第八章发酵过程控制

第八章发酵过程控制第1页，共284页。发酵过程控制是发酵的重要部分控制难点：过程的不确定性和参数的非线性第2页，共284页。同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果可见发酵过程的影响因素是复杂的第3页，共284页。比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的第4页，共284页。第一节发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次一发酵过程的种类分批培养补料分批培养半连续培养连续培养第5页，共284页。二发酵过程工艺控制的目的有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率第6页，共284页。发挥菌种的最大生产潜力考虑之点菌种本身的代谢特点生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率菌代谢与环境的相关性温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等第7页，共284页。比如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可能流向不同的反应方向，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方向进行。微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式第8页，共284页。微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表现在菌体量的大小影响产物量的多少，而且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成更具有复杂性因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂的去认识，而要从分子水平、细胞代谢水平和反应工程水平全面的认识第9页，共284页。发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素等等。因此发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。第10页，共284页。为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大家分析发酵过程的基本方面，在此基础上再举一些例子，说明如何综合分析发酵过程及进行优化放大。第11页，共284页。三发酵过程研究的方法和层次1、研究方法单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验优点一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。缺点如果考察的条件多，实验时间会比较长各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性第12页，共284页。数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。优点同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。第13页，共284页。初级层次的研究：一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适pH等要求。摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。2、研究的层次第14页，共284页。代谢及工程参数层次研究：一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以得到的代谢情况比较可信。第15页，共284页。除了装备有常规发酵罐的温度、溶氧、pH电极，得到发酵全过程的这些参数外，还有罐体称重，补料计量装置和尾气采集分析系统，更重要的是，有一套独特的数据处理软件，可以得到14个发酵过程参数，并且可以输入和绘制人工测定的参数，对发酵过程的分析起到了重要的作用全参数发酵罐第16页，共284页。生产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现,达到产业化的实现。一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同所致。第17页，共284页。第二节发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。第18页，共284页。这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等第19页，共284页。物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、、核酸量等生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等代谢参数按性质分可分三类：第20页，共284页。发酵过程参数直接参数:通过传感器把非电量变化直接转化为电量变化，实时地送计算机数据采集。物理参数、化学参数、生物量参数就地测量（inline）、在线测量（online）间接参数:

由一些直接参数计算得到的各种反映过程特性的参数。反映菌体代谢活性、反应器工程特性、反应器操作特性…等。手工参数:

取样后实验室手工测量参数，离线输入。第21页，共284页。

直接参数

物理参数化学参数成熟不成熟第22页，共284页。

间接参数第23页，共284页。从检测手段分可分为：直接参数、间接参数直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等第24页，共284页。直接参数又可分为在线检测参数和离线检测参数在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度。第25页，共284页。一发酵过程主要分析的项目目前发酵过程主要分析项目如下1、pHpH与微生物的生命活动密切相关——酶催化活性pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映——基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况第26页，共284页。2、排气氧、排气CO2和呼吸熵排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（OUR）。排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。第27页，共284页。RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而不同。测定RQ值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料CER表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量呼吸熵＝呼吸熵反映了氧的利用状况第28页，共284页。对于这种工艺，后期的补料控制是关键。过程中发现，在补糖开始时，不但CER、OUR大幅度提高，连RQ也提高约10％，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。第29页，共284页。3、糖含量菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。反映产生菌的生长繁殖情况反映产物合成的活力糖的消耗：第30页，共284页。糖含量测定包括总糖和还原糖。

总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。

还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。第31页，共284页。4、氨基氮和氨氮氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨氮指无机氨中的氮（NH3-N）。氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。第32页，共284页。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程第33页，共284页。5、磷含量微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。第34页，共284页。菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态显微镜观察菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。6、菌浓度和菌形态第35页，共284页。菌浓测定方法测粘度压缩体积法（离心）静置沉降体积法光密度测定法OD600~660适合于细菌、酵母第36页，共284页。7、产物浓度

