基因工程工具酶培训课件

第二章基因工程工具酶分类：限制性内切酶（RestrictionEndonuclease）RNaseA1.水解酶类核酸酶RNaseT1RNaseHDNaseⅠS1核酸外切酶（Exonuclease）

第二章基因工程工具酶分类：1大肠杆菌DNA聚合酶（DNAPolⅠ)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（KlenowFragment|）

2.DNA聚合酶类嗜热DNA聚合酶（Taq酶）DNA连接酶(Ligase)反转录酶（ReverseTranscriptase)

小牛肠碱性磷酸酶(CIP)3.修饰酶类细菌碱性磷酸酶(BAP)T4噬菌体多核苷酸激酶

（T4PhagePolynucleotideKinase)鼠源禽源

2（一）限制性核酸内切酶的发现（二）限制性核酸内切酶的分类（三）限制性核酸内切酶的命名（四）II型限制性核酸内切酶的基本特性（五）限制性核酸内切酶的消化反应条件一、限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶的发现一、限制性核酸内切酶3由寄主控制的限制和修饰现象---20世纪60年代，Linn和Arber发现(B)(K)大肠杆菌B大肠杆菌KEOP=1EOP=1EOP=10-4EOP=10-4EOP成斑率efficiencyofplating外源DNA自身DNA（一）核酸限制性核酸内切酶的发现限制和修饰现象由寄主控制的限制和修饰现象---20世纪60年代，Linn和4限制—修饰的酶学系统(B)(B)酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰基因组DNA不被切割限制—修饰的酶学系统(B)(B)酶切位点噬菌体DNA酶切5

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶61962年瑞士的W.Arber（阿尔伯）提出细菌的限制修饰系统。1968年发现Ⅰ型内切酶;1968年美国的H.O.Smith发现Ⅱ型内切酶;1970年美国的O.Nathans（内申斯）用Ⅱ型酶制备了肿瘤基因;1978年三人共获诺贝尔生理与医学奖。1962年瑞士的W.Arber（阿尔伯）提出细菌的限7从此，相关研究展开。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的。概念:限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3,5-磷酸二酯键。从此，相关研究展开。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其8（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性

特性1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中I型双功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点5‘端至少1000bp不是（随机）无用II型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+位于识别位点上是非常有用III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3‘端24-26bp处是用处不大（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性特性9（三）限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichiacoli表示为Eco,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示为

Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如EcoRI、HindIII。EcoRⅠ（酶名称）:EscherichiaColiRnisⅠ

属名种名株系编号（三）限制性核酸内切酶的命名EcoRⅠ（酶名称）:Esc10（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性

靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性

交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。能识别外源DNA并将其水解的内切核酸酶，是细菌对外源DNA的防御机制。（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点1、识别位点的特异性11几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvind12与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端cohesiveends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平末端Bluntend在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。

同裂酶isoschizomers

能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。同尾酶isocaudamers

识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamHI、BclI、BglII和XhoI是一组同尾酶。

与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端cohesive13平齐末端带5’－P端的黏性末端带3’－OH和5’－P端的平末端例如HpaⅡ和MspⅠ是同裂酶，识别顺序都是

5’……C|CG

G……3’

3’……G

GC|C……5’

如果其中有5’-甲基胞嘧啶，HpaⅡ不能够切割，MspI能切割。

平齐末端带5’－P端的黏性末端带3’－OH和5’－P端的平14同裂酶切割DNA时，产生相同的粘末端，故被切割得DNA可重组并且重组后产生两种情况A.B,如图：MobIBamHIBglII5’…NGATCN…3’5’N…GGATCC…N3’5’N…AGATCT…N3’3’…NCTAGN…5’3’N…CCTAGG…N5’3’N…TCAAGA…N5’5’…NGATCC…N3’5’N…GGATCT…N3’3’…NCTAGG…N5’3’N…CCTAGA…N5’5’N…GATCC…N3’5’…NGCATCT…N…3’CTAGG…N5’CGTAGA…N…5’A:可被MobI识别切割，但不被B:重组DNA,-不能被上述酶识别BamHI识别切割。与切割。同裂酶切割DNA时，产生相同的粘末端，故被切割得DNA可15注意限制性内切酶对外源DNA的作用无种属特一性：对不同的外援DNA,只要有酶的识别顺序即可切割DNA产生相同的粘末端或平截末端，据此可进行DNA的重组。在A情况下产生的重组体只能被一种酶消化，减少了可逆反应，提高了重组率。转化后还可以用可消化的那种酶(MobⅠ)进行酶切鉴定。在B情况下，产生重组体。不能再被两种酶识别，消除了可逆反应，效率更高。但转化后不能再用这两种酶鉴定。通常选A的情况。注意限制性内切酶对外源DNA的作用无种属特一性：对不同的外援164.不具有甲基化功能

