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(病原免疫实验课件)实验四MTT比色法检测小鼠脾脏NK细胞活性（MTT比色法检测小鼠脾脏NK细胞活性）原理：1、制备小鼠脾细胞（含NK细胞）2、NK细胞与肿瘤细胞（YAC-1）共孵育，NK活性越强，肿瘤细胞被杀死越多。3、MTT底物可被活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶还原成蓝紫色产物，死细胞无此功能；活细胞越多，颜色越深；据此推断活细胞或死细胞的多少。4、经酶标仪比色后，可计算出NK细胞活性。2、效应细胞（脾NK细胞）制备（1）脱颈椎处死小鼠，放入中号平皿；（2）酒精棉球消毒，无菌取出脾脏，放入小平皿；（3）脾脏用Hanks液冲洗一次；（4）轻轻拉碎脾脏，并悬浮于约3mlHanks液中；稍倾斜静置5分钟，使大块组织沉降；（5）吸上清过120目或200目滤网，滤液滤入试管；（6）滤液1500转/min离心5min，倒去上清；

（7）脾细胞沉淀用Hanks液洗2次（加入3mlHanks液，混匀，1500r/min，离心5min，倒去上清；重复上述步骤1次）；（8）用1ml1640培养液溶解脾细胞沉淀，混匀，配成脾细胞悬液（原液），计数（吸取20ul加入780ul白细胞稀释液中，稀释40倍，用血球计数板在显微镜下计数，根据P53页公式计算脾细胞悬液原液中脾细胞浓度）；（9）吸取一定量脾细胞悬液原液，用1640培养液配制2×106/ml浓度的脾细胞悬液1毫升至2毫升，待用。3、细胞毒试验按表7-3加样，

4、孵育二氧化碳培养箱孵育2小时；加MTT，继续孵育2小时。5、测OD值轻轻吸弃上清，加二甲亚砜150ul，振荡5min，静置5min，测OD值。6、结果分析

表7-3MTT法测NK细胞活性试验各组成分(3复孔/组)实验组靶细胞对照组效应细胞对照组空白对照靶细胞100ul100ul————效应细胞100ul——100ul——1640培养基——100ul100ul200ul（1-实验组OD值-效应细胞对照组OD值靶细胞对照组OD值）×100%NK细胞活性（%）=（1-实验组OD值-效应细胞对照组OD值靶细胞对照组OD值）×100%NK细胞活性（%）=附：P53细胞计数公式

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