《食品酶学》第2章 酶的分离纯化精制

?食品酶学?第2章酶的别离纯化(精制)酶的提取和别离纯化是指将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开，而获得与使用目的要求相适应的有一定纯度的酶产品。酶的别离纯化方法包括细胞破碎、酶的提取、离心别离、过滤与膜别离、沉淀别离、层析别离、电泳别离、酶的结晶、浓缩与枯燥等。(1)机械捣碎法利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切片将组织细胞破碎。转速可达10000r/min。常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞破碎，也可用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。此法在实验室和生产规模均可采用。(2)研磨法利用研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎。必要时可参加精制石英砂、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂，以提高研磨效果。研磨法设备简单，可用人力操作也可电动操作，但效率较低。(3)匀浆法利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成，也可由硬质塑料或不锈钢等制成。通常用来破碎那些易于分散，比较柔软，颗粒细小的组织细胞。大块的组织或细胞团需先用组织捣碎机或研磨器捣碎分散以后才能进行匀浆。匀浆器的细胞破碎程度较高，其机械切利对酶的破坏也较少，但难于在工业生产上应用。2.物理破碎法定义：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。分类：温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法(1)温度差破碎法通过温度的突然变化使细胞破碎。例如将冷冻的细胞突然放进高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。温度差破碎法对那些较脆弱易碎的细胞破碎效果较好，一般使用与对数生长期的细胞效果较好。但在酶的提取时，不能在过高或过低的温度下操作，以免酶的失活。此法难以用于工业化生产。(2)压力差破碎法通过压力的突然变化使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压和渗透压差等方法。〔3〕超声波破碎法通常人的耳朵可听到的声音频率范围为16至20kHz的波称之为超声波。在超声波作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎。超声波破碎在实验室应用具有简便、快捷、效果好等特点，特别适用于微生物细胞的破碎。但要在大规模工业生产中应用，困难很多。3.化学破碎法定义：化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方法。常用的化学试剂可分为有机溶剂和外表活性剂两大类。分类：有机溶剂处理、外表活性剂处理。〔1〕有机溶剂处理常用的有机溶剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，改变系薄膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。〔2〕外表活性剂处理外表活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜的通透性。外表活性剂处理法对膜结合酶的提取特别有效，在实验室和生产中均已成功使用。4.酶学破碎法定义：在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用，使细胞破碎。分类：外加酶处理、自溶法。(1)外加酶处理根据细胞外层结构的特点，选用适当的酶，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破碎。由于溶菌酶的酶价格较高，而外加酶本身混入细胞破碎液中称为杂质。外加溶菌酶的方法难以用于大规模工业生产。〔2〕自溶法将细胞在一定的pH值和适当的温度条件下保温一段时间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏,使胞内物质释出的方法称为自溶法。自溶法效果的好坏取决于自溶条件。主要有温度、pH值、离子强度等。此外，可以通过参加噬菌体去感染细胞，或通过电离辐射等方法，使细胞自溶。本节复习题1.酶的提取和别离纯化、别离纯化方法2.细胞破碎的方法3.机械破碎法及分类和应用4.研磨法和匀浆法的定义和特点5.物理破碎法的定义、应用和分类6.温差破碎法的定义、特点和应用7.压差破碎法的定义和分类8.超声波破碎法的特点9.化学破碎法的定义和分类10.有机溶剂破碎过程(机理)11.外表活性剂处理及其特点12.酶破碎法的定义及其分类13.外加酶处理及特点14.