II型限制性核酸内切酶的甲基化修饰作用由相应的甲基化酶承担。5.对单链DNA的切割切割效率较低。4.不具有甲基化功能17酶活单位

一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h内中完全降解1gDNA所需要的酶量。

（五）限制性核酸内切酶的消化反应酶活单位（五）限制性核酸内切酶的消化反应18酶切反应的基本步骤＋－电泳紫外分析37℃1h加反应液CKMBuffer(10×)2.0LddH2O

约16.5LDNA0.2~1.0gEnzyme1～2UVolume20.0L1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT①反应体系②混匀③最适温度,酶量,时间,反应终止④电泳鉴定结果酶切反应的基本步骤＋－电泳紫外分析37℃119在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性，用*表示。

限制性内切酶的第二活力（Secondaryactivity，又称星号活力）指改变了酶的反应条件，使酶原有的识别特异性的降低。例如：EcoRI的典型特异性是核苷酸序列GAATTC，当改变此酶的反应条件时，他的特异性由原来的6核苷酸降低为四核苷酸AATT。在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序20星号活力的产生可为酶提供新的序列特异性，这些活性在某些情况下可能是有用的，但是很少导致第二识别位点的完全或同等的切割，因此为了避免星活力的出现，所有限制性酶切反应均应在标准条件下，通常反应条件通过缓冲液控制。星号活力的产生可为酶提供新的序列特异性，这些活21（六）影响限制性核酸内切酶活性的因素影响酶活性的因素很多，最重要的有：⑴酶纯度⑵DNA的纯度⑶DNA的甲基化程度⑷酶切反应的温度与时间⑸DNA的分子结构⑹限制性核酸内切酶的缓冲液

（六）影响限制性核酸内切酶活性的因素影响酶活性的因素很多，最22（1）酶纯度引起某些酶活力变化的因素较多，包括甘油的浓度，离子的浓度，PH值，有机溶剂的存在，二价阳离子过高的酶和DNA浓度的比例。（2）DNA纯度

铂，酚，氯仿，酒精，EDTA，SDS，盐离子等均影响酶活性。纯度不高，含有蛋白，特别是DNase加入Buffer时因有Mg2+，而激活降解DNA样品，而无特异带。解决办法：扩大反应体积20L—50L延长酶作用时间1h—数小时增加酶用量1u—10u

（1）酶纯度23（3）DNA甲基化程度甲基化程度高不被大多数限制性内切酶切割，解决办法是：选用无甲基化酶的突变菌株；使用对甲基化酶碱基无切割能力的酶（对哺乳动物DNA）。（3）DNA甲基化程度24（4）酶切反应的温度与时间所有限制性内切酶均应在标准条件下进行，大多数最适反应温度是37℃，少数耐热TaqⅠ是65℃；SmaⅠ是25℃（30℃）。反应时间与酶量有关。（5）DNA分子的构型不同构型的影响很大：消化超螺旋环状DNA用的酶量大于线性DNA不同位点切割能力不同（6）限制性核酸内切酶的反应缓冲液Mg2+，Tris-HCl，NaCl或KClß-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)(防止酶氧化,以保持活性)BSA（牛血清白蛋白）稳定酶蛋白。（4）酶切反应的温度与时间25（七）其它水解核酸的酶1.水解RNA的核酸酶(Rnase):种类很多介绍五种酶名称来源最适PH作用特点反应式应用RNaseA胰脏7.9切嘧啶产生ApUpCpNpRNA测序3’p嘧啶核苷酸或以其结ApUp+Cp+Np尾的寡核苷酸RNaseT1米曲霉4.5切G产生3’GpGpGpApCpGp同上或以其为结尾的寡核苷酸Gp+Gp+ApCpGpRNaseU2黑曲霉4.5切A产生3‘APGpApCpApAp同上或以其结尾的寡核苷酸片段GpAp+CpAp+ApRNasephy头绒孢菌不切C产生3’Ap,GpApCpUpGp同上3’Gp,3’Up或以其为结尾片段GpApCpUpGpRNaseH大肠杆菌水解DNA-RNA杂交分子中的RNA（七）其它水解核酸的酶RNaseH大肠杆菌262核酸酶S来自稻谷曲霉高度特异性于单链核酸的内切酶：可催化单链RNA或DNA，降解成5’单核苷酸。同时也可作用于双链核酸分子的单链区（小到一个碱基）。作用：测定杂交分子（DNA-DNA)或(RNA-DNA)的杂交程度，即使是一对碱基没杂交也能检测到。cDNA合成时去掉第一连与第二连的发夹结构测定DNA上内含子的位置

