分子生物学教案(整理版)

第一章绪论（2学时）本章重点分子生物学的研究内容。基本要点一、分子生物学简史基因概念的发展遗传物质与蛋白质的对应关系DNA二级结构的发现DNA复制机制的发现—半保留复制Jacob和Monod提出基因表达的操纵子模型遗传密码的破译分离限制性内切酶-重组DNA—定向改变生物测序、PCR、分子杂交基因组计划和后基因组时代：1．人类基因组计划的主要内容：遗传图分析；物理图分析；转录图分析；基因组序列测定；资料的储存与利用。2．后基因组研究：功能基因组学；蛋白质组学。二、分子生物学的研究内容分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。从分子水平揭示生命的奥秘的学科。它的主要研究内容包括：生物大分子的结构与功能（结构分子生物学）基因表达的调控DNA重组技术基因组结构和功能，生物信息学三、分子生物学展望第二章DNA与染色体（10学时）本章重点1．DNA双螺旋结构模型要点。2．核小体的概念。3．DNA的变性、复性及分子杂交。4．基因组，基因家族。5．DNA的转座。本章难点DNA在真核细胞内的组装；基因家族；DNA的转座。基本要点一、核酸的化学组成1．核苷酸中的碱基成分碱基：嘌吟(A,G)嘧啶(T,C,U)2．戊糖与核苷核苷酸(脱氧核苷酸)：核苷(脱氧核苷)与磷酸通过酯键结合。3．核苷酸的结构与命名核苷一磷酸(nucleosidemonophosphate,NMP)核苷二磷酸(nucleosidediphosphate,NDP)核苷三磷酸(nucleosidetriphosphate,NTP)环腺苷酸(cycleAMP,cAMP)环鸟苷酸(cycleGMP,cGMP)二、核酸的一级结构1．DNA和RNA的一级结构四种核苷酸或脱氧核苷酸按照一定的排列顺序以3',5'磷酸二酯键(phosphodiesterlinkage)相连形成的多聚核苷酸链或脱氧核苷酸(polydeoxy-nucleotides),称为核苷酸序列(也称为碱基序列)。脱氧核苷酸或核苷酸的连接具有严格的方向性，是前一核苷酸的3'-OH与下一位核苷酸的5'-位磷酸间形成3'，5'磷酸二酯键，构成一个没有分支的线性大分子。DNA的书写应从5'到3'。2．RNA与DNA的差别戊糖成分是核糖不是脱氧核糖;嘧啶为胞嘧啶和尿嘧啶而不含有胸腺嘧啶，U代替了DNA的T。DNA和RNA对遗传信息的携带和传递是依靠核苷酸中的碱基排列顺序变化而实现的。三、DNA的空间结构与功能1．DNA的二级结构——双螺旋结构模型DNA的双螺旋结构的研究背景：Chargaff规则：©A=T,G=C；不同生物种属的DNA碱基组成不同，同一个体不同器官、不同组织的DNA具有相同的碱基组成。DNA双螺旋结构模型的要点：DNA是一反向平行的互补双链结构亲水的脱氧核糖基和磷酸基骨架位于双链的外侧、而碱基位于内侧，两条链的碱基互补配对，A---T形成两个氢键，G---C形成三个氢键。堆积的疏水性碱基平面与线性分子结构的长轴相垂直。两条链呈反平行走向，一条链5'f3',另一条链是3'f5'。)。DNA是右手螺旋结构DNA线性长分子在小小的细胞核中折叠形成了一个右手螺旋式结构。螺旋直径为2nm。螺旋每旋转一周包含了10对碱基，每个碱基的旋转角度为36°。螺距为3.4nm；碱基平面之间的距离为0.34nm。DNA双螺旋分子存在一个大沟(majorgroove)和一个小沟(minorgroove),目前认为这些沟状结构与蛋白质和DNA间的识别有关。DNA双螺旋结构稳定的维系横向靠两条链间互补碱基的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持，尤以碱基堆积力更为重要。DNA结构的多样性B-DNA(Watson-Crick模型结构)；Z-DNA；A-DNA。3．DNA的超螺旋结构DNA在双链螺旋式结构基础上，进一步折叠成为超级螺旋结构。正超螺旋、负超螺旋。四、核酸的理化性质及其应用1．核酸的一般理化性质核酸具有较强的酸性。DNA是线性高分子，粘度极大，RNA分子远小于DNA，粘度也小得多。DNA分子在机械力的作用下易发生断裂。嘌吟和嘧啶环中均含有共轭双键，因此对波长260nm左右的紫外光有较强吸收。这是DNA和RNA定量最常用的方法。DNA的变性DNA变性在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，DNA双螺旋结构松散，变成单链。加热是实验室最常用的DNA变性的方法。DNA的增色效应(hyperchromiceffect)加热时，DNA双链解链过程中，内部的碱基暴露，对260nm波长紫外光吸收增加，DNA的A260增加，并与解链程度有一定的比例关系。这种关系称为DNA的增色效应(hyperchromiceffect)。解链曲线连续加热DNA的过程中以温度对A260的关系作图，所得的曲线。从曲线中可以看出，DNA的变性从开始解链到完全解链，是在一个相当窄的温度内完成的，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度(融解温度)(meltingtemprature，Tm)。在Tm时，核酸分子内50%的双链结构被解开。一种DNA分子的Tm值的大小与其所含碱基中的G+C比例相关，G+C比例越高，Tm值越高。Tm值计算公式：Tm=69.3+0.41(%G+C)；V20bp的寡核苷酸的Tm计算：Tm=4(G+C)+2(A+T)。DNA的复性与分子杂交DNA复性变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，又称为退火(annealing)。DNA的复性速度受到温度的影响，复性时温度缓慢下降才可使其重新配对复性。如加热后，将其迅速冷却至4€以下，则几乎不可能发生复性。这一特性被用来保持DNA的变性状态，一般认为，比Tm低25°C的温度是DNA复性的最佳条件。核酸分子杂交(hybridization)不同来源的DNA单链分子(DNA或RNA)放在同一溶液中，只要含有大致相同的互补碱基序列，经过退火处理，能够重新形成杂种双螺旋，这个过程称为分子杂交。可以用来检验不同物种的同源序列或同源基因。双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子间，也可以发生在那些碱基序列部分互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间。核酸分子探针用同位素、生物素或荧光染料标记一小段已知序列的多聚核苷酸的末端或全链就可以作为探针，探针的序列如果与DNA或RNA序列互补，就可以探知核酸分子。五、基因和基因组、基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列。一个典型的真核基因包括：编码序列一外显子(exon)；插入外显子之间的非编码序列一内合子(intron)；5'-端和3'-端非翻译区(UTR)；调控序列(可位于上述三种序列中)。绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。、基因组(genome)一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3x109(30亿bp),共编码约3万个基因。每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-ValueParadox)。六、真核生物基因组(一、、真核生物基因组的特点①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中；②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2—3%)。(二)、真核基因组中DNA序列的分类1、高度重复序列(重复次数＞105)：如卫星DNA(SatelliteDNA)。2、中度重复序列中度重复序列的特点重复单位序列相似，但不完全一样；散在分布于基因组中；序列的长度和拷贝数非常不均一；中度重复序列一般具有种属特异性，可作为DNA标记；中度重复序列可能是转座元件(返座子)。中度重复序列的分类长散在重复序列(longinterspersedrepeatedsegments.)LINES短散在重复序列(Shortinterspersedrepeatedsegments)SINESSINES:长度v500bp,拷贝数＞105.