醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质

实验六

醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质实验目的

熟悉蛋白电泳的操作步骤及临床意义

掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理实验原理

电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。影响电泳的因素：所带电荷的性质、数量、分子大小、形状根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。血清中蛋白质的等电点在pH4.0~7.3之间，在pH8.6的缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。各蛋白质等电点不同，所带电量也不同，分子小且带电多者，泳动快；反之泳动慢。本实验以醋酸纤维薄膜为支持物，其具有均一泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力优点：分离速度快、电泳时间短、样品用样量少,对染料不吸附应用：医学和临床检测的常规技术实验器材电泳仪卧式电泳槽电泳仪和电泳槽的链接DYY-2型电泳仪醋酸纤维薄膜（2cm×8cm）：1片/人培养皿：共4套，包括染色（1套），漂洗（3套）点样器滤纸表面皿镊子脱色摇床

722型分光光度计实验试剂

新鲜血清巴比妥缓冲液（pH8.6）

染色液（氨基黑10B）

漂洗液0.4mol/LNaOH1.薄膜准备实验步骤将薄膜置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中，浸泡30min以上，方可用于点样用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间吸干多余的缓冲液，然后平铺在桌子上（毛面朝上）用点样器蘸取少量血清，以印章法点样。2.点样：点样处距离膜边缘约1.5cm处，位置居中点样时，轻压1-2S，使血清渗透到薄膜内点样只可一次，不能重复点样点样要求：细、直、不接触边缘注意：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条制作滤纸桥3.上样：连接电泳仪和电泳槽将薄膜毛面朝下，点样端朝向负极置于滤纸桥上（注：不可让点样处接触滤纸桥）

排空膜上的气泡平衡：盖上电泳槽盖，平衡5min至膜完全湿润预电泳：50V，5min电泳：稳压，110V，约1h（至第一条带到达膜条2/3处为止）4.电泳：染色：用镊子将膜条夹至氨基黑10B中染色1-3min（注：膜条完全浸入染色液且尽量不重叠）漂洗：脱色摇床上进行漂洗，10min/次，共三次4.染色及漂洗：5.定量：剪下各区带，分别加入4mlNaOH溶液浸泡约30分钟，然后于620nm比色6.计算：各部分吸光值之和：T=A+α1+α2+β+γ

相对百分含量=(X/T)×100%实验结果清蛋白57.45-71.73%a1-球蛋白1.76-4.48%a2-球蛋白4.04-8.28%β-球蛋白6.79-11.39%γ-球蛋白11.85-22.97%A/G

1.24-2.36正常参考值临床意义血浆蛋白绝大部分由肝脏合成，只有γ-球蛋白由浆细胞合成血浆蛋白主要功能：维持血浆胶体渗透压；调节血浆pH值；维持酸碱平衡；运输营养物质、代谢物、激素、药物、金属离子等肝硬化：清蛋白降低，γ-球蛋白极度升高；肝癌患者：清蛋白与球蛋白间多出一条甲胎蛋白（AFP）带；急慢性肾炎、肾病综合症：清蛋白降低，a1、a2和β球蛋白升高；多发性骨髓瘤：清蛋白降低，γ-球蛋白升高，于β、和γ-球蛋白区带之间出现“M”带1.电泳时，血清样品点在支持介质的哪一端，为什么？2.引起电泳图谱不整齐的原因有哪些？思考题其他主要电泳技术介绍：1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

常用于蛋白质分子量的测定，有垂直板、平板、盘状电泳2、等电聚焦电泳：通过