2核酸酶S27（一）DNA连接酶的概念与作用机制（二）连接酶种类及特性的比较

（三）DNA连接酶作用的特点（四）DNA连接酶的反应条件（五）影响连接反应的因素DNA连接的策略（六）T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案二、DNA连接酶及其应用DNA重组的核心技术：DNA片段之间的体外连接——连接酶。（一）DNA连接酶的概念与作用机制二、DNA连接酶及其应用28（一）DNA连接酶的概念与作用机制环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。

首个DNA连接酶(ligase)——1967年，大肠杆菌DNA连接酶，是大肠杆菌基因编码

。1970年，发现了T4DNA连接酶，

由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。概念：DNA连接酶（Ligase）能够催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。（一）DNA连接酶的概念与作用机制环形DNA分子的发29DNA连接酶的催化反应DNAligase+NAD+/ATP↓酶-AMP复合物↓+DNAAMP-DNA↓相邻3’-OH对活化的磷原子发生亲核攻击↓→AMP3’,5’-磷酸二酯键DNA连接酶连接的作用机制DNA连接酶的催化反应DNA连接酶连接的作用机制30（二）连接酶种类及特性的比较

最常用（二）连接酶种类及特性的比较最常用31（三）DNA连接酶作用的特点A.

连接的两条链必须分别具有自由3’-OH和5’-P，而且这两个基团彼此相邻；B.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。E.coliDNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。T4DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。（三）DNA连接酶作用的特点A.连接的两条链必须分别具有自32

是双链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。

OHP××是相邻的－因此不能封闭gap，只能封闭nick.gapNONickOK是双链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。g33（四）T4DNA连接酶连接反应的条件连接酶反应体系体系T载体粘末端平末端10×Buffer1μL1/2μL1/2μLvector50ng3-30fmol15-60fmolInsertfragment100ng9-90fmol45-180fmolLigase0.5μL0.5/1μL0.5/1μLAddddH2Otototal10μL10/20μL10/20μL反应温度4℃/16℃4-8℃/RT15-20℃反应时间1h-过夜4h-过夜/3h4h-过夜酶的灭活75℃15min连接液灭活后最好立即转化或储存于4-8℃，时间不要太长，会降低转化率。（四）T4DNA连接酶连接反应的条件连接酶反应体系体系34DNA末端的浓度较高浓度的DNA，利于分子间连接，形成线性二聚体或多聚体分子。温度（通常在4-16℃）ATP的浓度(10μmol／L—1mol／L)连接酶浓度（一般平末端大约需1～2U，粘末端仅需0.1U）反应时间（通常连接过夜）插入片段和载体片段的摩尔比（1∶1～5∶1）

（五）影响连接反应的因素DNA末端的浓度（五）影响连接反应的因素35（六）T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1．连接反应一般在灭菌的0.2-0.5ml离心管中进行。

2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1～5∶1），补足ddH2O至8μl。

3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。

4．加入含ATP的10×Buffer1μl，T4DNA连接酶合适单位，用ddH2O补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃）连接8-14hr。

（六）T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案36粘性末端DNA片段的连接－DNA连接酶连接法NickNick粘性末端DNA片段的连接－DNA连接酶连接法NickNick37平末端DNA片段的连接－末端同聚物加尾法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶平末端DNA片段的连接－末端同聚物加尾法3’3’5’5’3’38平末端DNA片段的连接－衔接物连接法

衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸组成，具有有1个或几个限制性酶切位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。GGATCCCCTAGG+BamHI切割GATCCG连接酶＋经BamHI切割的pBR322GCCTAGBamHI衔接物dsDNAGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG连接酶重组DNA分子GATCCGGCCTAG如何避免单酶切后产生的相同的粘末端或平末端的自身环化？平末端DNA片段的连接－衔接物连接法衔接物(link39（一）大肠杆菌DNA聚合酶I（二）Klenow片段酶（三）T4DNA聚合酶（四）逆转录酶（反转录酶）三、DNA聚合酶及其应用（一）大肠杆菌DNA聚合酶I三、DNA聚合酶及其应用40（一）大肠杆菌DNA聚合酶I（E.ColiDNApolI）是KornbergA.1956年首先从大肠杆菌E。Coli细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括3种不同的酶活力：5′-3′聚合酶活性（模板，带3′－OH游离基团的引物、4dNTPs、Mg2+）双链特异性的5'→3'核酸外切酶活性3'→5'核酸外切酶活性。从游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+＋4dNTPsATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+＋4dNTPsCCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T（一）大肠杆菌DNA聚合酶I（E.ColiD41

大肠杆菌DNA聚合酶I的三种用途A.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针

利用其5′→3′的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于DNA连接前的大缺口填充

利用5′→

3′的聚合酶活性。C.用于DNA的序列分析

利用5′→3′的聚合酶活性。大肠杆菌DNA聚合酶I的三种用途A.利用42

大肠杆菌聚合酶I的应用示例缺口平移法制备探针PolI+Mg2++［α－32P］dNTPs大肠杆菌聚合酶I的应用示例缺口平移法制备探针Po43

（二）

Klenow片段酶Klenow片段是大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD。酶催活性：⑴5’→3’的聚合酶活性⑵3’→5’的核酸外切酶活性CCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTAKlenow+Mg2+（二）Klenow片段酶Klenow片段是大肠杆44Klenow片段的主要用途（利用5’→3’的聚合酶活性）⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端⑵标记DNA片段的末端底物用［α－32P］－dNTPs

⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成

⑷DNA序列的测定

Klenow片段的主要用途（利用5’→3’的聚合酶活性）45

（三）

T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶是

从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，酶催活性：⑴5′→3′的聚合酶活性⑵3′→5′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶I的活性高200倍。比Klenow片段酶强100～1,000倍。

因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：如果反应体系中仅存在一种dNTP或没有底物时，这时T4DNA聚合酶就会表现出3′→5′外切酶活力，从双链DNA的3′开始降解，直到露出底物dNTP相同的碱基。然后就在此位置发生合成和取代反应。CGTCGCGCAGCGCGTCGCGCAGCGdTTPMg++CGTGCAGCGα－32P－dNTPsMg++（三）T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶是从T46

T4DNA聚合酶的用途1、利用取代合成反应制备探针2、标记具有平末端的或具有3’－隐蔽末端的DNA片段利用较强的3′→5′外切酶活性和5′→3′聚合活性3、用于DNA序列分析——双脱氧终止法对长片段DNA进行测序的理想用酶。T4DNA聚合酶的用途1、利用取代合成反应制备探47

（四）

逆转录酶—Reversetranscriptase逆转录酶是一种依赖RNA的DNA聚合酶。1970年H.M.Temin（美）和D.Baltimore(美)同时分别从禽成髓细胞瘤病毒和鼠白血病病毒中发现了AMVRT和Mo-MLVRT,1975年二人共获诺贝尔生理—医学奖。目前两个酶已经商品化生产。功能：多功能酶，主要有三种酶活性：◆依赖于RNA的DNA聚合酶功能。◆RNaseH功能：水解DNA-RNA杂交分子中的RNA链。◆依赖于DNA的DNA聚合酶功能。AMV-RT与Mo-RT在结构、作用特点上不完全相同，在cDNA文库构建中讲述。（四）逆转录酶—Reversetranscri48oligo(dT)5’3’DNA链3’5’RNAE活性14dNTP3’5’RNA链DNA链RNaseH(活性2)E(活性3）4dNTP3’ds-DNA5’5’3’3’ds-DNA5’5’3’SI核酸酶oligo(dT)5’49（一）末端转移酶（terminaltransferase）（二）SI核酸酶（SInuclease）（三）碱性磷酸酶四、修饰性工具酶（一）末端转移酶（terminaltransferase）50（一）末端转移酶末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到dsDNA或ssDNA的在3’－OH。特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有用。最常见的用途：给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。（一）末端转移酶51平末端DNA片段的末端加尾连接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶平末端DNA片段的末端加尾连接法3’3’5’5’3’3’5’52