如人Alu序列LINEs:长度＞1000bp(可达7Kb),拷贝数104-105，如人LINEl。3、单拷贝序列(UniqueSequence)包括大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列。(三)、基因家族(genefamily)一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因。可能由某一共同祖先基因(ancestralgene)经重复(duplication)和突变产生。基因家族的特点:①基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(genecluster)或串联重复基因(tandemlyrepeatedgenes)，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因；②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因;③有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因(Pseudogene).屮al表示与al相似的假基因。假基因分类。加工过的假基因(processedpseudogene)。典型的基因家族l.tRNA基因单倍体人基因组中l300个tRNA基因，tRNA基因簇。rRNA基因>100copy.rRNA基因簇(重复单元28S、18S、5.8s-rRNA)组蛋白基因30-40copy.定位：7q32-q36组蛋白基因簇(重复单位：H1，H2A，H2B，H3、H4)特点：无intron，Po1y(A)-RNA。珠蛋白基因a类：16p13，基因簇(24Kb)：5'—匚一屮匚一屮a1—a2—a1—3'卩类：11p15，基因簇(60Kb)：5'—Z—Gr—Ar—^p—S—p—3'(四)、超基因家族(Supergenefamily,Superfamily)由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同。(五、、人类基因组中的重复序列标记1、A1u序列单倍体人基因组50万-100万拷贝，平均每隔3-6Kb就有一个Alu序列，人A1u序列长300bp：2x130bp重复序列；+31bp间隔序列(中间)；两侧7-21bp正向重复(directrepeats)，返座子？Alu序列广泛散布于人基因组，约90%已克隆的人基因含有Alu序列；Alu序列标志。2、可变数串联重复(Variablenumbertamdemrepeat,VNTR)：又称小卫星DNA(minisatelliteDNA)，由短重复单位(6-40bp)串联重复(6-100次以上)而成，多位于基因的非编码区，广泛分布。VNTR多态性一分子标记一DNA指纹图(fingerprint)；小卫星DNA突变与肿瘤，H-Ras。3、短串联重复(shorttandemrepeat,STR)又称微卫星DNA(microstalliteDNA)，是指2-6个核苷酸组成的重复单位串联重复(10-60次)，两侧为特异的单拷贝序列，人基因组中每l0kbDNA序列至少一个STR序列。{CA}n,50，000-100，000拷贝.新一代遗传标记，人类基因组研究，肿瘤，遗传病。七、线粒体基因组人线粒体基因组的特点：人线粒体基因组为16,569bp的双链闭环分子，一条链为重链(H链)，一条链为轻链(L链)，两条链均有编码功能，每个mtDNA分于编码13种蛋白质和24种结构RNA(22rRNA，2tRNA)。线粒体DNA为母系遗传。结构基因不含内含子，部分区域有基因重叠，因此病理性mtDNA突变更易发生。4．mtDNA突变频率更高。线粒体DNA突变的表型表达与核DNA不同。八、细菌和病毒基因组(一)、细菌基因组的特点1．功能相关的几个结构基因往往串联在一起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构。2．结构基因中没有内含子，也无重叠现象。3．细菌DNA大部分为编码序列。(二)、病毒基因组的特点每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA；病毒核酸大小差别很大，3x103—3x106bp；3．除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。4•大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成。真核病毒基因有内含子，而噬菌体(感染细菌的病毒)基因中无内含子。有重叠基因。八、染色质和染色体细胞分裂间期一染色质(chromatin)分裂期一染色体(chromosome)(一)、染色质的基本单位一核小体1.核小体(nucleosome)结构DNA绕在组蛋白八聚体(H2A、H2B、H3、H4各一对)核心外1.8周(146bp),形成核小体核心颗粒。两个核小体核心颗粒之间有LinkerDNA(0-80bp),核小体核心颗粒+Linker=核小体(长180-210bp)；核小体DNALadder。2.组蛋白(histone)：—类小的带有丰富正电荷＜富含Lys,Arg｝的核蛋白，与DNA有高亲和力。组蛋白分类：核小体核心组蛋白，H2A,H2B,H3,H4。分子量较小(102-135aa)作用：盘绕DNA形成核小体。H1组蛋白：较大(220aa)，作用：与LinkerDNA结合后利于核小体稳定和更高级结构的形成。、染色质的高级结构1．30nm染色质纤丝；袢环结构(1oopeddomain)；3．细胞分裂期染色体；分裂期染色体一一对姐妹染色单体(Chromatid)。有丝分裂中期46条染色体按大小和形状排列的的光学显微镜图像称为人的染色体核型(Karyotype)。、染色体的结构要素着丝粒(centromere):细胞分裂时染色体与仿锤丝相连结的部位，为染色体的正常分离所必需。端粒(telomere):真核生物线状染色体分子末端的DNA区域端粒DNA的特点：由富含G的简单串联重复序列组成(长达数kb)。人的端粒DNA重复序列：TTAGGC。端粒的末端都有一条12-16碱基的单链3'端突出。端粒的作用：防止DNA末端降解，保证染色体的稳定性和功能。九、DNA的转座转座元件(Transposableelement)：可移动的DNA元件(mobileDNAelements),它是指那些可在DNA分子内或DNA分子间转移的DNA片段。转座：转座元件的转移过程。转座的特点：1．转座后原来位置的转座元件序列仍然保留,但同时又把新合成的DNA复本插入到另外一个位点。座过程需要转座酶(transposase).它催化断裂和重接两步连续的过程(需要M2+)。座元件插入位置的两端有3-12bp的正向重复序列(靶序列)，它是由于转座酶错位切割DNA造成的•这种短正向重复序列是存在转座元件的特征。转座元件的分类转座子(transposon):通过DNA复制而转移的转座元件。逆转座子(retroposon)或返座子,通过RNA阶段实现转移的转座元件(DNA—RNA—DNA—插入新位点)。逆转座子例：Alu.LINEl.逆假基因(retro-pseudogene)。转座的遗传效应：导致基因重排、插入、缺失。十、RNA的空间结构与功能1.信使RNA的结构与功能细胞核内合成的mRNA初级产物比成熟的mRNA大得多，这种初级的RNA被称为不均一核RNA(HetergeneounuclearRNA,hnRNA),它们在细胞核内存在时间极短，经过剪接成为成熟的mRNA并移位到细胞质。成熟的mRNA由编码区和非编码区构成,它的结构特点如下：①大多数的真核mRNA转录后在5'-端加一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C'2也是甲基化的，这种m7GpppNm结构被称为帽子结构(capsequence)o帽子结构具有促进核蛋白体与mRNA的结合、加速翻译起始速度的作用，同时可以增强mRNA的稳定性。②在真核mRNA的3'末端，有一多聚腺苷酸(polyA)结构，通常称为多聚A尾。一般由数十个至一百几十个腺苷酸连接而成。polyA是RNA生成后加上去的。polyA与mRNA从核内向胞质的转位及mRNA的稳定性有关。各种mRNA的长短差别很大，mRNA分子的长短，决定翻译的蛋白质分子量的大小。各种RNA分子中，mRNA的半衰期最短，由几分钟到数小时不等，是细胞内蛋白质合成速度的调控点之一。