分子医学与分子医学技术14

会计学1分子医学与分子医学技术14分子医学概述第1页/共105页生命的螺旋第2页/共105页第3页/共105页1994年2月，美国国立卫生研究院((NIH)卡普((Karp),布罗德((Broder)《癌研究》

“分子医学的新方向”第4页/共105页1994年9月,《Nature》杂志“分子医学研讨会”

“分子医学的挑战”

第5页/共105页1995年

,美国《分子医学》杂志正式创刊

标志着现代生物医学进入分子医学新阶段

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根据卡普等的定义，分子医学的内容包括:发现控制正常细胞行为的基本分子

弄清基因异常与疾病发生的关系

通过检查和纠正这些异常基因对疾病进行诊断、治疗和预防

分子医学与传统医学的主要不同在于前者对疾病的认识和操作都是在分子和基因水平上进行的。

第7页/共105页分子医学的基本内容:疾病的分子机理

疾病的基因诊断

疾病的基因治疗

疾病的基因预防

分子医学的社会、伦理问题

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维多利亚女王与尼古拉二世第10页/共105页第11页/共105页

1949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。

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疾病的基因诊断

从广义上讲，大多数疾病都可以从遗传物质的变化中寻找出原因。而从技术上看，只要找到了与疾病相关的基因，基因诊断便立即可以实现。随着“人类基因组计划”的进程，将大大加快疾病相关基因的发现与克隆，基因诊断将成为疾病诊断的常规方法。

单基因疾病的诊断：一般可在临床症状出现之前作出诊断，不依赖临床表型；有遗传倾向的疾病：易感基因的筛查，如高血压，冠心病，肥胖等。

外源性病源体：如病毒、细菌、寄生虫等引起的传染病，

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美国前副总统汉弗莱<Humphrey)在1967年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞良性“慢性增生性囊肿”，未进行手术治疗。九年后，他被诊断为患有“膀胧癌”，两年后死于该病。

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1994年，研究者用灵敏的PCR技术对上述汉弗莱1967年的病理切片进行了P53抑癌基因检查，发现那时的组织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其P53基因的第227个密码子已经发生了一个核苷酸的突变。就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出来了第16页/共105页第17页/共105页第18页/共105页第19页/共105页第20页/共105页第21页/共105页第22页/共105页第23页/共105页

1990年沃尔夫（WOff）等发现，将带有甲型流感病毒核蛋白编码基因的质粒注射到小鼠肌肉内，可使小鼠能经受致死剂量的甲型流感病毒的攻击。这种裸露的DNA通过滴鼻和肠道也可以进人细胞，并获得成功的保护性免疫。这种具有疫苗作用的裸露DNA称之为“基因疫苗”（genevaccine）。

疾病的基因预防第24页/共105页

基因疫苗不仅可用于病毒感染，还可用于防治肿瘤，其主要优点为可以诱导很有效的专一性T杀伤性细胞，后者可以杀死肿瘤细胞。基因疫苗的安全性极高，一是无直接副作用，二是无间接副作用，不存在对人体的毒性，机体耐受性好，输注疫苗不引起其它疾患。1995年4月，经美国FDA批准进行了首例应用基因疫苗的人体临床试验。因而，可以看到其实际应用已指日可待了。第25页/共105页爱滋病基因疫苗

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分子医学与传统医学最根本的区别在于前者可在基因水平上对疾病进行操作。对遗传物质的操作可能引发的后果一开始就是科学界和公众关注的问题。早在70年代初，基因重组技术刚开始出现的时候，以美国著名分子生物学家伯格（Berg）为首的11名科学家共同呼吁禁止开展基因工程的研究，并得到了美国国立卫生研究院的赞同。

分子医学的社会、伦理问题第31页/共105页

科学家们对自己的研究工作可能产生的严重后果公开唤起公众的注意，这在科学史上还是第一次，说明科学家对遗传物质的操作所取的态度是极其谨慎的。在那以后，利用基因工程技术在大肠杆茵中生产预定的蛋白质分子被证明是无害可行的，因而在80年代以来得到了迅速的发展，但将基因操作直接应用于人类疾病的治疗则与一般的基因工程不可同日而语。

第32页/共105页分子医学常用技术第33页/共105页第34页/共105页第35页/共105页基因获取基因检测基因重组基因表达基因标记基因探测基因转移基因信息第36页/共105页基因获取第37页/共105页

获取目标基因常常是基因操作的首要步骤。常规方法有PCR法，基因文库或cDNA文库法以及化学合成法。应根据具体的研究目的和实验条件选用合适的方法。

第38页/共105页化学合成法较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物测序引物定点突变核酸杂交探针第39页/共105页基因文库限制性内切酶……克隆、转化、培养、鉴定基因组DNA基因文库第40页/共105页第41页/共105页引物引物3’5’5’5’PCR技术基因组第42页/共105页第43页/共105页引物设计：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制第44页/共105页PCR技术的基本过程模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循环仪94oC5’94℃55℃72℃第45页/共105页加样孔电泳图谱PCRPT-PCRDNAMarker第46页/共105页基因检测第47页/共105页

对一个基因或一段DNA片段进行检测鉴定是分子医学技术中最常用到的手段。包括电泳检测、序列分析、分光光度分析等方法。第48页/共105页DNA分子的电泳检测电泳条带加样孔第49页/共105页凝胶浓度与DNA片段大小电压、电流与分辨率电泳缓冲液、上样缓冲液电泳的时间与环境温度凝胶板的制备第50页/共105页