自溶法及其特点酶的提取定义：酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。也称作酶的抽取。方法：根据酶提取时所用的溶剂或溶液的不同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。(1)盐溶液提取大多数酶溶于水，而且在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加，这称之为盐溶现象，盐浓度不能太高，否那么溶解度降低，出现盐析现象。一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在。〔2〕酸溶液提取有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取。〔3〕碱溶液提取有些在碱性条件下溶解度较大且稳定较好的酶，应采用碱溶液提取。〔4〕有机溶剂提取有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶，不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用有机溶剂提取。常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。本卷须知：在酶的提取过程中，为提高提取率并防止酶变性失活，必须注意几点：〔1〕温度：为防止酶的变性失活，提取温度不宜过高。〔2〕pH值：溶液pH值对酶的溶解度和稳定性有显著影响。〔3〕提取液的体积：提取液的用量增加，可提高提取率。〔4〕添加保护剂：提高稳定性，防止酶失活。本节复习题1.酶的提取及分类2.盐溶现象、盐析现象3.盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取的定义4.有机溶剂提取的定义、种类和本卷须知离心别离离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质别离的技术。在酶的提取和别离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的别离以及酶的纯化等往往要使用离心别离。在离心别离时，要根据欲别离物质以及杂质的大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。1.离心机的种类与用途离心机的分类：①按别离形式可分为沉降式和过滤式。②按操作方式有间歇、连续和半连续。③按用途有分析用、制备用及分析、制备两用。④按结构特点那么有管式、吊篮式、转鼓式和碟式等多种。⑤按离心机转速的不同可分为：常速离心机、高速离心机、超速离心机2.离心方法的选择方法：差速离心、密度梯度离心、等密度离心对常速和高速离心机，因所别离颗粒的大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和离心时间，就能到达别离效果，假设样品中存在两种以上大小和密度不同的颗粒，那么采用差速离心。(1)差速离心采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批别离的方法，称为差速离心。差速离心得到的沉降物是不均一的，含有较多杂质，需经过重新悬浮和再离心假设干次，才能获得较好的别离效果。差速离心主要用于别离那些大小和密度差异较大的颗粒。操作简单、方便，但别离效果差，并使沉降的颗粒受到挤压。〔2〕密度梯度离心密度梯度离心式样品在密度梯度介质正进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以别离的一种区带别离方法。为使沉降系数较接近的颗粒得以别离，必须配置好适宜的密度梯度系统。密度梯度系统是在溶剂中参加一定的溶质制成。这种溶质称为梯度介质。密度梯度可分为线性梯度、凹形梯度和凸形梯度等。密度梯度离心常用的是线性梯度，力度梯度的制备一般采用密度梯度混合器。在密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的不同而改变。离心时间越长，由于颗粒扩散而使区带越来越宽。适当增大离心力而缩短离心时间，可减少由于扩散而导致的区带扩宽现象。〔3〕等密度离心当欲别离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，在离心力作用下，不同浮力密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，一直移动到与它们各自浮力密度恰好相似的位置〔等密度点〕，形成区带。这种方法称为等密度梯度离心。或称为平衡等密度离心。3.离心条件确实定离心别离的效果好坏与诸多因素有关。除上述的离心机种类、离心方法、离心介质及密度梯度等以外，主要的是确定离心机的转速和离心时间。此外还要注意离心介质溶液的pH值和温度等条件。〔1〕离心力离心别离是借助于离心机产生的离心力，使不同大小不同密度的物质颗粒别离的。物质颗粒在离心场中所受到的离心力的大小，决定于颗粒的质量和离心加速度。离心加速度的大小取决于转子的转速和颗粒的旋转半径。