肉毒梭菌及其毒素检验

肉毒梭菌及其毒素检验主讲人：王福红动物性食品微生物检验

知识目标：

理解肉毒梭菌的生物学特性。了解肉毒梭菌及其毒素的致病性。掌握肉毒梭菌及其毒素标准检验方法。

能力目标：

会制备肉毒梭菌及其毒素检验用培养基。会对肉毒梭菌及其毒素进行检验。

肉毒梭菌肉毒梭菌是一种腐物寄生菌，在自然界分布很广，土壤、霉干草和畜禽粪便中均有存在，可分为A至G七个型。肉毒中毒是一种较严重的食物中毒，它是肉毒梭菌的外毒素所引起的。早在18世纪末以前，在德国引起中毒的食品主要是腊肠，所以称为腊肠中毒（BotuLism）。在我国过去译为腊肠中毒，把肉毒梭菌译为腊肠杆菌或腊肠梭菌，现在改称为肉毒梭菌。引起肉毒中毒主要是食入含有肉毒毒素的食品，食品在调制加工、运输贮存的过程中，污染了肉毒梭菌芽胞，在适宜条件下，发芽、增殖并产生毒素所造成的。国外引起肉毒中毒的食品多为肉类及各种鱼、肉制品、火腿、腊肠以及豆类、蔬菜和水果罐头。中毒食品种类往往与饮食习惯有关。如欧洲各国主要的中毒食品为火腿、腊肠和其他兽肉、禽肉等。美国主要是家庭制的水果罐头，而火腿、腊肠等畜禽肉加工食品仅占7.7%，日本和俄罗斯等国家鱼制品中毒者最多，尤其是日本，几乎全部是鱼制品的E型中毒。国内因肉类食品及罐头食品引起的中毒的较少，据有关资料调查统计，主要是臭豆腐、豆鼓、面酱、红豆制品、烂土豆等植物性食品引起的中毒多见。肉毒梭菌的抵抗力一般，但其芽胞的抵抗力很大，可耐煮沸1～6小时之久，于180℃干热5～15分钟才能破坏，120℃高压蒸气下10～20分钟才能杀死。10%盐酸须经1小时才能破坏。在酒精中能存活2个月。其中以A、B型菌的芽胞抵抗力最强。这一点对于罐头食品的灭菌很重要，若芽胞深藏于食品中，或者数量过多，虽经高温灭菌，有时也不易杀死芽胞，故应特别注意。肉毒毒素抵抗力也较强，80℃30分钟或100℃10分钟才能完全破坏。正常胃液和消化酶于24小时不能将其破坏，可被胃肠道吸收而中毒。形态及染色：本菌为革兰氏染色阳性的大杆菌，长4～6um,宽0.9～1.2um，多单在，偶见成双或短链。菌端钝圆。有周身鞭毛，无荚膜，芽胞为椭圆形，A、B型菌的芽胞大于菌体，位于菌体近端，使菌体呈匙形或网球拍状，另外四型菌的芽胞一般不超过菌体宽度。一、生物学性状培养特性：本菌为最严格的厌氧菌，对营养要求不高，在普通培养基上都能生长。发育最适宜温度为28～37℃，pH为6.8～7.6，产毒的最适pH为7.8～8.2。血清琼脂：培养48～72小时，形成中央隆起，边缘不整齐、灰白色、表面较粗糙的绒球状菌落。直径可达6～10mm。血液琼脂：菌落周围有溶血区。血液琼脂培养特性：普通琼脂：形成灰白色、半透明、边缘不整齐。呈绒毛网状、向外扩散的菌落。直径约为3～5mm。肉渣肉汤：呈均匀混浊生长，肉渣可被A、B和F型菌消化溶解成烂泥状，并发黑，产生腐败恶臭味，从第三天起，菌体下沉，肉汤变清。在肉渣培养基和半固体培养基，大量产气。生化特征本菌生化特性很不规律，一般能分解葡萄糖、麦芽糖、果糖产酸产气。对明胶、凝固血清、凝固蛋白均有分解作用，并引起液化。不形成靛基质，能产生硫化氢。菌型及毒素目前已知肉毒梭菌有A、B、C、D、E、F、G等7个菌型，其中C型还有Cα和Cβ两个亚型。引起人群中毒的主要是A、B、E三型，C、D型主要是畜禽肉毒中毒的病原，F型只见报导发生在个别地区的人，如丹麦和美国各一起。1980年从瑞士五名突然死亡病例中发现G型毒素。各型肉毒梭菌产生相应型的毒素，所以肉毒毒素也分为A、B、C、D、E、F、G等7型，C型包括Cα和Cβ两个亚型。肉毒毒素是在肉毒梭菌胞浆中产生，由菌体释放到培养基中，经滤过除菌所得滤液即为毒素液。毒素形成的最适宜温度为28～37℃，温度低于8℃与pH在4.0以下时，则不能形成。肉毒梭菌产生的毒素是一种神经毒素，是目前已知的化学毒物与生物毒素中毒性最强的一种，对人的致死量为10-9mg/Kg体重。其毒力比氰化钾还要大一万倍。二、致病性肉毒毒素是一种与神经亲和力较强的毒素，肉毒毒素经肠道吸收后，作用于外周神经肌肉接头，植物神经末梢以及颅脑神经核，毒素能阻止乙酰胆碱的释放，导致肌肉麻痹和神经功能不全。在临床上表现以中枢神经系统中毒症状为主，肉毒毒素中毒潜伏期长短不一，短者2小时，长者可达数天，一般为12～24小时。中毒症状，早期为瞳孔放大、明显无力、虚弱、晕眩，继而出现视觉不清和雾视，愈来愈感到说话和吞噬困难，通常还可见到呼吸困难，体温一般正常，胃肠道症状不明显。病程一般为2～3天，也有的长达2周之久。肉毒中毒死亡率较高，据报导可达30%～50%，死亡主要是由于呼吸麻痹及心肌痪瘫。如早期使用型特异或多价抗血清治疗，死亡率可降至10%～15%。三、检验方法《中华人民共和国国家标准—食品卫生检验方法（微生物学部分）》肉毒梭菌及其毒素的检验方法GB4789.12-2003