在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量的测定来了解产物浓度直接反映了生产的状况,是发酵控制的重要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件如补料、pH对产物形成的影响。第37页，共284页。二产物量的测定（一）产物量的特殊表示法1、抗生素效价的表示抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示效价表示方法：重量折算法重量单位类似重量单位特殊单位第38页，共284页。重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素0.6微克＝1U重量单位：规定某些抗生素活性部分1μg=1u如链霉素、卡那霉素、红霉素等定义活性部分1μg＝1u第39页，共284页。类似重量单位：规定抗生素的某种盐1mg=1000u如金霉素、四环素的盐酸盐定一为1μg＝1u特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位制霉菌素1mg=3700u多粘菌素B1mg=10000u第40页，共284页。2、酶活力的表示法酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，不能用重量来表示酶的量。同一种酶用不同的方法测定会有不同的酶活单位，容易造成混乱，为此国际上作了统一规定，规定在250C下，以最适的底物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及最适的pH诸条件下，每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。第41页，共284页。（二）产物量的测定1、化学法（1）滴定法产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定法如青霉素在碱性条件下加入过量的I2，反应生成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，可计算出青霉素的单位柠檬酸可以用NaOH滴定来计算柠檬酸产量第42页，共284页。（2）比色法产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓度成正比，可以用比色法测定。淀粉酶活力测定：在1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（3，5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在540nm处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。第43页，共284页。（3）测压法产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力变化，可以通过测定压力变化得知产物量。2、物理法许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生素的含量。谷氨酸γ－氨基丁酸＋CO2第44页，共284页。化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程分析缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因此抗生素成品的测定用生物法测定。

适用于抗生素效价的测定

生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准，其原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏度高，需用的检品量较小，这是其它方法不能比的。但此法得到结果比较慢，需经过16~18小时培养。生物法常用于发酵终了产品效价的测定。3、生物法第45页，共284页。常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径为6mm，高10mm的圆筒形管子，管子的重量尽可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每碟15ml（下层），待其凝固。此外，将融化的培养基冷却到500C左右混入试验菌，将混有菌的培养基5ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。第46页，共284页。在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样品，加满后在370C培养16~18小时。在培养中,一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌圈越大，第47页，共284页。r:抑菌圈的半径(毫米）M：抗生素在管中的量（单位）C：最低抑菌浓度（单位/毫升）H：培养基的厚度（毫米）L：管子的高度（毫米）D：抗生素的扩散系数（毫米/小时）T：细菌生长到肉眼所用的时间（小时）第48页，共284页。抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4πDTH)抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的平方呈正比。此外还受C、H、D、T的影响但是C、H、D、T是无法测量的，在实际计算中要设法消去第49页，共284页。一般的消去方法有二剂量法标准曲线法第50页，共284页。标准曲线法优点：在一个碟子上可以同时做两个样品的效价，当要做的样品量大时，采取标准曲线法可以提高效率。假设选用的浓度为：3U，4U，5U，6U,7U中心点是5U1122第51页，共284页。每个浓度做三个碟子。5U为中心点，每个碟子中有3个杯中加中心点浓度，其余3个加其它浓度。测得抑菌圈后，将浓度和抑菌圈平均直径做标准曲线。第52页，共284页。logMr第53页，共284页。管碟法影响因素的讨论：斜率小D、T大,误差小截距小C、D、T、H小，误差小第54页，共284页。logMrlogM1r1r1r1第55页，共284页。培养基厚度H越小，其它条件相同时r越大。影响H的因素：培养基的厚度细菌生长到肉眼所需的时间T越大在其它条件相同时，r越大影响T的因素：菌体本身，及影响菌体生长的条件如：接种量，培养温度、及营养环境其它影响因素：上层铺得平整、菌液加入时的温度、钢圈的放置、滴液第56页，共284页。1、分批发酵简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。第57页，共284页。分批培养中微生物的生长迟滞期对数生长期稳定期死亡期第58页，共284页。微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，比生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期第59页，共284页。随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。第60页，共284页。分批培养的优缺点优点操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点产率低，不适于测定动力学数据第61页，共284页。2、补料分批培养

在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。第62页，共284页。补料分批培养的优缺点优点在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会第63页，共284页。3、半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵优点放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。缺点代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大第64页，共284页。4、连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。第65页，共284页。连续培养的优缺点优点控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于μ＝D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学缺点菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。第66页，共284页。第四节发酵过程的pH控制

pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。发酵过程中pH是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否第67页，共284页。一、发酵过程pH变化的原因

1、基质代谢

（1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降第68页，共284页。2、产物形成某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。