离心力的大小与转速的平方成正比，也与旋转半径成正比。在转速一定的条件下，颗粒离轴心越远，其所受的离心力越大。在离心过程中，随着颗粒在离心管中移动，其所受的离心力也随着变化。在实际工作中，离心力的数据是指其平均值。即是指在离心溶液中点处颗粒所受的离心力。〔2〕离心时间在离心别离时，除了确定离心力以外，为到达预期的别离效果，还需确定离心时间。离心时间的概念，据离心方法的不同有所差异。对于差速离心来说，是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间；对等密度梯度而言，离心时间是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间，而密度梯度所需的时间那么是指形成界限清楚的区带的时间。〔3〕温度和pH值为了防止欲别离物质的凝集、变性和失活，除了在离心介质的选择方面加以注意外，还必须控制好温度及介质溶液的pH值等离心条件。本节复习题1.离心机的种类2.离心方法的分类和选择3.差速离心和密度梯度离心的定义及应用4.介质梯度的定义5.等密度离心(平衡等密度离心)6.影响离心效果的因素7.影响离心力大小的因素有哪些8.(不同离心方法对)离心时间的定义过滤与膜别离定义：过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质别离的技术。其中以各种高分子膜为过滤介质的过滤称为膜别离技术。分类：根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可分为粗滤、微滤、超滤和反渗透4大类。过滤介质：常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等。1.粗滤借助于过滤介质截留悬浮液正直径大于2um的大颗粒，而使固液别离的技术称为粗滤。通常所说的过滤就是指粗滤而言。粗滤所使用的过滤介质主要有滤纸、滤布、玻璃纤维、陶瓷滤板等。粗滤主要用于别离酵母、霉菌、动植物细胞、培养基残渣以及其他大颗粒的固形物。根据过滤对产生推动力的条件不同，粗滤可分:〔1〕常压过滤〔2〕加压过滤〔3〕减压过滤〔1〕常压过滤常压过滤是以液位差为推动力。常压过滤设备简单，操作方廉价行。但过滤速度较慢，别离效果较差，难大规模连续使用。〔2〕加压过滤加压过滤以压力泵或压缩空气为过滤的推动力。加压过滤设备比较简单，过滤速度较快，过滤效果较好，在生产中广泛应用。〔3〕减压过滤减压过滤有称真空过滤或抽滤，是通过在过滤介质的下方抽真空的方法，增加过滤介质上下方之间的压差，推动液体通过过滤介质，而把大颗粒截留的过滤方法。2.膜别离技术定义：借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小、不同性状和不同特性的物质颗粒或分子别离的技术，统称为膜别离技术。分类：根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力的不同可分为加压膜别离、电场膜别离、扩散膜别离3种。〔1〕加压膜别离加压膜别离是以薄膜两边的流通静压差为推动力的膜别离技术。根据所截留的颗粒大小的不同，加压膜别离可分为微滤、超滤和反渗透3种。微滤：微滤又称为微孔过滤。微滤膜截留的物质颗粒直径为0.2~2μm。主要用于别离细菌、灰尘等光学显微镜可以看见的物质颗粒。在无菌水、软饮料、矿泉水等的生产中广泛应用。在没有微滤膜的情况下，可用微孔瓷滤筒作为过滤介质。微滤过程所使用的操作压力在以下。超滤：又称为超过滤。是借助于超滤膜将不同分子的物质别离的技术。超滤膜截留的颗粒直径从0~2000A°(0.2μm)，相当于分子量1000~5×105道尔顿。主要用于别离病毒和各种生物大分子。在酶工程、生化药物等领域已广泛使用。超滤膜是有丙烯腈、醋酸维生素、硝酸纤维素、尼龙等高分子聚合物制成的多孔薄膜。膜的透过性一般以流率表示。流率是指酶平方厘米的膜每分钟透过的流体的量，以mL/(cm2·min〕表示。超滤时流率一般为0.01~5mL/(cm2·min〕，孔径大，流率大。影响流率的主要因素是膜孔径的大小。此外，颗粒的性状与大小，溶液浓度，操作压力，温度和搅拌等条件对超滤流率也有明显的影响。〔1〕颗粒的性状与大小：一般说来，相对密度小的分子透过性好，球状分子比相同分子量的纤维状分子透过性好，小分子比大分子的透过性好。〔2〕溶液的浓度越高，超滤流率越小。〔3〕操作压力：一般情况下，压力增加时，超滤的流率增加，但对于一些胶体溶液，当压力高到一定程度后，在增加压力，超滤流率不再增加；对于一般溶质分子而言，压力增加时，其透过性降低。但某些溶质分子可随压力增加而提高其透过性。此外，适当提高温度，增加搅拌速度等都有利于提高超滤流率。但温度和搅拌速度不能过高，以免引起酶和其他活性大分子变性失活。反渗透：反渗透膜的孔径小于20Aº，被截留的物质分子量小于1000道尔顿，操作压力为0.7~13MPa。主要用于别离各种离子和小分子物质。在海水淡化，纯水精制等方面使用。电场膜别离定义：电场膜别离是在半透膜的两侧分别装上正、负极，在电场的作用下。小分子的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透膜，而到达别离的目的。