。《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》食品中肉毒梭菌的PCR检测方法SN/T2525-2010

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检验方法（GB4789.12）肉毒梭菌检出分离培养结果报告肉毒毒素检验（一）肉毒毒素检验样品的处理123毒力测定4定型试验5

检出试验

确证试验液体检样可直接离心，固体或半流动检样须加适量（例如等量、倍量或5倍量、10倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后，取上清液进行检测。另取一部分上清液，调pH6.2，每份加10%胰酶（活力1：250）水溶液1份，混匀，不继轻轻搅动，37℃作用60min，进行检测。1.样品的处理试验方法：取样品处理完的上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠三只，每只0.5mL，观察4d。结果观察：注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h内发病死亡。如遇小鼠猝死以至症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重做试验。主要症状为竖毛、四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。2.检出试验结果判定：若注射加诊断血清与煮沸加热的两份混合液的小白鼠均获得保护存活。注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有的症状死亡。可判定检样中的肉毒毒素存在，必要时进行毒力测定及定型试验。3.确证试验不论上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小白鼠发病、死亡者，取样分成三份进行试验：一份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀，37℃作用30min。一份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min。一份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可，不做其他处理。三份混合液分别注射小白鼠各两只，每只0.5mL,观察4d。3.确证试验取已判含有肉毒毒素的检样离心上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成50倍、500倍及5000倍的稀释液，分别注射小白鼠各两只，每只0.5mL,观察4d。根据动物死亡情况，计算检样所含肉毒毒素的大体毒力（MLD/mL或MLD/g）。4.毒力测定按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在10MLD/mL～1000MLD/mL的范围，分别与各单型肉毒抗诊断液血清等量混匀，37℃作用30min，各注射小白鼠两只，每只0.5mL，观察4d。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素等量混合作为对照。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清即为检样所含肉毒毒素的型别。5.定型试验（二）肉毒梭菌检出（增菌产毒培养）试验取庖肉培养基三支，煮沸10min～15min，做如下处理：第一支：急速冷却，接种检样均质液1mL～2mL；第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10min，急速冷却；第三支：接种检样，继续煮沸加热10min，急速冷却。培养：30℃，5d。观察结果：若无生长，可再培养10d。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同肉毒毒素的检验，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。选取经毒素检测试验证实含有肉毒梭菌的前述增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48小时。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样（或珍珠层样）薄层，但G型菌无此现象。根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于30℃培养5d,进行毒素检测及培养特性检查确证试验