mRNA的功能是把核内DNA的碱基顺序(遗传信息)，按照碱基互补的原则，转录并转送至胞质，在蛋白质合成中用以翻译成蛋白质中氨基酸的排列顺序。mRNA分子上每3个核苷酸为一组，三联体密码(tripletcode)。2．转运RNA的结构与功能转运RNA(transferRNA，tRNA)是细胞内分子量最小的一类核酸，100多种tRNA都由70至90个核苷酸构成。tRNA的功能是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体并将其转呈给mRNA。tRNA的结构特点:分子中含10%〜20%的稀有碱基(rarebases)。稀有碱基是指除A、G、C、U外的一些碱基，包括双氢尿嘧啶(DHU)、假尿嘧啶(屮，pseudouridine)和甲基化的嘌吟(mG,mA)等(图3-12)。一般的嘧啶核苷以杂环上N-1与糖环的C-1'连成糖苷键，假尿嘧啶核苷则用杂环上的C-5与糖环的C-1'相连。tRNA核苷酸中存在局部互补配对的区域，可以形成局部双链，进而形成一种茎-环样(stem-loop)结构或发夹结构。中间不能配对的部分则膨出形成环状。tRNA形成三叶草形(cloverleafpattern)二级结构。DHU环和T屮环，以及反密码环。反密码子(anticoden)与mRNA相应的三联体密码子碱基互补。例如负责转运酪氨酸的tRNA(tRNATyr)的反密码子5'-GUA-3'与mRNA上相应的三联体密码子5'-UAC-3'(编码酪氨酸)呈反向互补。不同的tRNA依照其转运的氨基酸的差别，有不同的反密码子。X射线衍射结构分析发现tRNA的共同三级结构是倒L型。3.核蛋白体RNA的结构与功能核蛋白体RNA(ribosomalRNA，rRNA)约占RNA总量的80%以上。rRNA与核蛋白体蛋白共同构成核蛋白体或称为核糖体(ribosome)，原核生物和真核生物的核蛋白体均由易解聚的大、小两个亚基组成。真核生物的核蛋白体小亚基由18SrRNA及30余种蛋白质构成；大亚基则由5S、5.8S、及28S三种rRNA加上近50种蛋白质构成。真核生物的18SrRNA的二级结构呈花状，形似40S小亚基，其中多个茎环结构为核蛋白体蛋白的结合和组装提供了结构基础。其他小分子RNA细胞的不同部位还存在着另外一些小分子的RNA,它们分别被称为小核RNA、小核仁RNA、小胞质RNA等。这些小RNA分别参与hnRNA和rRNA的转运和加工。5．核酶某些RNA分子本身具有自我催化能力，可以完成rRNA的剪接。这种具有催化作用的RNA被称为核酶（ribozyme）。十一、核酸酶核酸酶（nucleases）是指所有可以水解核酸的酶，在细胞内催化核酸的降解,以维持核酸（尤其是RNA）的水平与细胞功能相适应。按照作用底物分：DNA酶（DNase）、RNA酶（RNase）。核酸外切酶：5'末端外切酶、3'末端外切酶核酸内切酶：作用于链的内部，其中一部分具有严格的序列依赖性（4〜8bp）,称为限制性内切酶。核酸酶在DNA重组技术中是不可缺少的重要工具，尤其是限制性核酸内切酶的应用更是所有基因人工改造的基础。第三章DNA的复制与修复（6学时）基本要求掌握与DNA复制、DNA损伤与修复、逆转录过程有关的基本概念。包括：半保留复制，半不连续复制，复制叉，复制子，岡崎片段，前导链，后随链，端粒，端粒酶等。掌握复制的过程，以及复制过程中涉及到的各种酶、蛋白因子；并掌握原核生物与真核生物复制的相同点与不同点。掌握逆转录过程，熟悉逆转录酶的应用。了解引起地中海贫血和镰形红细胞贫血的分子机制。重点DNA分子在生物体内的合成有三种方式：（1）DNA指导的DNA合成，也称复制，是细胞内DNA最主要的合成方式。遗传信息储存在DNA分子中，细胞增殖时，DNA通过复制使遗传信息从亲代传递到子代。（2）修复合成，即DNA受到损伤（突变）后进行修复，需要进行局部的DNA的合成，用以保证遗传信息的稳定遗传。（3）RNA指导的DNA合成，即反转录合成，是RNA病毒的复制形式，以RNA为模板，由逆转录酶催化合成DNA。真核生物的DNA合成过程与原核生物基本相似，但机理尚不十分清楚，以原核生物为例介绍其复制过程。基本要点一、DNA的复制中心法则：遗传信息从DNA通过转录流向RNA，RNA通过翻译指导合成蛋白质，这种遗传信息的传递规律称之中心法则。少数RNA也是遗传信息的贮存者，RNA能逆转录为DNA，是对中心法则的补充。复制（replication）：即DNA的生物合成，以DNA为模板指导合成相同的DNA分子，使遗传信息从亲代传递到子代的过程。RNA病毒的遗传信息储存于RNA分子中，可进行RNA复制并反转录合成DNA。2.半保留复制(semiconservativereplication)：DNA复制时，亲代DNA双螺旋结构解开，分别以解开的两股单链为模板，以dNTP(dATP、dGTP、dTTP、dCTP)为原料，按照碱基互补的原则，合成与模板链互补的新链，从而形成两个子代DNA双链，其结构与亲代DNA双链完全一致。因子代DNA双链中的一股单链源自亲代，另一股单链为合成的新链，形成的双链与亲代双链的碱基序列完全一致，故称为半保留复制。复制叉(replicationfork)：原核生物DNA的复制从单一起点开始，双螺旋结构被打开，分开的两股单链分别作为新DNA合成的模板，DNA合成从起点开始双向单向进行，与单一起点相连的局部结构形状呈“Y”型，称复制叉结构。半不连续复制：复制过程中，催化DNA合成的DNA聚合酶只能催化核苷酸从5J3'方向合成，以3J5'链为模板时，新生的DNA以5J3'方向连续合成；而以5'-3'为模板只能合成若干反向互补的岗崎片段，这些片段再相连成完整的新链，故称半不连续复制。岗崎片段(Okazakifragments)：DNA双链是反向平行的，复制时，亲代双链DNA在复制叉处打开，由于新链的合成具有方向性，即从5'—3',以5'f3'DNA链为模板合成反向互补的新链时，只能合成小片段DNA，这些片段根据发现者命名为岗崎片断。前导链、后随链：DNA双链是反向的，复制时，两股链均作为模板，但新链的合成只能是5J3'。因此，顺着解链方向合成的子链，复制是连续进行的，这股链称为前导链，另一股新链的复制方向与解链方向相反，复制是不连续进行的，这条不连续合成的链称为后随链。引发体：是由DnaA蛋白、DnaB蛋白(解螺旋酶)、DnaC蛋白、引物酶和DNA的起始复制区域共同形成的一个复合结构oDnaA蛋白识别复制起点，DnaB蛋白有解螺旋作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白组装到复制起始点，引物酶合成引物。（一）、原核生物DNA的复制1．与复制有关的酶及蛋白质（1）拓扑异构酶：通过切断并连接DNA双链中的一股或双股，改变DNA分子拓扑构象，避免DNA分子打结、缠绕、连环，在复制的全程中都起作用。其种类有：拓扑异构酶I和拓扑异构酶II。拓扑异构酶I能切断DNA双链中一股并再连接断端，反应不需ATP供能；拓扑异构酶II能使DNA双链同时发生断裂和再连接，需ATP供能，作用是向DNA分子引入负超螺旋。（2）解螺旋酶：DNA进行复制时，需亲代DNA的双链分别作模板来指导子代DNA分子的合成，解螺旋酶可以将DNA双链解开成为单链。大肠杆菌中发现的解螺旋酶为DnaB。（3）单链结合蛋白（SSB）：在复制中模板需处于单链状态，SSB可以模板的单链状态并保护模板不受核酸酶的降解。随着DNA双链的不断解开，SSB能不断的与之结合、解离。（4）引物酶：是一种RNA聚合酶，在复制的起始点处以DNA为模板，催化合成一小段互补的RNA。DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合反应，若没有引物就不能起始DNA合成。引物酶能直接在单链DNA模板上催化游离的NTP合成一小段RNA,并由这一小段RNA引物提供3'-0H,经DNA聚合酶催化链的延伸。（5）DNA聚合酶：是依赖DNA的DNA聚合酶，简称为DNApol，以DNA为模板，dNTP为原料，催化脱氧核苷酸加到引物或DNA链的3'-OH末端，合成互补的DNA新链，即5'—3'聚合活性。polI为单一肽链的大分子蛋白质，具有5'—3'聚合酶活性、3'—5'外切酶活性和5'-3'外切酶的活性；其功能主要是去除引物、填补缺口以及修复损伤。polII具有5'—3'聚合酶活性和3'—5'外切酶活性，其功能不明。polIII是由十种亚基组成的不对称二聚体，具有5'—3'聚合酶活性和3'—5'外切酶活性，与DNA复制功能有关。