分类：电渗析和离子交换电渗析电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐、海水淡化、纯水制备及其他电荷的小分子别离。也可将凝胶电泳后的含蛋白质或核酸等的凝胶切开，经电渗析使带电荷的大分子与凝胶别离。离子交换膜电渗析的装置与一般电渗析相同，只是以离子交换膜代替一般的半透膜。离子交换膜电渗析在海水淡化，溶液脱盐以及从发酵液中别离纯化柠檬酸等方面。离子交换膜的选择性比一般半透膜强，一方面是膜的孔径大小不同，只让小于孔径的颗粒透过，将大于孔径的分子截留。另一方面，膜上带有某种基团，同性电荷相斥，异性电荷相吸的原理，只让带异性电荷的颗粒透过，将同性电荷物质截留。扩散膜别离定义：利用小分子物质的扩散作用，不断透过半透膜到膜外，而大分子被截留，到达别离目的。扩散膜别离主要是指透析。透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或赛璐玢等制成。透析主要用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的别离纯化，从中除去小分子物质，也可用于溶液脱盐等。透析设备简单，操作简便。但透析时间长，假设不更换水或缓冲液时，只扩散到膜内外平衡为止；透析结束时，透析袋内的保存液体积较大，浓度较低。本节复习题1.过滤和粗滤的定义、过滤介质、应用和分类2.常压过滤、加压过滤和减压过滤的定义及特点3.膜别离技术和加压膜别离的定义和分类4.微滤的定义和应用5.超滤的定义和应用及超滤膜材6.膜的透过性表示方法7.影响流率的因素8.反渗透的定义及应用9.电场膜别离的定义及分类10.电渗析和离子交换膜电渗析的应用11.离子交换膜的选择性12.扩散膜别离的定义、透析膜材和应用沉淀别离定义：沉淀别离是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质别离的方法。是酶纯化别离常用的方法。种类：盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等。盐析沉淀法盐析沉淀法简称盐析法，是指盐浓度到达一定程度后，蛋白质和酶的溶解度随盐浓度的升高而减少，使蛋白质和酶析出的现象。该方法在酶的别离纯化中应用最早且至今仍在广泛使用的方法，主要用于蛋白类酶的别离纯化。盐影响蛋白质在水中的溶解度，一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出。在某一浓度的盐浓度中，不同蛋白质的溶解度各不相同，由此可到达彼此别离的目的。盐之所以会改变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中离解正离子和负离子。由于反离子作用，使蛋白质费分子外表的电荷改变，同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度，使分子外表的水化膜改变。在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。硫酸铵在水中的溶解度大而温度系数小，不影响酶的活性，别离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，且铵离子的存在往往会干扰蛋白质的测定，有时也用其他中性盐来进行盐析。不同的酶有不同的结构，故盐析时所需的盐浓度各不相同。另外酶的来源、酶的浓度、杂质的成分等对盐析时所需盐浓度有所影响。盐析时，温度一般维持在定温左右，溶液的pH值应调整到目的蛋白质的等电点附近。盐析时得到的酶沉淀，含有大量盐分，一般可以采用透析、超滤或层析等方法进行配盐。等电点沉淀法定义：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，对酶、蛋白质、氨基酸等两性电解质进行别离纯化的方法称为等电点沉淀。原理：在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力排除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。但在等电点时两性电解质分子外表的水化膜仍然存在，使酶等大分子物质仍有一定的溶解性，而使沉淀不完全，故等电点法往往与其他方法一起使用。如：等电点沉淀法经常与盐析沉淀法以及溶剂沉淀法和复合沉淀法等一起使用。单独使用主要用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。有机溶剂沉淀法定义：利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，而使酶与杂质别离的方法称为有机溶剂沉淀法。机理：有机溶剂的存在使溶液的介电常数降低，进而使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集。同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用使溶质分子外表的水膜被破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。