3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。

第69页，共284页。二、pH对发酵的影响例pH对林可霉素发酵的影响

林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵单位。1、实例第70页，共284页。pH7.0t不调pH调pH效价pH第71页，共284页。例：培养基初始pH值对漆酶分泌的影响pH在4～7范围内产酶最高第72页，共284页。2、pH对发酵的影响（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行

（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用

第73页，共284页。（4）pH影响代谢方向

pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH2~3时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺第74页，共284页。3、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响生长合成pH对菌体生长影响比产物合成影响小例青霉素：菌体生长最适pH3.5~6.0,产物合成最适pH7.2~7.4四环素：菌体生长最适pH6.0~6.8，产物合成最适pH5.8~6.0XpH四环素第75页，共284页。4、最佳pH的确定配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况pH对产海藻酸裂解酶的影响第76页，共284页。pH对海藻糖水解酶产生的影响pH——菌浓

pH——酶活第77页，共284页。pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响第78页，共284页。三、pH的控制

1、调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5~6.82、在基础料中加入维持pH的物质，如具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等3、通过补料调节pH第79页，共284页。在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH(2)当NH2-N低，pH低时补氨水；当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO44、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH第80页，共284页。PH调节的方法主要有下列几种：添加碳酸钙法氨水流加法尿素流加法5、不同调pH方法第81页，共284页。(1)添加碳酸钙法采用生理酸性铵盐作为氮源时，由于NH4+被菌体利用后，剩下的酸根引起发酵液PH值下降，在培养基中加入碳酸钙，就能起到调节PH值的作用。但是，碳酸钙的用量甚大，在操作上易引起染菌的危险，此法一般不采用。第82页，共284页。(2)氨水流加法在发酵过程中根据PH值的变化流加氨水调节PH值，且作为氮源，供给NH4+。氨水价格便宜，来源容易。但是，氨水作用快，对发酵液的PH值波动影响大，应采用少量多次流加，以免造成PH值过高，抑制菌体生长，或PH值过低，NH4+不足等现象。具体流加方法应根据菌种特性、长菌情况、耗糖情况等决定，一般控制PH值7.0～8.0，最好能够采用自动控制连续流加方法。第83页，共284页。(3)尿素流加法是目前国内味精厂普遍采用的方法。以尿素作为氮源进行流加调节PH值，由于PH值变化具有一定的规律性，易于操作控制。首先，由于通风、搅拌和菌体尿酶作用使尿素分解放氨，使PH值上升；氨和培养基成分被菌体利用并形成有机酸等中间代谢产物，使PH值降低，这时就需要及时流加尿素，以调节PH值和补充氮源。当流加尿素后，尿素被菌体尿酶分解放出氨使PH值上升，氨被菌体利用和形成代谢产物使PH值下降，再次进行流加反复进行维持一定的PH值。第84页，共284页。流加时除主要根据PH值得变化外，还应考虑到菌体生长、耗糖、发酵的不同阶段来采取少量多次流加，维持PH值稍低些，以利长菌。当长菌快，耗糖快，流加量可适当多些，PH值可略高些，发酵后期以有利于促进产谷氨酸，维持PH值7.2左右为好。当残糖已很少，接近放罐，以不加或少加为好，以免造成浪费和增加后工序提取的困难。第85页，共284页。不同pH值对菌体的形态影响很大，当pH值高于7．5时，菌体易于老化，呈现球状；当pH值低于6．5时菌体同样受抑制，易于老化。而在7．2左右时，菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在6．9左右时，菌体处于生长期，呈“八”字形状并占有绝对的优势。第86页，共284页。pH6．9时，菌体生长旺盛，pH7．15时，对菌体的产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段pH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值为7．15，到80h后pH值为7．25。产率22．27g·/L，产酸率提高12．23％。第87页，共284页。例：克拉维酸发酵中pH变换控制问题的提出：在pH低时菌体生长受抑制，在高pH时克拉维酸要分解用2.5升罐进行的不控制pH的发酵发现，前期由于微生物产生的酸性副产物和有机酸使pH降至6.5。在达到最高细胞浓度后，pH开始从6.5升至8.3。CA产量达最高水平时，pH不再升高。在发酵终止时，pH再次升至8.5。随着pH升高，CA迅速分解。第88页，共284页。研究不同pH对发酵的影响分别配置pH为6.0，7.0，8.0的培养基测定菌的生长和产物合成pH6.0时，生长受抑制，产物降解少第89页，共284页。pH8.0时生长良好产量低，产物降解pH7.0时的状况第90页，共284页。控制pH7.0和8.0时，最高细胞浓度接近相同(约16％PMV)，但控制pH6．0时细胞生长受抑制。在2．5升生物反应器内，不控制pH时2．47μg／(m1·h)控制pH7.0时的产率3．37μg／(m1·h)最高控制pH8.0时，产率2．02μg／(m1‘h)在控制pH6．0时，CA产生被抑制,但降解少因此对细胞生长和CA产生最好将pH控制于7.0，但在控制pH7.0时，仍出现CA的迅速分解。第91页，共284页。由于CA生产的最适pH和减少CA分解的pH各不相同，因此在分批发酵中应用了pH变换策略，使发酵pH由中性pH7．0变换为酸性pH6.0。在发酵前期，在细胞生长和产生CA期间控制pH7.0，4d后，当CA产量达最高值时，变换pH为6.0，以减少CA分解。最高CA浓度可保持24h。由于改变pH，使CA分解速率明显降低。第92页，共284页。第93页，共284页。pH控制是一项非常细致的工作，不仅考虑最佳pH值，而且要根据生长阶段考察对pH的要求。在pH控制中还要采用合适的调节方法。总结第94页，共284页。小结发酵过程pH会发生变化变化原因基质代谢产物形成菌体自溶第95页，共284页。对发酵的影响pHpH影响酶的活性pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离pH影响代谢方向pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响

