实验二细菌的分离培养及移植

实验二细菌的分离

培养及移植1、掌握细菌分离培养的基本要领和方法。2、掌握厌氧菌培养的原理及其方法。[目的要求][细菌分离培养和移植的一般原则]

分离培养的目的是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意以下事项：

1、选择适合于所分离细菌生长的培养基。

2、确定合适的培养温度。

3、根据细菌的生长要求决定培养的气体条件。

4、要严格地进行无菌操作。

5、做好标记。

1、待检样：牛奶中细菌的分离。2、器械：记号笔、酒精灯、接种环等。3、培养基：普通琼脂平板、普通琼脂斜面、伊红美蓝琼脂平板、（或麦康凯琼脂平板）。[实验材料][方法与步骤]一、需氧菌的分离培养法

此法为最常用的分离培养法。将被检材料或混杂的材料在平板培养基上连续划线，从而使细菌分散开，以求培养后获得单个菌落。1、平板划线法左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20度左右的角度(角度越小越好，以免空气中的细菌污染培养基)。右手持接种环，蘸取少许材料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料烧掉，待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线。划线中线的疏密要合适，太密容易形成菌苔，过疏不能充分利用平板的表面积，也不易得到单个菌落。同时不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。接种完，在皿底做好标记，平皿倒扣，置37℃培养。

细菌划线的操作要点：首先将待分离的材料做10×的连续稀释，如10-1、10-2、10-3…等；选择几个合适的稀释度，分别从中吸取一定量的稀释液（0.1ml），加到不同的平板培养基表面，再用灭菌玻璃推棒将液体推匀，做好标记，置37℃培养。经培养后即可出现单个菌落。

2、稀释涂布分离法（自学）将培养24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落的一部分，经染色镜检，证明不含杂菌；用接种环挑取这个菌落剩余的部分，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物。3、纯培养两试管斜面移植时，左手持菌种管和被接种琼脂斜面管，使管口并齐，管底部放在拇指和食指之间，松动试管塞，以便接种时容易拔出。右手持接种环，在火焰上灭菌后，用右手小指和无名指同时拔出两支管的棉塞，将管口进行火焰灭菌，使其靠近火焰。将接种环伸入菌种管内，冷却后挑取少许细菌，拉出接种环立即伸入另一管斜面培养基上，从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，将试管塞好。接种完毕，在试管壁上注明菌名、日期和接种者，置37℃温箱中培养。4、细菌移植的操作要点二、厌氧菌的分离培养法

厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离O2存在，游离O2可造成细菌的死亡，所以在培养厌氧菌时，要创造一个厌氧环境。厌氧培养法有生物学、化学和物理学3种。利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，使其形成厌氧状态，有利于厌氧菌的生长发育。1、物理学方法将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中，先抽去部分空气，代以氢气至大气压。通电，使罐中残存的氧与氢经铂或钯的催化而化合成水，使罐内氧气全部消失。将整个厌氧罐放入温箱培养。本法适用大量的厌氧菌培养。（1）厌氧罐法

（2）真空干燥器法

将欲培养的平皿或试管放入真空干燥器中，开动抽气机，抽至高度真空后，替代以氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放进温箱培养。（3）高层琼脂法

加热融化高层琼脂，冷至45℃左右接种厌氧菌，迅速混合均匀。冷凝后37℃培养，厌氧菌在近管底处生长。

①厌氧肝汤培养法培养基中含动物组织（肝块），表面盖有液体石蜡，肝块中的可氧化物质氧化而消耗氧气，液体石蜡隔绝空气，从而形成厌氧环境。

②厌氧菌与需氧菌共同培养是利用需氧菌的生长消耗氧气，造成厌氧环境，来培养厌氧菌的方法。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌（如枯草杆菌），另一半接种厌氧菌，接种后将平皿用石蜡密封，倒扣置37℃恒温箱中培养2～3d后，即可观察到需氧菌和厌氧菌先后生长的现象。

2、生物学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化-还原电势。3、化学方法（1）焦性没食子酸法

原理：焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大量氧气，同时由淡棕变为深棕色的焦性没食子橙。每100cm3空间用焦性没食子酸1g及10％氢氧化钠10ml。①取一个干燥器，用水量出其体积。②按体积计算并称量出焦性没食子酸和10％氢氧化钠的用量。③将氢氧化钠溶液倒入干燥皿的底部，将焦性没食子酸用纸包好，用青霉素小瓶将焦性没食子酸支撑于氢氧化钠溶液上方，两种药品勿接触。④放上隔板，将接种好的培养皿放在隔板上。⑤放入一支美蓝指示剂管。⑥将干燥皿边缘涂一层凡士林油，并盖盖密封，轻轻摇动干燥皿，使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中，将干燥皿放入温箱培养，经2～3d，即可看到细菌生长。美蓝指示剂可显示干燥器中的厌氧程度，美蓝在有氧时呈氧化型（蓝色），无氧时呈还原型（无色）。操作方法：（2）李伏夫法此法系用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应，以吸收空气中的氧气，其反应式如下：

Na2S2O4+Na2CO3+O→Na2SO4+Na2SO3+CO2

该法与焦性没食子酸法操作基本相同，只是用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应来吸收罐中的O2，按1000cm3空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g称取药品，在纸上混匀后，加水少许使混合物潮湿，立即放入干燥器底部，上放隔板及培养皿，密封培养。三、二氧化碳培养法

少数细菌如布氏杆菌（牛型）等，培养时，需5％～10％CO2环境，方能生长