优点：与盐析法相比，析出的沉淀更易于离心或过滤别离，不含无机盐，分辨率较高。缺点：但此法易引起酶的而变性失活，必须在低温条件下操作，而且沉淀析出后要尽快别离，以尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。有机溶剂种类：乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。有机溶剂的用量：有机溶剂的用量一般为酶液体积的2倍，有机溶液的体积分数约70%，不同酶和使用不同的有机溶剂时，使用浓度也不同。复合沉淀法定义：在酶液中参加某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，别离出沉淀后，再用适当的方法使酶从复合物中析出，这种别离纯化的方法称为复合沉淀法。常用的复合沉淀剂：单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。选择性变性沉淀法定义：选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需的酶，这种别离方法称为选择性变性沉淀法。例如：对于热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而除去。另外，还可根据酶的特性，通过改变pH值或参加某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。本节复习题1.沉淀别离的定义和种类2.盐析沉淀法的定义及应用和所用中性盐3.盐析沉淀法别离的机理4.等电点沉淀法的定义、原理和应用5.有机溶剂沉淀法的定义、机理、优缺点、有机溶剂种类和用量6.复合沉淀法的定义和常用复合沉淀剂7.选择性变性沉淀法的定义及其应用层析别离定义：层析别离是利用混合液中各组分的物理化学性质〔分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等〕的不同，使个组分以不同程度分布在两相中〔其中一个相是固定的相称为固定相；另一个是流动的称为流动相〕，当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分别离纯化。种类：吸附层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析。吸附层析定义：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分别离的方法。是各种层析技术中应用最早且至今仍广泛使用的技术。吸附：任何两相之间都可以形成一个界面，其中一个相的物质或溶质在两相界面上的密集现象称为吸附。吸附剂：但凡能够将其他物质聚集到自己外表上的物质称为吸附剂。被吸附物：能聚集于吸附剂外表的物质被称为被吸附物。吸附剂种类：硅藻土、氧化铝、磷酸铝、羟基磷灰石和活性炭等。吸附剂通常在较低pH值、低离子强度的条件下对酶有强的吸附作用，而提高pH值和增强离子强度的条件下，酶可被解析而洗脱下来。吸附层析通常采用柱形装置，将吸附剂装在吸附柱中进行柱层析，层析时欲别离样品液自柱顶参加，上柱完毕后，再参加洗脱剂解析洗脱。离子交换层析定义：是利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同而到达别离目的的一种层析别离方法。离子交换剂：是含有假设干活性基团的不溶性高分子物质〔母体〕，通过在不溶性高分子物质上引入假设干可解离基团〔活性基团〕而制成。离子交换剂分类〔1〕按活性基团的性质不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂〔2〕按母体性质不同有离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。步骤：装柱、上柱、洗脱和收集、再生等步骤。凝胶层析定义：凝胶层析〔凝胶过滤、分子筛层析、分子排阻层析〕是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的相对分子质量不同而进行别离的层析技术。该技术是一种简便快速的层析别离技术，设备简单，操作方便，不需经过处理就可反复利用。适用于不同分子量的而各种物质别离。凝胶：是具有网状结构的多孔性高分子聚合物。种类：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。各种凝胶均有系列产品，不同型号说明凝胶的孔径不同。亲和层析定义：亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使酶等生物分子别离纯化的技术。配基：在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。配基必须偶联于不溶性母体上。母体：母体又称为载体或担体，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等作为母体。