第96页，共284页。pH的控制方式基础培养基调节pH在基础料中加入维持pH的物质通过补料调节pH

当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH

发酵的不同阶段采取不同的pH值选择合适的pH调节剂第97页，共284页。从图中可见，热凝胶发酵菌体生长和热凝胶合成是非偶联的，整个发酵过程可以分成两个阶段：前10h是菌体生长期，之后热凝胶开始合成，至发酵结束是热凝胶合成期。在菌体生长期，DO直线下降，培养液中的pH也迅速下降。10h左右，菌体质量浓度达到最大值，DO和pH降至最低点（5.4～5.6），菌体生长结束。此后进入热凝胶合成期。试验两阶段的最适pH，见表第98页，共284页。稳定期随着pH降低，糖耗速率增加，生物量增加，但产物合成速率在pH5.6时达到最高。说明当pH小于5.6以后微生物消耗的糖并非用于合成热凝胶，而是合成菌体。第99页，共284页。一、温度对生长的影响不同微生物的生长对温度的要求不同第100页，共284页。根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0～26度生长，嗜温菌适应于15～43度生长，嗜热菌适应于37～65度生长，嗜高温菌适应于65度以上生长第101页，共284页。在最适温度下，微生物生长迅速；超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。在最低和最高温度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征第102页，共284页。微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。第103页，共284页。1、微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物理化学性质有密切关系根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常生理条件下，膜中的脂质成分应保持液晶状态，只有当细胞膜处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理功能，使细胞处于最佳生长状态微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致。二、微生物与温度相关性的原理第104页，共284页。液晶状态是指某些有机物在发生固相到液相转变时的过渡状态称为液晶态。由固态转变为液晶态的温度称为熔点，以T1表示；由液晶态转变为液态的温度称为清亮点，以T2表示。T1与T2之间的温度称为液晶温度范围。什么是液晶状态？第105页，共284页。那么为什么不同微生物对温度的要求不同呢？根据细胞膜脂质成分分析表明，不同最适温度生长的微生物，其膜内磷脂组成有很大区别。嗜热菌只含饱和脂肪酸，而嗜冷菌含有较高的不饱和脂肪酸。第106页，共284页。2、蛋白质结构人们采用二种方案来研究酶在低温条件下的结构完整性和催化功能：(1)通过自然或诱导突变，将特定残基发生改变的蛋白与其天然结构进行对比；(2)对比同属嗜热、嗜温及嗜冷菌的蛋白结构通过对嗜冷酶的蛋白质模型和x一射线衍射分析表明：嗜冷酶分子间的作用力减弱，与溶剂的作用加强，酶结构的柔韧性增加，使酶在低温下容易被底物诱导产生催化作用第107页，共284页。由于其核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对低温的适应，蛋白质翻译的错误率最低。许多中温菌不能在O0C合成蛋白质，一方面是由于其核糖体对低温的不适应，翻译过程中不能形成有效的起始复合物，另一方面是由于低温下细胞膜的破坏导致氨基酸等内容物的泄露。3、蛋白质合成嗜冷菌具有在0℃合成蛋白质的能力第108页，共284页。将大肠杆菌从370C突然转移到100C条件时细胞中会诱导合成一组冷休克蛋白，它们对低温的生理适应过程中发挥着重要作用，检测嗜冷酵母的冷休克反应，发现冷刺激后冷休克蛋白在很短时间内大量产生。耐冷菌由于生活在温度波动的环境中，它们必须忍受温度的快速降低，这与它们产生的冷休克蛋白是密切相关的。4、合成冷休克蛋白低温微生物适应低温的另一机制是合成冷休克蛋白第109页，共284页。三、温度的影响与控制（一）温度对发酵的影响1、温度影响反应速率发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。从阿累尼乌斯方程式可以看到dlnKr/dt=E/RT2