另外，klenow片断是DNApolI体外经蛋白酶水解后产生的大片段，具有DNA聚合酶和3'—5'外切酶活性，是分子生物学的常用工具酶。DNA复制的保真性：为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：①遵守严格的碱基配对规律；②在复制时对碱基的正确选择；③对复制过程中出现的错误及时进行校正。polIII的3'—5'外切酶活性具有较正功能。在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种。其中，参与染色体DNA复制的是pola(延长随从链)和pol8(延长领头链)，参与线粒体DNA复制的是poly，pole与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，pol卩只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。(6)DNA连接酶：DNA连接酶用于连接双链中的单链缺口，使相邻两个DNA片段的3'-OH末端和5'-P末端形成3'，5'磷酸二酯键。DNA连接酶在DNA复制、修复、重组、剪接中用于缝合缺口，是基因工程的重要工具酶。2．DNA的复制过程可将复制过程分为起始、延长和终止三个阶段。复制起始：识别起始点，合成引发体：在E.coli，复制起始点称为oriC,具有特定结构能够被DnaA蛋白识别结合，DnaB蛋白具有解螺旋作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白结合于起始点，DNA双链局部被打开，引物酶及其他蛋白加入，形成引发体。形成单链：DNA进行复制时，首先在拓扑异构酶作用下，使分子的超螺旋构象变化，然后在解链酶的作用下，解开双链，才能开始进行DNA的合成。解螺旋酶在蛋白因子的辅助下打开DNA双链，单链结合蛋白SSB结合于处于单链状态模板链上；拓扑异构酶使DNA分子避免打结、缠绕等，在复制全过程中起作用。合成引物：引发体中的引物酶催化合成RNA引物，由引物提供3'-OH基,使复制开始进行。前导链和后随链均由引物酶合成引物，后随链在复制中需多次合成引物。复制延长：复制方向：原核生物如E.coli,只有一个起始点oriC，两个复制叉同时向两个方向进行复制，称为双向复制。(2)链的延长：按照与模板链碱基配对的原则，在DNA聚合酶III的作用下，逐个加入脱氧核糖核酸，使链延长。由于DNA双链走向相反，DNA聚合酶只能催化核苷酸从5'—3'方向合成，领头链的复制方向与解链方向一致，可以连续复制，而另一股模板链沿5'-3'方向解开，随从链的复制方向与解链方向相反，复制只能在模板链解开一定长度后进行，因此随从链的合成是不连续的，形成的是若干个岗崎片段。DNA聚合酶I的即时校读，DNA聚合酶III的碱基选择功能，使复制具有保真性。复制终止：原核生物如E.coli,他的两个复制叉的汇合点就是复制的终点。由RNA酶切去前导链和后随链中的引物，引物留下的空隙由DNA聚合酶I催化，四种脱氧核糖三磷酸为原料自5J3'方向延长填补。最后，DNA连接酶由ATP供能，将两个不连续片段相邻的5'-P和3'-OH连接起来，成为连续的子链，复制完成。(二)、真核生物的复制真核细胞的一生可以定义为一个细胞周期，细胞增殖时，DNA通过复制使其含量成倍增加，随后细胞分裂，成为两个子代细胞，DNA将亲代的特征传递到子代。细胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，DNA的复制只发生在S期。与原核生物相比，真核生物的复制具有以下特点：1.多复制子真核生物的DNA复制也是半保留复制。染色体线性分子的复制有多个起点，每个起点由两个反向运动的复制叉组成，进行双向复制。由一个起点控制的DNA复制称为一个复制子。2.DNA聚合酶与原核生物不同，真核细胞含有5种DNA聚合酶：a、卩、丫、6和£。除了Y外，所有DNA聚合酶存在于核内。DNA聚合酶a和6在复制延长中起催化作用，DNA聚合酶a延长后随链，DNA聚合酶6延长前导链。DNA聚合酶卩和£在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。DNA聚合酶y在线粒体中，用于线粒体DNA的复制。DNA连接酶(DNAligase)DNA连接酶可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。该酶催化的条件是：①需一段DNA片段具有3'-0H,而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。单链DNA结合蛋白(singlestrandbindingprotein,SSB)又称螺旋反稳蛋白(HDP)。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为:①稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；②保护单链DNA，避免核酸酶的降解。解螺旋酶(unwindingenzyme)又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基,需消耗两分子ATP。6•拓扑异构酶(topoisomerase)拓扑异构酶可将DNA双链中的一条链或两条链切断，松开超螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。7.端粒复制端粒是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶(telomerase)的催化下，进行延长反应。端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。二、DNA的损伤与修复由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。引起DNA损伤的因素有：1．自发因素：自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌吟或嘧啶碱基的脱落。自发脱氨基：C自发脱氨基可生成U，A自发脱氨基可生成I。复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤。物理因素：由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。3．化学因素：脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U,A脱氨基生成I。烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌吟共价结合引起损伤。⑷碱基类似物：如5-FU,6-MP等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。DNA突变的类型：点突变：转换——相同类型碱基的取代。颠换——不同类型碱基的取代。插入——增加一个碱基。缺失——减少一个碱基。复突变：插入——增加一段顺序。缺失——减少一段顺序。倒位——一段碱基顺序发生颠倒。易位——一段碱基顺序的位置发生改变。重组——一段碱基顺序与另一段碱基顺序发生交换。DNA突变的效应：(1)同义突变：基因突变导致mRNA密码子第三位碱基的改变但不引起密码子意义的改变，其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变。(2)误义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，其意义发生改变，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。无义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换而改变成终止暗码子，引起多肽链合成的终止。移码突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，引起突变点之后的氨基酸残基顺序全部发生改变。6.DNA损伤的修复DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。直接修复包括光复活、转甲基作用和直接连接作用，均属于无差错修复。取代修复包括切除修复、重组修复和SOS修复，后二者属于有差错倾向修复。