实训五病毒的血凝与血凝抑制试验

实训五

病毒的血凝与血凝抑制试验主要内容目的要求仪器及材料方法与步骤结果判定注意事项一、目的要求

熟练掌握病毒的血凝与血凝抑制试验（微量法）的操作方法及结果判定，明确其应用价值。二、仪器及材料

pH7.2、0.01mol/LPBS或生理盐水、3.8%枸橼酸钠、新城疫病毒液、离心机、天平、1％鸡红细胞悬液、新城疫病毒液、新城疫病毒待检血清、新城疫标准阳性血清、新城疫标准阴性血清、微量血凝板（V型96孔）、微量移液器（带吸头）、微型振荡器、温箱、注射器。

三、方法与步骤（一）血凝试验（HA）

1.加生理盐水

用微量移液器向反应板每孔分别加生理盐水25μl。

2.病毒液倍比稀释

换吸头，吸取25μl

新城疫病毒液，加于第1孔的生理盐水中，并用移液器挤压3～5次使液体混合均匀，然后取25μl

移入第2孔，混匀后取25μl

移入第3孔，依次倍比稀释到第11孔，第11孔中液体混匀后从中取出25μl

弃去，第12孔不加病毒液，作对照。

3.加生理盐水换吸头，向反应板每孔分别加生理盐水25μl。

4.加1%红细胞悬液换吸头，吸取1%红细胞悬液依次加入1～

12孔中，每孔加25μl

。加样完毕，将反应板置于微型振荡器上振荡混匀1min。振荡混匀后置室温（20-25℃）反应40min，或置4℃反应60min。5.结果判定新城疫病毒液能凝集鸡的红细胞，但随着病毒液被稀释，其凝集红细胞的作用逐渐变弱。病毒的血凝价（血凝滴度）：能使一定量红细胞完全凝集的病毒最大稀释倍数为该病毒的血凝滴度或称血凝价。血凝试验结果规律完全凝集：红细胞呈伞状均匀分布于孔底

不完全凝集：介于两者之间完全不凝集：红细胞呈明显纽扣状沉于孔底结果举例上图:血凝价为7log2或1：128（二）4V配制：

HA价除以4即为4HAU抗原的稀释倍数。假设HA价为256，则4HAU抗原的稀释倍数为64，吸取1mL抗原加入63mL生理盐水即为4HAU抗原。（三）血凝抑制试验（HI）

1.加生理盐水

用微量移液器向反应板1～11孔分别加生理盐水25μl，12孔加50μl。

2.待检血清倍比稀释换吸头，吸取25μl

待检血清，加于第1孔的生理盐水中，然后依次倍比稀释到第10孔，第10孔中液体混匀后从中取出25μl

弃去，第11孔为病毒对照，第12孔为生理盐水对照。

3.加4单位新城疫病毒液

换吸头，吸取4单位的新城疫病毒液依次加入1～

11孔中，每孔加25μl。加样完毕，将反应板置于微型振荡器上振荡混匀1min。

振荡混匀后置室温（20-25℃）反应30～

40min，或置4℃反应60min。

4.加1%红细胞悬液

换吸头，吸取1%红细胞悬液依次加入1～

12孔中，每孔加25μl。加样完毕，将反应板置于微型振荡器上振荡混匀0.5min。

振荡混匀后置室温（20-25℃）反应40min，或置4℃反应60min。

5.结果判定血清的血凝抑制效价（血凝抑制滴度）：以完全抑制4个HAU抗原的血清最大稀释倍数作为该血清的血凝抑制滴度或血清的血凝抑制效价。以nLog2方式表示血清的血凝抑制滴度。血凝抑制试验结果规律完全凝集：红细胞呈伞状均匀分布于孔底

不完全凝集：介于两者之间完全不凝集：红细胞呈明显纽扣状沉于孔底结果举例上图：第三排血凝抑制滴度为7Log2四、注意事项微量移液器的正