积分得E=E——活化能Kr——速率常数第110页，共284页。2、温度影响发酵方向四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于300C时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。第111页，共284页。（二）最适温度的选择1、根据菌种及生长阶段选择微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为370C，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30～320C，青霉菌生长温度为300C。第112页，共284页。在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；根据生长阶段选择第113页，共284页。发酵中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。第114页，共284页。发酵后期产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段28℃，合成期26℃后期再升温；黑曲霉生长37℃，产糖化酶32～34℃。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长30～32℃，产酸34～37℃。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。第115页，共284页。例：林可霉素发酵的变温培养问题的提出接种后10h左右已进入对数生长期，随后是10h左右的加速生长期，在40h左右对数生长期基本完成，在50h左右转入生产期主要问题：如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在根据生长阶段选择温度第116页，共284页。变温培养的正交设计第117页，共284页。前60h按31℃控制，缩短了适应期使发酵提前转入生产阶段，同时菌丝体已有相当量的积累，为大量分泌抗生素提供了物质基础60小时后将罐温降至3O℃使与抗生素合成有关的酶的活性增强，抗生素分泌量有所增加，同时因分泌期的延长有利于进一步积累抗生素发酵进入后期罐温再回升至31℃使生产菌在生命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。结论：第118页，共284页。2、根据培养条件选择温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。第119页，共284页。菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。3、根据菌生长情况第120页，共284页。四、发酵过程引起温度变化的因素（一）发酵热Q发酵发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。第121页，共284页。1、生物热Q生物在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。第122页，共284页。生物热与发酵类型有关微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水好氧：产生287.2千焦耳热量，183千焦耳转变为高能化合物104.2千焦以热的形式释放厌氧：产生22.6千焦耳热量，9.6千焦耳转变为高能化合物13千焦以热的形式释放二个例子中转化为高能化合物分别为63.7％和42.6％第123页，共284页。在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。生物的大小与呼吸作用强弱有关第124页，共284页。如果培养前期温度上升缓慢说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大。第125页，共284页。2、搅拌热Q搅拌在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：Q搅拌＝P×860×4186.8（焦耳/小时）P——搅拌轴功率4186.8——机械能转变为热能的热功当量电机功率P=E——额定电压I——额定电流cosφ——功率因素，1千瓦时＝860×4186.8焦耳第126页，共284页。3、蒸发热Q蒸发

通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热Q显热，显热很小，一般可以忽略不计。4、辐射热Q辐射发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5％。Q发酵＝Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q辐射第127页，共284页。（二）发酵热的测定有二种发酵热测定的方法。一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。Q发酵＝GCm(T出－T进)Cm——水的比热G——冷却水流量另一种是根据罐温上升速率来计算。先自控，让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使罐温自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵热。第128页，共284页。因为热效应决定于系统的初态和终态，而与变化途径无关，反应的热效应可以用燃烧值来计算，特别是有机化合物，燃烧热可以直接测定。反应热效应等于反应物的燃烧热总和减去生成物的燃烧热的总和。ΔH＝∑（△H）反应物－∑（△H）产物如谷氨酸发酵中主要物质的燃烧热为：葡萄糖159555.9KJ/Kg谷氨酸15449.3KJ/Kg玉米浆12309.2KJ/Kg菌体20934KJ/Kg尿素10634.5KJ/Kg根据化合物的燃烧值估算发酵过程生物热的近似值。第129页，共284页。五、利用温度控制提高产量例1利用热冲击处理技术提高发酵甘油的产量背景：（1）酵母在比常规发酵温度髙10～200C的温度下经受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。（2）Lewis发现热冲击能提高细胞对盐渗透压的耐受力（3）Toshiro发现热冲击可使胞内3－磷酸甘油脱氢酶的活力提高15～25％，并导致甘油产量提高第130页，共284页。实验：甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的，因此可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量正交条件A冲击温度（0C）40，45，50B开始时机（h）8，16，30C冲击时间（分）15，30，60结果发酵16小时，450C冲击30分钟最佳，发酵96小时后甘油浓度提高32.6％，发酵罐实验见图（A）16h,450C,30min（B）12h,450C,30min第131页，共284页。例2