(1)光复活：由光复活酶识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物，在可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复。.转甲基作用：在转甲基酶的催化下，将DNA上的被修饰的甲基去除。此时，转甲基酶自身被甲基化而失活。直接连接：DNA断裂形成的缺口，可以在DNA连接酶的催化下，直接进行连接而封闭缺口。切除修复：这种修复机制可适用于多种DNA损伤的修复。该修复机制可以分别由两种不同的酶来发动，一种是核酸内切酶，另一种是DNA糖苷酶。①特异性的核酸内切酶(如原核中的UvrA、UvrB和UvrC)或DNA糖苷酶识别DNA受损伤的部位，并在该部位的5'端作一切口；②由核酸外切酶(或DNA聚合酶I)从5'-3端逐一切除损伤的单链；③在DNA聚合酶的催化下，以互补链为模板，合成新的单链片段以填补缺口；④由DNA连接酶催化连接片段，封闭缺口。错配修复：根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子代链上的错配碱基，通过一个酶系统修复DNA错配的碱基。重组修复：①DNA复制时，损伤部位导致子链DNA合成障碍，形成空缺;②此空缺诱导产生重组酶(重组蛋白RecA)，该酶与空缺区结合，并催化子链空缺与对侧亲链进行重组交换；③对侧亲链产生的空缺以互补的子链为模板，在DNA聚合酶和连接酶的催化下，重新修复缺口；④亲链上的损伤部位继续保留或以切除修复方式加以修复。SOS修复：这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，为求得生存而出现的应急效应。SOS反应能诱导切除和重组修复中有关的酶和蛋白质的产生，加强切除和重组修复的能力。SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，却带来很高的变异率，在某种情况下允许错配，以增加存活的机会。是原核和真核生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。三、DNA的反转录反转录又称逆转录，指遗传信息从RNA流向DNA。是RNA指导下的DNA合成过程，即以RNA为模板，四种dNTP为原料，合成与RNA互补的DNA单链，催化这一过程的酶称反转录酶，RNA病毒中都含有此酶。反转录酶：属RNA指导的DNA聚合酶，具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指导的DNA聚合酶。在分子生物学技术中，作为重要的工具酶被广泛用于建立基因文库、获得目的基因等工作。合成过程；RNA为模板，在反转录酶的催化下，合成与RNA互补的DNA单链，形成杂化双链，反转录酶将其中RNA链水解，在以互补的DNA链为模板，合成双链DNA。3.反转录方向：5'—3'第四章RNA的生物合成（转录）与加工（6学时）本章重点转录的反应体系，原核生物RNA聚合酶和真核生物中的RNA聚合酶的特点，RNA的转录过程大体可分为起始、延长、终止三个阶段。真核RNA的转录后加工，包括各种RNA前体的加工过程。本章难点：RNA的转录起始；mRNA的拼接。基本要点转录模板的不对称性及命名，原核生物及真核生物的转录起始，真核生物的转录终止，mRNA前体的剪接机制（套索的形成及剪接），第1、11类和第W类内含子的剪接过程，四膜虫rRNA前体的加工，核酶的作用机理。一、RNA转录合成的特点：在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录。经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA。转录的不对称性：指以双链DNA中的一条链作为模板进行转录，从而将遗传信息由DNA传递给RNA。对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。能够转录RNA的那条DNA链称为有意义链（模板链），而与之互补的另一条DNA链称为反意义链（编码链）。转录的连续性：RNA转录合成时，在RNA聚合酶的催化下，连续合成一段RNA链，各条RNA链之间无需再进行连接。转录的单向性：RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，RNA链的合成方向为5'~3。有特定的起始和终止位点：RNA转录合成时，只能以DNA分子中的某一段作为模板，故存在特定的起始位点和特定的终止位点。二、RNA转录合成的条件1．底物：四种核糖核苷酸，即ATP，GTP，CTP，UTP。2．模板：以一段单链DNA作为模板。RNA聚合酶（DDRP）：RNA聚合酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从5'—3'聚合RNA。原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成，即a2pp'coo亚基与转录起始点的识别有关，而在转录合成开始后被释放，余下的部分（a2仰'）被称为核心酶，与RNA链的聚合有关。真核生物中的RNA聚合酶分为三种：RNApoll存在于核仁，对a-鹅膏蕈碱不敏感，用于合成rRNA前体；RNApolll存在于核基质，对a-鹅膏蕈碱极敏感，用于合成HnRNA；RNApolIII存在于核基质，对a-鹅膏蕈碱敏感，用于合成tRNA前体、snRNA及5SrRNA。终止因子p蛋白：这是一种六聚体的蛋白质，能识别终止信号，并能与RNA紧密结合，导致RNA的释放。激活因子：降解产物基因激活蛋白（CAP）,又称为cAMP受体蛋白（CRP），是一种二聚体蛋白质。该蛋白与cAMP结合后，刺激RNA聚合酶与起始部位结合，从而起始转录过程。三、RNA转录合成的基本过程识别：RNA聚合酶中的o因子识别转录起始点，并促使核心酶结合形成全酶复合物。位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA顺序称为启动子。在原核生物中的启动子通常长约60bp，存在两段带共性的顺序，即5'-TTGACA-3'和5'-TATAATG-3，其中富含TA的顺序被称为Pribnow盒。真核生物的启动子中也存在一段富含TA的顺序，被称为Hogness盒或TATA盒。起始：RNA聚合酶全酶促使局部双链解开，并催化ATP或GTP与另外一个三磷酸核苷聚合，形成第一个3',5'-磷酸二酯键。延长：a因子从全酶上脱离，余下的核心酶继续沿DNA链移动，按照碱基互补原则，不断聚合RNA。终止：RNA转录合成的终止机制有两种。⑴自动终止：模板DNA链在接近转录终止点处存在相连的富含GC和AT的区域，使RNA转录产物形成寡聚U及发夹形的二级结构，引起RNA聚合酶变构及移动停止，导致RNA转录的终止。⑵依赖辅助因子的终止：由终止因子（p蛋白）识别特异的终止信号，并促使RNA的释放。四、真核生物RNA转录后的加工修饰1.mRNA的转录后加工⑴加帽：即在mRNA的5'-端加上m7GTP的结构。此过程发生在细胞核内，即对HnRNA进行加帽。加工过程首先是在磷酸酶的作用下，将5'-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化。⑵加尾：这一过程也是细胞核内完成，首先由核酸外切酶切去3'-端一些过剩的核苷酸，然后再加入polyA。⑶剪接：真核生物中的结构基因基本上都是断裂基因。结构基因中能够指导多肽链合成的编码顺序被称为外显子，而不能指导多肽链合成的非编码顺序就被称为内含子。真核生物HnRNA的剪接一般需snRNA参与构成的核蛋白体参加，通过形成套索状结构而将内含子切除掉。基本概念外显子：定义为断裂基因上及其转录初级产物上可表达的序列。或转录初级产物上通过拼接作用而保留于成熟的RNA中的核苷酸序列或基因中与成熟RNA相对应的DNA序列．内含子:早期定义为核酸上的非编码序列。随着内含子功能的被拓宽，建议用"转录初级产物上通过拼接作用而被去除的RNA序列或基因中与这种RNA序列相对应的DNA序列"较全面。拼接体：由snRNA和蛋白质组成的核糖核酸蛋白（核蛋白）复合物。其功能是结合内含子两端的边界序列，协助RNA的剪接加工。核酶（ribozyme）：具有催化功能（酶的作用）的RNA分子。核酶能起作用的结构,至少含有3个茎（RNA分子内配对形成的局部双链），1至3个环（RNA分子局部双链鼓出的单链）和至少有13个一致性的碱基位点。