]的邻苯二甲酸二丁酯和环己烷。研究进展细胞筛选模型的建立（BRASIL法）研究进展细胞筛选模型的建立我们已经利用该法完成了LPS刺