重组大肠杆菌人Cu/Zn-SOD的高表达Lac启动子，用乳糖作诱导剂270C300C340C370CSOD49661427065904638比活8101471679526蛋白6.1299.709.7911.88OD6007.41

10.72

11.7824.77第132页，共284页。原因：1、乳糖被用于合成菌体和其它蛋白，减少了合成SOD的原料，随着温度升高，蛋白和菌浓都增加。2、高温下可能SOD降解速率增加，杂蛋白增加3、低温下由于比生长速率低，质粒脱落减少4、低温下菌的衰老减缓，死亡率低第133页，共284页。小结微生物最适生长温度微生物对温度的要求不同与它们的膜结构有关微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致微生物对温度的要求与酶分子结构的区别有关，如蛋白构象稳定性因素改变，活性位点关键区域氨基酸的取代，离子束缚作用(ionbinding)减弱，蛋白核心区域疏水作用下降等第134页，共284页。温度对发酵的影响：温度影响反应速率温度影响发酵方向最适温度的选择根据菌种生长阶段选择根据培养条件选择菌种的生长情况第135页，共284页。发酵过程引起温度变化的因素发酵热是引起发酵过程温度变化的原因Q发酵＝Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q辐射生物热的定义，产生的原因：基质代谢。它与菌种、发酵类型、生长阶段、营养条件有关搅拌热与搅拌功率有关发酵热测定:冷却容量燃烧热第136页，共284页。思考题7.16根据微生物对温度的依赖可分类成哪几类微生物？7.17微生物对温度要求不同的原理是什么？7.18发酵过程的温度会不会变化？为什么7.19发酵热的定义7.20生物热的大小与哪些因素有关？7.21温度对发酵有哪些影响？7.22发酵过程温度的选择有什么依据？第137页，共284页。

第六节染菌的防治发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖什么是染菌？第138页，共284页。一、染菌的影响发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。影响产品外观及内在质量第139页，共284页。（一）染菌对发酵的影响生产不同的品种，可污染不同种类和性质的微生物。不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量，不同培养基和培养条件又可产生不同后果第140页，共284页。1、发酵染菌对不同品种的影响放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。不同菌不同产品第141页，共284页。链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。不同产品第142页，共284页。疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。不同产品第143页，共284页。2、污染不同种类和性质的微生物的影响（1）污染噬菌体

噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产。第144页，共284页。（2）污染其它杂菌有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。第145页，共284页。3、不同时间染菌对发酵的影响污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量有关。第146页，共284页。污染的菌量多，显现染菌所需的时间就短，污染菌量少，显现染菌的时间就长。第147页，共284页。（1）种子培养期染菌由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。第148页，共284页。（2）发酵前期染菌发酵前期最易染菌，且危害最大。原因发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。染菌措施可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。第149页，共284页。（3）发酵中期染菌发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施

降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。第150页，共284页。（4）发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。第151页，共284页。4、染菌程度对发酵的影响

染菌程度愈大，即进入发酵罐的杂菌数量多，对发酵的危害愈大。当生产菌已迅速繁殖，在发酵液中占有优势，污染极少数杂菌，如每1L中有1～2个杂菌，对发酵不会带来影响，因为这些杂菌需要时间繁殖才能达到危害发酵的程度，而且环境对杂菌的繁殖已不利。当75m3发酵液污染1个杂菌，要达到大幅度(106个/mL)污染时需要的时间(h)为：第152页，共284页。条件污染106个/mL污染108个/mL增代时间tg=30min2326延迟6htg=30min2932增代时间tg=2h92106延迟6htg=2h98112