（二）SI核酸酶这是一种从米曲霉（Aspergillusoryzae）中分离的高度单链特异的外切酶。活性：可以降解单链DNA或RNA或双链的单链区。ssDNA或RNA5’3’SI酶、Zn2+、pH4.55’dNMPs或5’rNMPsSI酶、Zn2+、pH4.5+带缺口的DNA或RNASI酶、Zn2+、pH4.5黏性末端平末端（二）SI核酸酶这是一种从米曲霉（Aspergi53其主要用途有：⑴在cDNA合成过程中，切开cDNA的发夹末端；⑵载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴，形成平末端结构。其主要用途有：543’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

发夹结构的切除TTAAAATT单链尾巴的切除3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTT55

（三）

碱性磷酸酶从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶（BacterialAlkalinePhosphatase）简称BAP。从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶（CalfIntestinalAlkalinePhosphatase），简称CIP，用的广泛。酶催功能：脱磷酸作用，将单链或双链DNA或RNA5’－P转化成5’－OH。其主要用途有：⑴在用32P标记DNA5′端之前，去除5′端的磷；⑵在DNA重组技术中，去除DNA片段的5′磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。（三）碱性磷酸酶从大肠杆菌中分离的细菌碱性56载体去磷防止自连的应用示例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH连接酶连接酶连接酶碱性磷酸酶CIP寄主修复缺口载体自连或产生二具体等载体去磷防止自连的应用示例POHPOHOHOHOHOHPOH57基因工程的基本步骤基因分离酶切载体酶切基因和载体连接导入细菌重组质粒繁殖重组克隆的选择序列分析和基因表达等研究导入植物细胞基因工程的基本步骤基因分离酶切载体酶切基因和载体连接导入细菌58演讲完毕，谢谢观看！演讲完毕，谢谢观看！59第二章基因工程工具酶分类：限制性内切酶（RestrictionEndonuclease）RNaseA1.水解酶类核酸酶RNaseT1RNaseHDNaseⅠS1核酸外切酶（Exonuclease）

第二章基因工程工具酶分类：60大肠杆菌DNA聚合酶（DNAPolⅠ)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（KlenowFragment|）

2.DNA聚合酶类嗜热DNA聚合酶（Taq酶）DNA连接酶(Ligase)反转录酶（ReverseTranscriptase)

小牛肠碱性磷酸酶(CIP)3.修饰酶类细菌碱性磷酸酶(BAP)T4噬菌体多核苷酸激酶

（T4PhagePolynucleotideKinase)鼠源禽源

61（一）限制性核酸内切酶的发现（二）限制性核酸内切酶的分类（三）限制性核酸内切酶的命名（四）II型限制性核酸内切酶的基本特性（五）限制性核酸内切酶的消化反应条件一、限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶的发现一、限制性核酸内切酶62由寄主控制的限制和修饰现象---20世纪60年代，Linn和Arber发现(B)(K)大肠杆菌B大肠杆菌KEOP=1EOP=1EOP=10-4EOP=10-4EOP成斑率efficiencyofplating外源DNA自身DNA（一）核酸限制性核酸内切酶的发现限制和修饰现象由寄主控制的限制和修饰现象---20世纪60年代，Linn和63限制—修饰的酶学系统(B)(B)酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰基因组DNA不被切割限制—修饰的酶学系统(B)(B)酶切位点噬菌体DNA酶切64

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶651962年瑞士的W.Arber（阿尔伯）提出细菌的限制修饰系统。1968年发现Ⅰ型内切酶;1968年美国的H.O.Smith发现Ⅱ型内切酶;1970年美国的O.Nathans（内申斯）用Ⅱ型酶制备了肿瘤基因;1978年三人共获诺贝尔生理与医学奖。1962年瑞士的W.Arber（阿尔伯）提出细菌的限66从此，相关研究展开。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的。概念:限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3,5-磷酸二酯键。从此，相关研究展开。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其67（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性