⑷内部甲基化：由甲基化酶催化，对某些碱基进行甲基化处理。2．tRNA的转录后加工主要加工方式是切断和碱基修饰。3.rRNA的转录后加工主要加工方式是切断。第五章蛋白质的生物合成（翻译）与转运（3学时）本章重点蛋白质合成的反应体系、三种RNA在翻译中的作用、蛋白质合成过程可分为起始、延长、终止三个阶段。原核生物翻译起始与真核生物的区别。肽链合成后的加工修饰。蛋白质的定位。本章难点遗传密码的特性、翻译起始复合物的形成、肽链延长阶段的三个步骤、蛋白质靶向输送。基本要点蛋白质的生物合成过程，就是将DNA传递给mRNA的遗传信息，再具体的解译为蛋白质中氨基酸排列顺序的过程，这一过程被称为翻译（translation）。参与蛋白质生物合成的各种因素构成了蛋白质合成体系，该体系包括：mRNA:作为指导蛋白质生物合成的模板。mRNA中每三个相邻的核苷酸组成三联体，代表一个氨基酸的信息，此三联体就称为密码。共有64种不同的密码。遗传密码具有以下特点：①连续性；②简并性；③通用性；④方向性；⑤摆动性；⑥起始密码：AUG；终止密码：UAA、UAG、UGA。tRNA:在氨基酸tRNA合成酶催化下，特定的tRNA可与相应的氨基酸结合，生成氨基酰tRNA，从而携带氨基酸参与蛋白质的生物合成。tRNA反密码环中部的三个核苷酸构成三联体，可以识别mRNA上相应的密码，此三联体就称为反密码。反密码对密码的识别，通常也是根据碱基互补原则，即A—U，G—C配对。但反密码的第一个核苷酸与第三核苷酸之间的配对，并不严格遵循碱基互补原则，这种配对称为不稳定配对。能够识别mRNA中5,端起动密码AUG的tRNA称为启使tRNA。在原核生物中，启使tRNA是tRNAfmet；而在真核生物中，启使tRNA是tRNAmet。3．rRNA和核蛋白体原核生物中的核蛋白体大小为70S,可分为30S小亚基和50S大亚基。真核生物中的核蛋白体大小为80S,也分为40S小亚基和60S大亚基。核蛋白体的大、小亚基分别有不同的功能：⑴小亚基：可与mRNA、GTP和起动tRNA结合。⑵大亚基：具有两个不同的tRNA结合点。A位——受位或氨酰基位,可与新进入的氨基酰tRNA结合；P位给位或肽酰基位，可与延伸中的肽酰基tRNA结合。具有转肽酶活性。在蛋白质生物合成过程中,常常由若干核蛋白体结合在同一mRNA分子上,同时进行翻译。由若干核蛋白体结合在一条mRNA上同时进行多肽链的翻译所形成的念球状结构称为多核蛋白体。4.起动因子（IF）是一些与多肽链合成起动有关的蛋白因子。原核生物中存在3种起动因子,分别称为IF1-3。在真核生物中存在9种起动因子（eIF）。其作用主要是促进核蛋白体小亚基与起动tRNA及模板mRNA结合。延长因子（EF）：原核生物中存在3种延长因子（EFTU,EFTS,EFG）,真核生物中存在2种（EF1,EF2）。其作用主要促使氨基酰tRNA进入核蛋白的受体,并可促进移位过程。释放因子（RF）：原核生物中有4种，在真核生物中只有1种。其主要作用是识别终止密码,协助多肽链的释放。7．氨基酰tRNA合成酶该酶存在于胞液中，与特异氨基酸的活化以及氨基酰tRNA的合成有关。每

种氨基酰tRNA合成酶对相应氨基酸以及携带氨基酸的数种tRNA具有高度特异性。二、蛋白质生物合成过程1．氨基酸的活化与搬运：氨基酸的活化以及活化氨基酸与tRNA的结合，均由氨基酰tRNA合成酶催化完成。反应完成后，特异的tRNA3'端CCA上的2'或3'位自由羟基与相应的活化氨基酸以酯键相连接，形成氨基酰tRNA。2．活化氨基酸的缩合——核蛋白体循环：活化氨基酸在核蛋白体上反复翻译mRNA上的密码并缩合生成多肽链的循环反应过程，称为核蛋白体循环。核蛋白体循环过程可分为三个阶段：⑴起动阶段：①30S起动复合物的形成。在IF促进下，30S小亚基与mRNA的起动部位，起动tRNA(tRNAfmet),和GTP结合，形成复合体。②70S起动前复合体的形成。IF3从30S起动复合体上脱落，50S大亚基与复合体结合，形成70S起动前复合体。③70S起动复合体的形成。GTP被水解，IF1和IF2从复合物上脱落。⑵肽链延长阶段：进位：与mRNA下一个密码相对应的氨基酰tRNA进入核蛋白体的受位。此步骤需GTP，Mg2+,和EF参与。②成肽：在转肽酶的催化下，将给位上的tRNA所携带的甲酰蛋氨酰基或肽酰基转移到受位上的氨基酰tRNA上，与其a-氨基缩合形成肽键。给位上已失去蛋氨酰基或肽酰基的tRNA从核蛋白上脱落。③移位：核蛋白体向mRNA的3'-端滑动相当于一个密码的距离，同时使肽酰基tRNA从受体移到给位。此步骤需EF(EFG)、GTP和Mg2+参与。此时，核蛋白体的受位留空，与下一个密码相对应的氨基酰tRNA即可再进入，重复以上循环过程，使多肽链不断延长。⑶肽链终止阶段：核蛋白体沿mRNA链滑动，不断使多肽链延长，直到终止信号进入受位。识别：RF识别终止密码，进入核蛋白体的受位。水解：RF使转肽酶变为水解酶，多肽链与tRNA之间的酯键被水解，多肽链释放。③解离：通过水解GTP,使核蛋白体与mRNA分离，tRNA、RF脱落，核蛋白体解离为大、小亚基。三、多肽链合成后的加工修饰1．一级结构的加工修饰：(1)N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸是多肽链合成的起始氨基酸，必须在多肽链折迭成一定的空间结构之前被切除。其过程是：去甲酰化；去蛋氨酰基。⑵氨基酸的修饰：由专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、羟基化、磷酸化、甲酰化等。⑶二硫键的形成：由专一,性的氧化酶催化，将-SH氧化为-S-S-。⑷肽段的切除：由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。2．高级结构的形成⑴构象的形成：在分子内伴侣、辅助酶及分子伴侣的协助下，形成特定的空间构象。⑵亚基的聚合。⑶辅基的连接。3．靶向输送蛋白质合成后，定向地被输送到其执行功能的场所称为靶向输送。大多数情况下，被输送的蛋白质分子需穿过膜性结构，才能到达特定的地点。因此，在这些蛋白质分子的氨基端，一般都带有一段疏水的肽段，称为信号肽。分泌型蛋白质的定向输送，就是靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）识别并特异结合，然后再通过SRP与膜上的对接蛋白（DP）识别并结合后，将所携带的蛋白质送出细胞。第六章基因表达调控(4+5学时)本章重点基因表达调控的基本概念、特点、基本原理。乳糖操纵子的结构、负性调控、正性调控、协调调节、转录衰减。真核基因及基因表达调控的特点、顺式作用元件和反式作用因子的概念、种类和特点.以及它们在转录激活中的作用。本章难点操纵子的结构；负性调控；正性调控；协调调节；转录衰减。基本要点一、基因表达调控基本概念与原理基因表达的概念：基因表达(geneexpression)是基因转录成RNA再翻译成蛋白质的过程。对rRNA、tRNA基因来说，其表达就是基因的转录。基因表达的时间性及空间性⑴时间特异性：基因表达的时间特异性(temporalspecificity)是指特定基因的表达严格按照特定的时间顺序发生，以适应细胞或个体特定分化、发育阶段的需要。故又称为阶段特异性。⑵空间特异性：基因表达的空间特异性(spatialspecificity)是指多细胞生物个体在某一特定生长发育阶段，同一基因的表达在不同的细胞或组织器官不同，从而导致特异性的蛋白质分布于不同的细胞或组织器官。故又称为细胞特异性或组织特异性。基因表达的方式⑴组成性表达：组成性基因表达(constitutivegeneexpression)是指在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达。其基因表达产物通常是对生命过程必需的或必不可少的，且较少受环境因素的影响。这类基因通常被称为管家基因(housekeepinggene)。⑵诱导和阻遏表达诱导表达(induction)是指在特定环境因素刺激下，基因被激活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。阻遏表达(repression)是指在特定环境因素刺激下，基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。4．基因表达的生物学意义：适应环境、维持生长和增殖。维持个体发育与分化。5．