法国VL凝胶成像系统第51页/共105页核酸定量和纯度分析共轭双键：对260nm波长紫外光有较强吸收。消光系数波长220240260280300

第52页/共105页BECKMANDU800核酸蛋白检测仪

第53页/共105页DNA序列检测第54页/共105页基因重组与基因工程第55页/共105页

基因重组技术作为分子医学中最重要、最基本的技术之一，是许多分子医学实验实施的基础，在基因诊断、治疗和预防中具有举足轻重的意义。第56页/共105页第57页/共105页

现代基因工程的创始人P·伯格（美国,1926－）在1960年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？1972年，伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。第58页/共105页1973年，美国斯坦福大学教授S·科恩和加州大学旧金山分校教授H·W·博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。第59页/共105页

科恩随后以DNA重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。

1977年，吉尔伯特（W·Gilbert）分别将编码胰岛素和干扰素的DNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。

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基因工程问世后的短短30年间，不仅催生了一个又一个基因工程的新成果，也催生了一个源于DNA研究的新兴产业，导致众多的生命科学高技术企业应运而生。到2001年年初，美国生物技术公司已有1400家，而这一数字还不包括为数更多的相关技术公司和传统制药公司，2000年底美国生物技术产业的收入达到250亿美元。可以毫不夸张地说，基因工程对生物、医药和农业等领域都产生了革命性的影响，它对人们生活影响的深度和广度早已超出了人们的想象。

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淡绿、橘黄、浅红、金黄……用这些天然彩色蚕茧丝无需染色而织成色彩斑斓的绸缎，兼具华美外观和环保内质。通过基因重组法选育高产彩色茧蚕品种获成功。第62页/共105页

玫瑰的栽培历史可以追溯到5000年前，但通过色素呈现出蓝色的玫瑰却从来没有过。从蓝色三叶草中提取制造蓝色色素的基因，然后注入到玫瑰中，并成功地让翠雀花素单独显色。

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目的基因基因载体重组体分切接转筛总体技术路线第64页/共105页分:

第65页/共105页切:

限制性内切酶

“分子手术刀”

限制性酶活性缓冲液甲基化底物性状第66页/共105页

“分子剪刀”的发现者第67页/共105页接:

DNA连接酶

“分子针线”第68页/共105页转:

第69页/共105页筛:

基因载体宿主细胞克隆位点第70页/共105页第71页/共105页基因表达第72页/共105页大肠杆菌SS蛋白重组体+SS基因第73页/共105页1E.coli表达体系优势：一种成熟的基因克隆表达的受体细胞繁殖迅速，培养代谢易于控制易于进行遗传操作和高效表达第74页/共105页不足之处：1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。第75页/共105页2目的基因高效表达三个因素：强化蛋白质的生物合成抑制蛋白质的降解恢复蛋白质的空间构象第76页/共105页3目的基因表达产物的检测1）蛋白质的PAGE对照样品Marker第77页/共105页2）表达蛋白生物学功能检测淀粉酶基因表达第78页/共105页4目的蛋白的分离纯化分子筛亲和柱离子交换抗原抗体目的蛋白第79页/共105页安玛西亚快速蛋白纯化仪（FPLC）

第80页/共105页基因探测第81页/共105页核酸标记：同位素标记非同位素标记核酸探针：探针是一段人工合成的碱基序列，连接上一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用探针到基因混合物中识别特定基因核酸杂交：探测基因所依据的最基本的理论就是核酸碱基互补原则，最常用的方法就是核酸分子杂交，它应用一段与目标基因碱基互补的核酸作为探针去探测待测样品第82页/共105页

第83页/共105页DNA聚合酶Ⅰ-32P-dNTPDNA缺口平移第84页/共105页5’-CCCCAAOHCCCAACCCCAACCCCAAOHCCCAA3’3’-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT5’DNA聚合酶Ⅰ5‘3’聚合酶5‘3’外切酶5’5’第85页/共105页5’-CCCCAACCC……3’-GTTGGG……末端标记物-32P-dNTP5’-CCCCAACCC……3’-GGGGTTGGG……第86页/共105页基因芯片（Genechip）

基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列。它高度集成成千上万的网格状密集排列的核酸分子（也叫分子探针）。基因芯片能快速破译人类基因组和检测基因突变，目前，该技术主要应用于基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。它的出现给分子生物学、细胞生物学及医学领域带来新的革命，成为后基因时代最重要的基因功能分析技术之一。第87页/共105页第88页/共105页应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌相关基因表达第89页/共105页DNA微点阵已广泛和流行的用于疾病诊断、基因组比较、以及新型癌症的分类。第90页/共105页基因转移第91页/共105页

转基因生物是指用实验方法导入的外源基因在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突破，全世界已申请的工程动物专利达到80多项。

第92页/共105页第93页/共105页第94页/共105页

克隆羊“多利”第95页/共105页第96页/共105页基因测序与信息技术第97页/共105页第98页/共105页第99页/共105页第100页/共105页第101页/共105页第102页/共105页

DNA双螺旋结构体现着一种与和谐的大自然之美交相辉映的科学之美。DNA是螺旋状的，生命科学的探索之路也是螺旋的。人体自身和大千世界还有数不清的未解之谜，正等待着人们进行探索。让我们续写和创造永无止境的螺旋之美。第103页/共105页mYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#o#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#o#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7