特性1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中I型双功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点5‘端至少1000bp不是（随机）无用II型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+位于识别位点上是非常有用III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3‘端24-26bp处是用处不大（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性特性68（三）限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichiacoli表示为Eco,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示为

Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如EcoRI、HindIII。EcoRⅠ（酶名称）:EscherichiaColiRnisⅠ

属名种名株系编号（三）限制性核酸内切酶的命名EcoRⅠ（酶名称）:Esc69（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性

靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性

交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。能识别外源DNA并将其水解的内切核酸酶，是细菌对外源DNA的防御机制。（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点1、识别位点的特异性70几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvind71与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端cohesiveends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平末端Bluntend在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。

同裂酶isoschizomers

能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。同尾酶isocaudamers

识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamHI、BclI、BglII和XhoI是一组同尾酶。

与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端cohesive72平齐末端带5’－P端的黏性末端带3’－OH和5’－P端的平末端例如HpaⅡ和MspⅠ是同裂酶，识别顺序都是

5’……C|CG

G……3’

3’……G

GC|C……5’

如果其中有5’-甲基胞嘧啶，HpaⅡ不能够切割，MspI能切割。

平齐末端带5’－P端的黏性末端带3’－OH和5’－P端的平73同裂酶切割DNA时，产生相同的粘末端，故被切割得DNA可重组并且重组后产生两种情况A.B,如图：MobIBamHIBglII5’…NGATCN…3’5’N…GGATCC…N3’5’N…AGATCT…N3’3’…NCTAGN…5’3’N…CCTAGG…N5’3’N…TCAAGA…N5’5’…NGATCC…N3’5’N…GGATCT…N3’3’…NCTAGG…N5’3’N…CCTAGA…N5’5’N…GATCC…N3’5’…NGCATCT…N…3’CTAGG…N5’CGTAGA…N…5’A:可被MobI识别切割，但不被B:重组DNA,-不能被上述酶识别BamHI识别切割。与切割。同裂酶切割DNA时，产生相同的粘末端，故被切割得DNA可74注意限制性内切酶对外源DNA的作用无种属特一性：对不同的外援DNA,只要有酶的识别顺序即可切割DNA产生相同的粘末端或平截末端，据此可进行DNA的重组。在A情况下产生的重组体只能被一种酶消化，减少了可逆反应，提高了重组率。转化后还可以用可消化的那种酶(MobⅠ)进行酶切鉴定。在B情况下，产生重组体。不能再被两种酶识别，消除了可逆反应，效率更高。但转化后不能再用这两种酶鉴定。通常选A的情况。注意限制性内切酶对外源DNA的作用无种属特一性：对不同的外援754.不具有甲基化功能

II型限制性核酸内切酶的甲基化修饰作用由相应的甲基化酶承担。5.对单链DNA的切割切割效率较低。4.不具有甲基化功能76酶活单位

一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h内中完全降解1gDNA所需要的酶量。

（五）限制性核酸内切酶的消化反应酶活单位（五）限制性核酸内切酶的消化反应77酶切反应的基本步骤＋－电泳紫外分析37℃1h加反应液CKMBuffer(10×)2.0LddH2O

约16.5LDNA0.2~1.0gEnzyme1～2UVolume20.0L1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT①反应体系②混匀③最适温度,酶量,时间,反应终止④电泳鉴定结果酶切反应的基本步骤＋－电泳紫外分析37℃178在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性，用*表示。

限制性内切酶的第二活力（Secondaryactivity，又称星号活力）指改变了酶的反应条件，使酶原有的识别特异性的降低。例如：EcoRI的典型特异性是核苷酸序列GAATTC，当改变此酶的反应条件时，他的特异性由原来的6核苷酸降低为四核苷酸AATT。在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序79星号活力的产生可为酶提供新的序列特异性，这些活性在某些情况下可能是有用的，但是很少导致第二识别位点的完全或同等的切割，因此为了避免星活力的出现，所有限制性酶切反应均应在标准条件下，通常反应条件通过缓冲液控制。星号活力的产生可为酶提供新的序列特异性，这些活80（六）影响限制性核酸内切酶活性的因素影响酶活性的因素很多，最重要的有：⑴酶纯度⑵DNA的纯度⑶DNA的甲基化程度⑷酶切反应的温度与时间⑸DNA的分子结构⑹限制性核酸内切酶的缓冲液