基因表达调控的基本原理⑴基因表达的多级调控：基因表达调控可见于从基因激活到蛋白质生物合成的各个阶段，因此基因表达的调控可分为转录水平(基因激活及转录起始)，转录后水平(加工及转运)，翻译水平及翻译后水平，但以转录水平的基因表达调控最重要。⑵基因转录激活调节基本要素：顺式作用元件：顺式作用元件(cis-actingelement)又称分子内作用元件，指存在于DNA分子上的一些与基因转录调控有关的特殊顺序。反式作用因子：反式作用因子(trans-actingfactor)又称为分子间作用因子，指一些与基因表达调控有关的蛋白质因子。反式作用因子与顺式作用元件之间的共同作用，才能够达到对特定基因进行调控的目的。顺式作用元件与反式作用因子之间的相互作用：大多数调节蛋白在与DNA结合之前，需先通过蛋白质-蛋白质相互作用，形成二聚体或多聚体，然后再通过识别特定的顺式作用元件，而与DNA分子结合。这种结合通常是非共价键结合。二、操纵子的结构与功能在原核生物中，若干结构基因可串联在一起，其表达受到同一调控系统的调控，这种基因的组织形式称为操纵子。典型的操纵子可分为控制区和信息区两部分。信息区由一个或数个结构基因串联在一起组成；控制区通常由调节基因（阻抑蛋白编码基因）、启动基因（CRP和RNA聚合酶结合区）和操纵基因（阻抑蛋白结合位点）构成。1．原核生物乳糖操纵子：原核生物乳糖操纵子（Lacoperon）的控制区包括调节基因，启动基因（其CRP结合位点位于RNA聚合酶结合位点上游）和操纵基因；其信息区由0半乳糖苷酶基因（lacZ）,通透酶基因（lacY）和乙酰化酶基因（lacA）串联在一起构成。当培养基中乳糖浓度升高而葡萄糖浓度降低时，乳糖作为诱导剂与阻抑蛋白结合，促使阻抑蛋白与操纵基因分离；另一方面，细胞中cAMP浓度升高，cAMP与CRP结合并使之激活,CRP与启动基因结合并促使RNA聚合酶与启动基因结合,基因转录激活。2．原核生物色氨酸操纵子：色氨酸操纵子（trpoperon）属于阻遏型操纵子，主要调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。色氨酸操纵子通常处于开放状态，其辅阻遏蛋白不能与操纵基因结合而阻遏转录。而当色氨酸合成过多时，色氨酸作为辅阻遏物与辅阻遏蛋白结合而形成阻遏蛋白，后者与操纵基因结合而使基因转录关闭。色氨酸操纵子的调控还涉及转录衰减（attenuation）机制。即在色氨酸操纵子第一个结构基因与启动基因之间存在有一衰减区域，当细胞内色氨酸酸浓度很高时，通过与转录相偶联的翻译过程，形成一个衰减子结构，使RNA聚合酶从DNA上脱落，导致转录终止。3．原核生物转录的整体调控模式：由成群的操纵子组成的基因转录调控网络称为调节子。通过组成调节子调控网络，对若干操纵子及若干蛋白质的合成进行协同调控，从而达到整体调控的目的。典型的整体调控模式是SOS反应，这是由一组与DNA损伤修复有关的酶和蛋白质基因组成。在正常情况下，这些基因均被LexA阻遏蛋白封闭。当有紫外线照射时，细菌体内的RecA蛋白水解酶被激活，催化LexA阻遏蛋白裂解失活，从而导致与DNA损伤修复有关的基因表达。三、真核基因组结构特点转录产物为单顺反子：真核基因的转录产物一般是单顺反子(mono-cistron),即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，并指导翻译一条多肽链。2．大量重复序列：真核基因组中含大量的重复序列，这些重复序列大部分是没有特定生物学功能的DNA片段，可占整个基因组DNA的90%。根据重复频率可将其分为高度重复序列、中度重复序列和单拷贝序列。3．断裂基因：真核生物中的基因具有不连续性，即一个基因的编码序列往往被一些非编码序列分隔开。基因中能够转录并进一步编码多肽链合成的部分称为外显子(exon)，而在转录后会被剪除的部分则称为内含子(intron)。三、真核基因表达调控的特点RNA聚合酶活性受转录因子调控：真核生物中存在RNApolI、II、III三种不同的RNA聚合酶，分别负责转录不同的RNA。这些RNA聚合酶与相应的转录因子形成复合体，从而激活或抑制该酶的催化活性。染色质结构改变参与基因表达的调控：真核生物DNA与组蛋白结合并形成核小体的结构，再进一步形成染色质。当真核基因被激活时，染色质的结构也随之发生改变。主要的改变有：⑴单链DNA形成：基因被激活后，双链DNA解开成单链以利于转录，从而形成一些对DNAaseI的超敏位点。(2)DNA拓朴结构改变：天然双链DNA均以负性超螺旋构象存在，当基因激活后，则转录区前方的DNA拓朴结构变为正性超螺旋。正性超螺旋可阻碍核小体形成，并促进组蛋白解聚。⑶核小体不稳定性增加：由于组蛋白修饰状态改变，巯基暴露等原因而引起核小体结构改变。3．正性调节占主导：真核基因一般都处于阻遏状态，RNA聚合酶对启动子的亲和力很低。通过利用各种转录因子正性激活RNA聚合酶是真核基因调控的主要机制。4．转录和翻译过程分别进行：转录与翻译过程分别存在于不同的亚细胞部位，可分别进行调控。5.转录后加工修饰过程复杂：特别是mRNA，转录后仅形成其初级转录产物——HnRNA,然后再经剪接、加帽、加尾等加工修饰，才能转变为成熟的mRNA。四、真核基因转录调控元件及激活机制1．顺式作用元件（分子内作用元件）：⑴启动子存在于结构基因上游，与基因转录启动有关的一段特殊DNA顺序称为启动子。与原核生物类似，也含有一段富含TATA的顺序，称为TATA盒。除此之外,还可见CAAT盒和GC盒。⑵增强子能够增强该基因转录活性的一段DNA顺序称为增强子。增强子的特点是：在转录起始点5'或3'侧均能起作用；相对于启动子的任一指向均能起作用；发挥作用与受控基因的远近距离相对无关；对异源性启动子也能发挥作用；通常具有一些短的重复顺⑶沉默子能够对基因转录起阻遏作用的DNA片段，属于负性调控元件。2．反式作用因子(分子间作用因子)真核生物反式作用因子通常属于转录因子(transcriptionfactor，TF)。转录因子的种类非特异性转录因子(基本转录因子)非选择性调控基因转录表达的蛋白质因子称为非特异性转录因子。真核生物中存在的三种RNA聚合酶分别有相应的转录因子，即TFI/TFH,TFIII。其中，TFII—共有六种亚类。TFIID是唯一能识别启动子TATA盒并与之结合的转录因子，而TFIIB则可促进聚合酶II与启动子的结合。特异性转录因子：能够选择性调控某种或某些基因转录表达的蛋白质因子称为特异性转录因子。目前较清楚的是调控免疫球蛋白基因表达的核内蛋白质因子(NF)。转录因子的结构反式作用因子至少含有三个功能域，即DNA结合功能域，转录活性功能域和其它转录因子结合功能域。DNA结合功能域带共性的结构主要有：HTH和HLH结构：由两段a-螺旋夹一段卜折迭构成，a-螺旋与卜折迭之间通过卩-转角或成环连接，即螺旋-转角-螺旋结构和螺旋-环-螺旋结构。锌指结构：见于TFIIIA和类固醇激素受体中，由一段富含半胱氨酸的多肽链构成。每四个半光氨酸残基或His残基螯合一分子Zn2+，其余约12-13个残基则呈指样突出，刚好能嵌入DNA双螺旋的大沟中而与之相结合。亮氨酸拉链结构：见于真核生物DNA结合蛋白的C端，与癌基因表达调控有关。由两段a-螺旋平行排列构成，其a-螺旋中存在每隔7个残基规律性排列的Leu残基，Leu侧链交替排列而呈拉链状。两条肽链呈钳状与DNA相结合。⑶转录因子的作用特点同一DNA顺式作用元件可被不同的转录因子所识别；同一转录因子也可识别不同的DNA顺式作用元件；TF与TF之间存在相互作用；当TF与TF，TF与DNA结合时，可导致构象改变；TF在合成过程中，有较大的可变性和可塑性。3．转录激活及其调控真核RNA聚合酶II的激活需要依赖多种转录因子，并与之形成复合体。其过程首先是由TFID识别启动子序列并与之结合;继而RNA聚合酶II与TFIID、B等聚合形成一个功能性的前起始复合体一一PIC；最后，结合了增强子的转录因子与前起始复合体结合，从而形成稳定的转录起始复合体。第七章基因重组与基因工程（4学时）本章重点掌握：DNA克隆概念，限制性内切酶的定义及其特点，基因载体的种类。重组DNA技术的基本过程，目的基因获取的方法，外源基因与载体的连接方式，重组DNA分子导入受体菌的方式，重组体筛选的方法。熟悉：基因组DNA文库和cDNA文库的概念，目的基因表达体系的种类及其特点。了解：自然界基因转移的方式：接合作用、转化及转导作用、转座；重组有两种类型，即位点特异性的重组和同源重组。本章难点两种类型基因重组的机理；限制性内切酶的作用特点，基因载体的种类；重组DNA技术的基本环节中，目的基因的获取方法，外源基因与载体连接的方法，重组DNA导入受体菌的方法，重组体的筛选方法，以及原核和真核表达体系的优缺点比较一、自然界的基因转移和重组自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种进化的基础。