但是污染幅度较大时，特别是发酵前期和中期污染，将造成严重的危害。第153页，共284页。（二）发酵染菌对提炼和产品质量的影响1、发酵染菌对过滤的影响染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难。即使采取加热、冷却、添加助滤剂等措施，使部分蛋白质凝聚，但效果并不理想。第154页，共284页。污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率，直接影响提炼总收率。第155页，共284页。2、发酵染菌对提炼的影响染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。第156页，共284页。二、染菌的原因（一）发酵染菌率计算基准总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。这是习惯的计算方法，也是我国的统一计算方法。总染菌率%=第157页，共284页。可以说产生这种现象大多数是由于工作中“明知故犯”“不负责任”和“侥幸心理”所造成的。（二）染菌原因造成染菌的因素很多，但总结几十年的经验，对绝大部分罐批染菌的原因是比较清楚的但在实际生产中发酵染菌率仍比较高第158页，共284页。例如，灭菌的蒸汽压不足不能灭菌；设备有渗漏不能进罐等等都是众所周知的，但因为有侥幸心理还是照样灭菌，进罐，结果以污染杂菌而告终。现将收集到的国内外几家抗生素工厂发酵染菌原因列于下：第159页，共284页。日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析项目百分率%种子带菌或怀疑种子带菌

9.64接种时罐压跌零0.19培养基灭菌不透0.79总空气系统有菌19.96泡沫冒顶0.48夹套穿孔12.36盘管穿孔5.89接种管穿孔0.39阀门渗漏1.45搅拌轴密封渗漏2.09罐盖漏1.54其它设备渗漏10.13操作原因10.15原因不明24.94第160页，共284页。上海第三制药厂染菌原因分析项目百分率%种子带菌14.15盘管穿孔14.20阀门渗漏23.30空气系统有菌10.0管理不善25.80其它7.49原因不明5.78

第161页，共284页。管理不善而染菌的有31个罐批，占25.08％经分析有下表所列原因：

项目百分率%进罐前未做设备严密度检查25.8接种违反操作规程25.8检修质量缺乏验收制度19.35操作不熟练19.35配料违反工艺规程6.45调度不当3.25第162页，共284页。第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析项目百分率%外界带入杂菌（取样、补料）8.20设备穿孔7.60空气系统有菌26.00停电罐压跌零1.60接种11.00蒸汽压力不足或蒸汽量不足0.60管理问题7.80操作违反规程1.60种子带菌0.60原因不明35.00第163页，共284页。造成染菌的主要原因总结1、设备渗漏设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。第164页，共284页。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占33.85％，上海三厂的分析这类染菌为37.5％。第165页，共284页。2、空气带菌从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带菌而造成的染菌分别为19.96％和26%。国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。第166页，共284页。3、种子带菌种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。第167页，共284页。4、灭菌不彻底灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间——产生过多泡沫蒸汽总压是否达到要求标准环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将连续灭菌预热至800C的培养基采样培养，可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培养中，则仅发现2～3个芽孢杆菌。故染菌率因季节不同而发生明显变化。第168页，共284页。原材料储存和保管，如液胨、玉米浆、母液糖等有机原料——杂菌的数量发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量——有无灭菌的死角对减少或避免染菌仍然是十分必要的。