（六）影响限制性核酸内切酶活性的因素影响酶活性的因素很多，最81（1）酶纯度引起某些酶活力变化的因素较多，包括甘油的浓度，离子的浓度，PH值，有机溶剂的存在，二价阳离子过高的酶和DNA浓度的比例。（2）DNA纯度

铂，酚，氯仿，酒精，EDTA，SDS，盐离子等均影响酶活性。纯度不高，含有蛋白，特别是DNase加入Buffer时因有Mg2+，而激活降解DNA样品，而无特异带。解决办法：扩大反应体积20L—50L延长酶作用时间1h—数小时增加酶用量1u—10u

（1）酶纯度82（3）DNA甲基化程度甲基化程度高不被大多数限制性内切酶切割，解决办法是：选用无甲基化酶的突变菌株；使用对甲基化酶碱基无切割能力的酶（对哺乳动物DNA）。（3）DNA甲基化程度83（4）酶切反应的温度与时间所有限制性内切酶均应在标准条件下进行，大多数最适反应温度是37℃，少数耐热TaqⅠ是65℃；SmaⅠ是25℃（30℃）。反应时间与酶量有关。（5）DNA分子的构型不同构型的影响很大：消化超螺旋环状DNA用的酶量大于线性DNA不同位点切割能力不同（6）限制性核酸内切酶的反应缓冲液Mg2+，Tris-HCl，NaCl或KClß-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)(防止酶氧化,以保持活性)BSA（牛血清白蛋白）稳定酶蛋白。（4）酶切反应的温度与时间84（七）其它水解核酸的酶1.水解RNA的核酸酶(Rnase):种类很多介绍五种酶名称来源最适PH作用特点反应式应用RNaseA胰脏7.9切嘧啶产生ApUpCpNpRNA测序3’p嘧啶核苷酸或以其结ApUp+Cp+Np尾的寡核苷酸RNaseT1米曲霉4.5切G产生3’GpGpGpApCpGp同上或以其为结尾的寡核苷酸Gp+Gp+ApCpGpRNaseU2黑曲霉4.5切A产生3‘APGpApCpApAp同上或以其结尾的寡核苷酸片段GpAp+CpAp+ApRNasephy头绒孢菌不切C产生3’Ap,GpApCpUpGp同上3’Gp,3’Up或以其为结尾片段GpApCpUpGpRNaseH大肠杆菌水解DNA-RNA杂交分子中的RNA（七）其它水解核酸的酶RNaseH大肠杆菌852核酸酶S来自稻谷曲霉高度特异性于单链核酸的内切酶：可催化单链RNA或DNA，降解成5’单核苷酸。同时也可作用于双链核酸分子的单链区（小到一个碱基）。作用：测定杂交分子（DNA-DNA)或(RNA-DNA)的杂交程度，即使是一对碱基没杂交也能检测到。cDNA合成时去掉第一连与第二连的发夹结构测定DNA上内含子的位置

2核酸酶S86（一）DNA连接酶的概念与作用机制（二）连接酶种类及特性的比较

（三）DNA连接酶作用的特点（四）DNA连接酶的反应条件（五）影响连接反应的因素DNA连接的策略（六）T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案二、DNA连接酶及其应用DNA重组的核心技术：DNA片段之间的体外连接——连接酶。（一）DNA连接酶的概念与作用机制二、DNA连接酶及其应用87（一）DNA连接酶的概念与作用机制环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。

首个DNA连接酶(ligase)——1967年，大肠杆菌DNA连接酶，是大肠杆菌基因编码

。1970年，发现了T4DNA连接酶，

由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。概念：DNA连接酶（Ligase）能够催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。（一）DNA连接酶的概念与作用机制环形DNA分子的发88DNA连接酶的催化反应DNAligase+NAD+/ATP↓酶-AMP复合物↓+DNAAMP-DNA↓相邻3’-OH对活化的磷原子发生亲核攻击↓→AMP3’,5’-磷酸二酯键DNA连接酶连接的作用机制DNA连接酶的催化反应DNA连接酶连接的作用机制89（二）连接酶种类及特性的比较

最常用（二）连接酶种类及特性的比较最常用90（三）DNA连接酶作用的特点A.