在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析。当用小分子物质作为配基时，由于空间位阻作用，难以与配对的大分子亲和吻合，需要在母体与配基之间引入适当长度的连接臂。在亲和层析过程中，应控制好温度〔一般为0~10℃〕和pH值等条件，以免酶变性失活。本节复习题1.层析别离的定义和种类2.吸附层析、吸附、吸附剂和被吸附物的定义3.吸附剂的种类、应用和吸附层析步骤4.离子交换层析和离子交换剂的定义及其分类5.母体、活性基团的定义及其选择6.凝胶层析的定义和应用7.凝胶的定义及种类8.亲和层析和配基的定义电泳别离电泳：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。电泳别离的机理：不同的物质由于带电性质及其颗粒大小和形状不同，在一定的电场中它的移动方向和移动速度不同，故此可将它们别离。物质颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的种类。带正电荷的颗粒向电场的阴极移动；带负电荷的颗粒那么向阳极移动。净电荷为零的颗粒在电场中不移动。影响颗粒在电场中移动速度的主要因素：颗粒本身所带净电荷量、颗粒形状、颗粒大小、电场强度、溶液的pH值、离子强度及支持体的特性等。〔1〕电场强度定义：电场强度是指每厘米距离的电压降。作用：电场强度对颗粒的泳动速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。电泳分类：根据电场强度的大小可将电泳分为高压电泳和常压电泳。①常压电泳：电场强度为2~10V/cm，电压为100~500V，电泳时间从几十分钟到几十小时，多用于带电荷的大分子物质的别离。②高压电泳：电场强度为20~200V/cm，电压大于500V，电泳时间从几分钟到几个小时，多用于带电荷的小分子物质的别离。〔2〕溶液的pH值溶液的pH值决定了溶液中颗粒分子的解离程度，决定了颗粒分子所带电荷的种类，而且决定净电荷的数量。溶液的pH值离开其等电点越远，颗粒所带净电荷越多，泳动速度越快；反之，颗粒的泳动速度越慢。当溶液的pH值等于某溶液的等电点时，其净电荷为零，泳动速度也等于零。因此，电泳时溶液的pH值应该选择在适当的数值，并需采用缓冲液，使pH值维持恒定。〔3〕溶液的离子强度溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度那么越慢，反之那么越快。一般电泳溶液的离子强度为，较为适宜。〔4〕电渗在电场中，溶液对于固体支持物的相对移动称为电渗。〔5〕缓冲液的粘度和温度也对颗粒的泳动速度有一定的影响。电泳技术的分类按使用的支持体的不同，电泳技术可分为，纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳等。纸电泳定义：是以滤纸为支持体的电泳技术。过程：①选择适当的滤纸②选择一定pH值和离子强度的缓冲液③点好试样，进行电泳试验④分析鉴定薄层电泳定义：是将支持体与缓冲液调制成适当厚度的薄层而进行电泳的技术。常用的支持体有淀粉、纤维素、硅胶、琼脂等，其中淀粉最常用。因为淀粉易于成型，对蛋白质等的吸附少，样品易洗脱，电渗作用低，别离效果好，故淀粉常用于蛋白质、核酸、酶等的薄层电泳别离。薄膜电泳定义：薄膜电泳是以醋酸纤维等高分子物质制成的薄膜为支持体的电泳技术。特点：薄膜电泳具有快速、区带清晰、灵敏度高、易于定量和便于保存的特点，广泛用于各种酶的别离。凝胶电泳定义：是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。特点：凝胶电泳同时具有电泳和分子筛的双重作用，具有较高的分辨率。应用：用于酶相对分子质量的测定、酶蛋白和酶RNA的顺序测定和酶的别离。支持体种类：主要有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等，常用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳分类①按凝胶形状和电泳装置的不同，分为垂直管型盘状电泳和垂直板型电泳。二者原理和方式根本相同，不同前者在玻璃管内制成圆柱状的凝胶，后者在两块玻璃板之间制成平板状凝胶。②按凝胶组成系统的不同，分为连续凝胶电泳、不连续凝胶电泳、浓度梯度凝胶电泳和SDS-凝胶电泳等4种。等电点聚焦电泳定义：等电点聚焦电泳又称为等电点聚焦或电聚焦。在电泳系统中，加进两性电解质载体。当接通直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增多的pH梯度。当酶或其他两性电解质进入这个体系时，不同的两性电解质即移动到〔聚焦于〕与其等电点相当的pH值位置上，从而使不同的等电点的物质得以别离，这种电泳技术称为等电点聚焦电泳。等电点聚焦电泳是20世纪60年代后期开展起来的电泳技术，在酶的等电点测定和酶的别离中广泛使用。具有如下5个特点：①分辨率高，可将等电点仅相差单位的蛋白质分开。②随着电泳时间的延长，值带越来越窄。而其他电泳随着电泳时间的延长和移动距离的增加，由于扩散作用，而使值带越来越宽。③样品混合液可以加在电泳系统的任何部位④浓度很低的样品都可以别离，而且重现性好。⑤可准确地测定酶或其他蛋白质，核酸等两性电解质的等电点。适用范围