第169页，共284页。5、技术管理不善技术管理就是要对发酵每个环节严格控制发酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有侥幸心理而放松管理第170页，共284页。三、无菌状况的检测1、环境无菌的检查尘埃粒子检测无菌平板检测第171页，共284页。2、种子及发酵液无菌状况检测酚红肉汤培养基检测平板划线显微镜观察第172页，共284页。四、染菌情况分析染菌的原因有多种，对于实际情况如何分析呢？1、单罐染菌不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效第173页，共284页。2、多罐染菌系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底3、前期染菌种子带菌、培养基灭菌不彻底第174页，共284页。4、中后期染菌补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗漏，一般不会是种子问题第175页，共284页。五、染菌的防止1、防止种子带菌制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。沙土制备时要多次间歇灭菌注意接种时的无菌操作子瓶、母瓶的移种和培养无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌。第176页，共284页。无菌室要求在无菌室中装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时，关灯后15分钟再接种。用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、拖地，开启超净台的通风，接种时必须在超净台上操作，超净台装有一台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不可能进入接种区域，保证无菌条件。接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干净。第177页，共284页。2、防止设备渗漏发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏。设备上一旦渗漏，就会造成染菌，例如冷却盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌。设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能发现。第178页，共284页。水压试漏法试漏方法集气桶试漏法第179页，共284页。水压试漏法。方法是被测设备的出口处装上压力表，将水压入设备，待设备中压力上升到要求压力，关闭进出水，看压力有否下降。压力下降则有渗漏。但有些渗漏很小，看不出何处漏水，可以用稀碱溶液压入设备，然后用蘸有酚酞的纱布揩，只要酚酞能变红处即为渗漏处。阀门渗漏可以用集气桶来试漏。方法是先在集气桶中装满水，然后关闭所有阀门，向发酵罐中通入空气，使罐压上升到要求压力，一般一公斤以上。由于集气桶连通各管道，观察哪根管子冒泡，即这根管子的阀门漏气。第180页，共284页。3、防止培养基灭菌不彻底培养基灭菌方法——高压蒸汽灭菌分批灭菌1210C，30分钟连续灭菌罐温125－1300C，30－45分钟第181页，共284页。蒸汽下进上出第182页，共284页。连续灭菌设备流程第183页，共284页。连消塔第184页，共284页。培养基灭菌前含有大量杂菌，灭菌时如果蒸汽压力不足，就达不到要求的温度；灭菌时产生大量泡沫或发酵罐中有污垢堆积，就会窝藏大量杂菌，造成灭菌不彻底。为什么蒸汽灭菌时会产生大量泡沫呢？培养基和水的传热系数比空气的传热系数大，如果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵罐内的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡沫上升到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接接触，未被杀死。第185页，共284页。防止方法：缓慢开启蒸汽阀门，或加入少量消泡剂。灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些“死角”。这些死角蒸汽不能有效达到，常会窝藏耐热芽孢杆菌.所以设备安装要注意不能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除污垢。所以设备安装要注意不能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除污垢。第186页，共284页。4、防止空气引起的染菌空气过滤除菌设备流程空压机储罐二级冷却加热器空气过滤粗过滤第187页，共284页。空气冷却器的列管穿孔泄露，冷却水会渗入到空气中，造成染菌。棉花-活性炭过滤器长期使用后，棉花和活性炭的体积被压缩而松动，如果上下端棉花铺得厚薄不均，厚的一边阻力大空气不畅通，薄的一边空气容易通过，久而久之，薄的一边长期受空气顶吹而使棉花活性炭改变位置，造成过滤器失效。过滤器用蒸汽灭菌时，若被蒸汽冷凝水润湿就会降低或丧失过滤效能，灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。第188页，共284页。超细纤维纸作过滤介质，灭菌时必须将管道中冷凝水放干净，以免介质受潮失效。在生产实践中，空气管道大多与其它物料管道相接，要装上止逆阀防止其它物料窜入空气管道污染过滤器，导致过滤介质失效。第189页，共284页。5、发酵染菌后的措施染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。第190页，共284页。六、染噬菌体的防治（一）染噬菌体对发酵的影响发酵过程中如果受噬菌体的侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵迟缓或停止，而且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染，使生产无法进行，甚至使种子全部丧失。第191页，共284页。1、镜检可发现菌体数量明显减少，菌体不规则，严重时完全看不到菌体，且是在短时间内菌体自溶。2、发酵pH值逐渐上升，4-8小时之内可达8.0以上，不再下降。3、发酵液残糖高，有刺激臭味，粘度大，泡沫多。4、生产量甚少或增长缓慢或停止有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验染噬菌体表现为：第192页，共284页。（二）产生噬菌体的原因经过1-2年以后，主要是由于生产和试验过程中不断不加注意地把许多活菌体排放到环境中去，自然界中的噬菌体就在活菌体中大量生长，造成了自然界中噬菌体增殖的好机会。通常在工厂投产初期并不感到噬菌体的危害第193页，共284页。这些噬菌体随着风沙尘土和空气流动传播，以及人们的走动、车辆的往来也携带着噬菌体到处传播，使噬菌体有可能潜入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐第194页，共284页。在培养皿上倒入培养生产菌的培养基（加琼脂）作下层。同样的培养基中加入20％～30％培养好的种子液，再加入怀疑染噬