连接的两条链必须分别具有自由3’-OH和5’-P，而且这两个基团彼此相邻；B.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。E.coliDNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。T4DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。（三）DNA连接酶作用的特点A.连接的两条链必须分别具有自91

是双链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。

OHP××是相邻的－因此不能封闭gap，只能封闭nick.gapNONickOK是双链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。g92（四）T4DNA连接酶连接反应的条件连接酶反应体系体系T载体粘末端平末端10×Buffer1μL1/2μL1/2μLvector50ng3-30fmol15-60fmolInsertfragment100ng9-90fmol45-180fmolLigase0.5μL0.5/1μL0.5/1μLAddddH2Otototal10μL10/20μL10/20μL反应温度4℃/16℃4-8℃/RT15-20℃反应时间1h-过夜4h-过夜/3h4h-过夜酶的灭活75℃15min连接液灭活后最好立即转化或储存于4-8℃，时间不要太长，会降低转化率。（四）T4DNA连接酶连接反应的条件连接酶反应体系体系93DNA末端的浓度较高浓度的DNA，利于分子间连接，形成线性二聚体或多聚体分子。温度（通常在4-16℃）ATP的浓度(10μmol／L—1mol／L)连接酶浓度（一般平末端大约需1～2U，粘末端仅需0.1U）反应时间（通常连接过夜）插入片段和载体片段的摩尔比（1∶1～5∶1）

（五）影响连接反应的因素DNA末端的浓度（五）影响连接反应的因素94（六）T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1．连接反应一般在灭菌的0.2-0.5ml离心管中进行。

2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1～5∶1），补足ddH2O至8μl。

3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。

4．加入含ATP的10×Buffer1μl，T4DNA连接酶合适单位，用ddH2O补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃）连接8-14hr。

（六）T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案95粘性末端DNA片段的连接－DNA连接酶连接法NickNick粘性末端DNA片段的连接－DNA连接酶连接法NickNick96平末端DNA片段的连接－末端同聚物加尾法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶平末端DNA片段的连接－末端同聚物加尾法3’3’5’5’3’97平末端DNA片段的连接－衔接物连接法

衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸组成，具有有1个或几个限制性酶切位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。GGATCCCCTAGG+BamHI切割GATCCG连接酶＋经BamHI切割的pBR322GCCTAGBamHI衔接物dsDNAGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG连接酶重组DNA分子GATCCGGCCTAG如何避免单酶切后产生的相同的粘末端或平末端的自身环化？平末端DNA片段的连接－衔接物连接法衔接物(link98（一）大肠杆菌DNA聚合酶I（二）Klenow片段酶（三）T4DNA聚合酶（四）逆转录酶（反转录酶）三、DNA聚合酶及其应用（一）大肠杆菌DNA聚合酶I三、DNA聚合酶及其应用99（一）大肠杆菌DNA聚合酶I（E.ColiDNApolI）是KornbergA.1956年首先从大肠杆菌E。Coli细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括3种不同的酶活力：5′-3′聚合酶活性（模板，带3′－OH游离基团的引物、4dNTPs、Mg2+）双链特异性的5'→3'核酸外切酶活性3'→5'核酸外切酶活性。从游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+＋4dNTPsATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+＋4dNTPsCCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T（一）大肠杆菌DNA聚合酶I（E.ColiD100

大肠杆菌DNA聚合酶I的三种用途A.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针

利用其5′→3′的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于DNA连接前的大缺口填充

利用5′→

3′的聚合酶活性。C.用于DNA的序列分析

利用5′→3′的聚合酶活性。大肠杆菌DNA聚合酶I的三种用途A.利用101

大肠杆菌聚合酶I的应用示例缺口平移法制备探针PolI+Mg2++［α－32P］dNTPs大肠杆菌聚合酶I的应用示例缺口平移法制备探针Po102

（二）

Klenow片段酶Klenow片段是大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD。酶催活性：⑴5’→3’的聚合酶活性⑵3’→5’的核酸外切酶活性CCGATAGCCTG