①等电点聚焦电泳的结果是样品中各组分都聚焦到其各自的等电点，对那些在等电点pH值时不溶解或发生变性的两性电解质不适用。②等电点聚焦电泳要求使用无盐溶液，所以对在无盐溶液中溶解度很低的蛋白质等不适用。在等电点聚焦电泳中，为了获得稳定的pH梯度，必须使用性能优良的两性电解质载体，良好的两性电解质载体必须符合以下要求：①在等电点条件下必须有足够的缓冲能力。②在等电点条件下必须有足够的等电能力，且要求等电点不同的各种两性电解质载体组分具备相同的等电系数。③相对分子质量要小。④化学组成应与被别离的样品组分不同。⑤与样品中各组分不会发生化学反响。电泳技术应用①酶的纯度鉴定②酶的相对分子质量的测定③酶的等电点测定④少量酶的别离纯化本节复习题1.电泳的定义、电泳别离的机理2.影响颗粒在电场中移动速度的主要因素3.电场强度的定义和作用4.电泳的分类和应用5.纸电泳的定义和过程6.薄层电泳的定义和常用支持体7.薄膜电泳的定义、特点、应用和常用支持体8.聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类9.等电点聚焦电泳的定义、特点和适用范围10.等电点电泳中两性电解质载体的选择要求酶的结晶结晶：结晶是溶质以晶棒形式从溶液中析出的过程。结晶时，溶质分子按照一定的规律排列在一起，形成特定形状的晶体颗粒。酶的结晶：主要是采用各种方法使酶液中酶的溶解度慢慢降低，使之处于稍为过饱和状态，而使酶慢慢析出结晶。酶的结晶是酶别离纯化的一种手段，也是酶的一种制品形式。

酶结晶的作用酶结晶为酶的结构、功能、催化机制等方面的研究提供了适宜的样品，同时为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。酶结晶所需条件和要求①要使酶从酶液中析出结晶，酶液应预先经过一定程度的别离纯化，假设纯度太低，那么结晶无法出现。一般来说，酶液中酶的纯度应在50%以上，方有可能进行结晶，总的趋势是酶的纯度越高，结晶越容易。②不同酶结晶时纯度的要求不同，有的酶在纯度到达50%时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下依然无法析出结晶，故此酶的结晶只是到达了相当的纯度。③为获得变纯的酶，一般要经过屡次重结晶，每经过一次重结晶，酶的纯度均有一定的提高，直至恒定为止。④酶在结晶时，酶液应控制在一定的浓度，浓度太低，无法析出结晶；浓度太高，那么会形成形成许多小晶核，晶粒无法长大。⑤结晶时，还要控制好浓度，pH值，离子浓度等条件。酶结晶的方法〔1〕盐析结晶〔2〕有机溶剂结晶〔3〕透析平衡结晶〔4〕等电点结晶盐析结晶定义：在适宜的温度和pH值等条件下，慢慢增加酶液中盐的浓度，是酶液的溶解度慢慢降低，而使酶析出结晶，此种方法称为盐析结晶。采用盐类：中性盐硫酸铵和硫酸钠等。盐析过程①盐析结晶时，一般是将饱和盐溶液慢慢滴加到酶液中，在酶液稍为浑浊时，让其在一定温度条件下〔一般为0~10℃〕放置一段时间，慢慢析出结晶，再慢慢外加饱和盐溶液或粉末状的盐，直至结晶完全。②也可以先将酶液进行硫酸铵盐析得到酶的沉淀，再用一定饱和抽提，使一局部酶溶解，别离得到上清液，在定温下放置一段时间，慢慢析出结晶。有机溶剂结晶定义：在适宜的温度和pH值等条件下，慢慢参加一定量的有机溶剂到酶液中，是酶的溶解度慢慢降低，到达稍为过饱和状态而析出结晶，此种方法为有机溶剂结晶。常用酶结晶的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、甲醇、异丙醇甲基戊二醇、二甲亚砜等。结晶时，pH值应调节到酶稳定性较好的pH值范围、温度一般为0~4℃。透析平衡结晶将经过纯化的浓缩酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液或一定pH值的缓冲液或有机溶剂进行透析，经过一段时间，酶液中酶的浓度剪剪到达过饱和状态而析出结晶，此种方法称为透析平衡结晶。透析平衡结晶是常用的结晶方法之一，可用于大量样品的结晶，也可用于微量样品的结晶。等电点结晶通过慢慢改变浓缩酶液的pH值，使之逐步到达酶的等电点，是酶的溶解度降低，到达过饱和状态而析出结晶，此方法称为等电点结晶。在等电点结晶过程中，调节酶液的pH值一定要均匀并缓慢，以免局部过酸或过碱而影响。本节复习题1.酶结晶的定义、作用及其所需条件要求2.盐析结晶的定义和所用盐类3.盐析过程4.有机溶剂结晶的定义和种类5.透析平衡结晶的定义和应用6.等电点结晶的定义和本卷须知浓缩与枯燥浓缩与枯燥都是使酶与溶剂〔通常是水〕别离的过程。是酶别离纯化过程不可缺少的环节之一。浓缩浓缩是从低浓度酶液中除去局部的水或其他溶剂而成为高浓度溶液的过程。浓缩的方法很多，如前所述的离心别离、过滤和膜别离、沉淀别离、层析别离等也能起到浓缩的作用。用各种吸水剂，如枯燥的凝胶、聚乙二醇吸收酶液中的水分，也可使酶液浓缩。蒸发浓缩蒸发浓缩是通过加热或减压方法使溶液中的局部溶剂汽化蒸发，溶液得以浓缩的过程。由于酶在