自然界的基因转移的方式有：接合作用：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌），这种类型的DNA转移称为接合作用（conjugation）。转化作用（transformation）：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。转导作用（transduction）:当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。转座：大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。由插人序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。基因重组：在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。基因重组包括位点特异性的重组和同源重组两种类型。有整合酶催化的在两个DNA序列特异位点间发生的整合，产生位点特异的重组。特异重组依赖特异的DNA序列，如久噬菌体的整和酶可识别噬菌体DNA和宿主染色体的特异靶位点，并进行选择性整合；反转录病毒整合酶识别整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列等。另外有发生在同源序列间的同源重组，又称基本重组。同源重组依赖两分子间序列的相同或相似性，将外源DNA整合进宿主染色体。二、重组DNA技术相关概念DNA克隆(DNAcloning)应用酶学的方法，在体外把目的基因与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。由于早期研究是从较大的染色体分离、扩增特异性基因，因此DNA克隆又称基因克隆(genecloning)。工具酶在重组DNA技术即基因工程技术中需应用某些基本酶类进行基因操作，称为工具酶。常用的工具酶包括如DNA聚合酶I、DNA连接酶、末端转移酶、反转录酶、多聚核苷酸激酶，而限制性核酸内切酶特别重要，应用最广。限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)是能够识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性内切核酸酶存在于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制一修饰体系，限制外源DNA、保护自身DNA，对细菌遗传性状的稳定遗传具有重要意义。目前发现的限制性内切核酸酶有1800种以上。限制性内切核酸酶分为三类。重组DNA技术中常用的限制性内切核酸酶为II类酶，例如，EcoRI、BamHI等就属于这类酶。大部分II类酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称,通常称这种特殊的结构顺序为回文结构(Palindrome)。所有限制性内切核酸酶切割DNA均产生含5'磷酸基和3'羟基基团的末端。限制性内切核酸酶的特点：识别DNA的特异序列并切割；不同的酶识别核苷酸序列往往包含4个到6个核苷酸；不同的酶切割DNA频率不同；④可产生粘性或钝性未端；带有相同类型的粘性末端或钝性末端的DNA都可以再相互连接。3．目的基因基因工程中常为分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，或为得到感兴趣的基因的蛋白质表达产物，这种感兴趣的基因或DNA序列称为目的基因。目的基因可来自cDNA和基因组DNA。cDNA(complementaryDNA)是指以mRNA或病毒RNA经反转录酶催化合成互补单链DNA，再聚合生成的双链cDNA；基因组DNA(genomicDNA)则指代表一个细胞或生物体全套遗传信息的所有DNA序列。4．基因载体基因载体，又称克隆载体，是指用以携带外源目的基因，实现外源DNA克隆或/和表达为有意义蛋白质而利用的DNA分子。能使插入的外源DNA序列可被转录并翻译成多肽链而专门设计的基因载体又称表达载体。常用基因载体包括质粒、噬菌体、病毒DNA等。理想载体有独立复制能力，能够利用宿主酶系转录和翻译，有多种限制性内切酶单一切口及一定筛选标记，如质粒的抗药性基因。①质粒（plasmid）存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。能在宿主细胞独立自主地进行复制，会赋予宿主细胞一些遗传性状，如对抗生素或重金属的抗性等。质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，是筛选转化子细菌的根据。噬菌体DNA常用作基因载体的噬菌体DNA有久噬菌体、M13噬菌体，经M13噬菌体改造的载体含不同位置的克隆位点，可接受不同限制性内切酶切片段。另外还有可插入大片段外源基因的柯斯质粒载体、酵母人工染色体（YAC）载体，用于真核基因表达的腺病毒载体和逆转录病毒载体等。三、重组DNA技术基本原理DNA克隆过程包括：目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目的基因与载体的连接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。目的基因的获取常用的方法：化学合成法；基因组DNA文库；cDNA文库；聚合酶链反应。克隆载体的选择和构建：将外源DNA连到复制子上，外源DNA则可作为复制子的一部分在受体细胞中复制。这种复制子就是克隆载体。外源基因与载体的连接：粘性末端连接：包括同一限制酶切割位点连接和不同限制性内切酶位点连接；平端连接；同聚物加尾连接；人工接头连接。重组DNA导入受体菌：导入重组DNA分子的方法有：转化(transformation)；转染(transfectim)；感染(infection)等；受体细胞为细菌时，常采用电穿击法、热击法等。重组体的筛选：根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取直接选择法和非直接选择法。直接选择法，指对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法，其特点是直接测定基因或基因表型；抗药性标志选择，标志补救，分子杂交法；免疫学方法不是直接鉴定基因，而是利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选，因此属非直接选择法。免疫学方法特异性强、灵敏度高，尤其适用于选择不为宿主菌提供任何选择标志的基因。免疫学方法又可根据具体基因选择操作过程不同，分为免疫化学方法及酶免检测分析等。克隆基因的表达：目的基因的表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的建立及表达产物的分离、纯化等技术和策略。表达体系包括：原核表达体系；真核表达体系。E.coli是当前采用最多的原核表达体系，其优点是培养方法单、迅速、经济而又适合大规模生产工艺。在实际工作中，根据表达的基因不同，选择不同的表达策略。E.coli表达体系在实际应用中尚有一些不足之处：由于缺乏转录后加工机制；由于缺乏适当的翻译后加工机制；表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理；很难在Ecol表达体系表达大量的可溶性蛋白。真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优越性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达克隆的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA；哺乳类细胞表达的蛋白质通常总是被适当修饰，而且表达的蛋白质会恰当地分布在细胞内一定区域并积累。哺乳类动物细胞表达体系的缺点是操作技术难、费时、不经济。常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染；DEAE葡聚糖介导转染；电穿孔；脂质体转染及显微注射等。当前采用最多的哺乳类细