第十章 基因工程技术育种

第九章基因工程技术育种第一节基因工程概述第二节鱼类的基因工程技术育种

★1、概念：是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。第一节基因工程概述也称为DNA重组技术(DNARecombination)或分子克隆(Molecularcloning)★2、诞生：

1971年，美国Smith,H.O.

等分离出一种限制性酶，可酶切病毒的DNA分子；

1972年：Ｂerg,P.

等实现不同酶切DNA片段的体外连接；

1973年：Cohen,s.等将体外重组的DNA

转入大肠杆菌细胞并得以表达。

★３、基本过程：⑴从供体细胞中分离出目的基因(“切”)

；⑵用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子(“接”)；⑶借助细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞(“转”)；⑷培养转化细胞，以扩增DNA重组分子，使其整合到受体细胞的基因组中（“增”）；⑸鉴定转化细胞，获得外源基因高效表达细胞（“检”）；基因工程的操作过程可简化为：切、接、转、增、检目的基因的分离与鉴定(一)从基因库中分离基因(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因(三)人工合成基因

★限制性内切核酸酶(restrictionenzymes)：

在细菌中此酶的功能是降解外来DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。

第Ⅱ类限制性酶：能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列—回纹对称序列。载体一个DNA片段只有与适合的载体DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效率地进入宿主细胞(hostcell)，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。(vector)★作为载载体DNA分子，需具备备四个个条件件：⑴具复复制原原点(ori)，能携带带的外外源DNA片段独独立地地自我我复制制；⑵具有有多克克隆位位点，即具有有多种种限制制性酶酶的切切点，用于克克隆外外源DNA片段；；⑶至少少具有有一个个选择择标记记基因因；⑷易从从宿主主细胞胞中回回收。1.细菌质质粒◆质粒是是细菌菌细胞胞内独独立于于细菌菌染色色体而而自然然存在在的、能自我我复制制、易分离离和导入的的环状状双链链DNA分子。☆这些质质粒的的适应应范围围广，，拷贝贝数多多。进进入宿宿主细细胞复复制后后，每每个细细胞的的质粒粒拷贝贝数可可高达达1000个。2.λλ噬菌体体3.穿梭载载体DNA连接酶酶能催催化双双链DNA切口处处的5′-磷酸根根和3′-羟基生生成磷磷酸二二酯键键。这这种反反应需需要供供给能能量，，大肠肠杆菌菌和其其他细细菌的的DNA连接酶酶以NAD+作为能能量来来源，，动物物细胞胞和噬噬菌体体的连连接酶酶则以以ATP作为能能量来来源。。DNA连接酶酶(DNAligase)修复双双链DNA缺口处处的磷磷酸二二酯键键连接多多个平平头双双链DNA分子：：目的基基因与与载体体的连连接(DNA分子重重组)重组DNA分子导导入宿宿主细细胞●转化(transformation):指将质质粒DNA或以它它为载载体构构建的的重组组质粒粒导入入细菌菌中的的过程程。●转染(transfection):指病毒毒及其其重组组子导导入受受体细细胞的的过程程.●转导(transduction):指噬菌菌体及及其重重组子子导入入受体体细胞胞的过过程转化(1)氯化钙钙法●1970年M.Mandel和A.Hige发现,大肠杆杆菌经经过氯氯化钙钙适当当处理理及短短暂热热休克克之后后,便能吸吸收λ噬菌体体DNA。1972年美国国斯坦坦福大大学S.Cohen报道,经氯化化钙处处理大大肠杆杆菌细细胞也也能摄摄取质质粒DNA。(2)电穿孔孔法电穿孔孔法(electroporation):是指在在一个个较大大的电电脉冲冲短暂暂破坏坏细胞胞膜的的脂质质双层层，从从而允允许DNA等分子子通过过细胞胞膜进进入细细胞，，而后后细胞胞膜快快速复复原，，保持持细胞胞的完完整。。这种种方法法称为为电穿穿孔法法。转化子子的鉴鉴定转化子子的外外源基基因表表达★4.基因工工程的的应用用(一)基因工工程工工业(二)植物基基因工工程(三)转基因因动物物(四)基因治治疗◆胰岛素素的人人工生生产◆植物基基因工工程根癌农农杆菌菌介导导的植植物转转化◆植物基基因转转化：：是指指将外外源基基因转转移到到植物物细胞胞内、、并整整合到到植物物基因因组中中稳定定遗传传和表表达的的过程程。◆根癌农农杆菌菌介导导的植植物转转化◆转基因因动物物与转基基因植植物相相比，转基因因动物物的发发展要要慢些些。◆例如，，利用用转基基因羊羊大量量表达达人类类的抗抗胰蛋蛋白酶酶。◆将人的的抗胰胰蛋白白酶α-1基因克克隆在在羊奶奶产生生相关关基因因启动子子的下下游，，这种种启动动子仅仅在乳乳腺细细胞中中表达达，使使羊奶奶中含含有大大量有有功能能的人人类抗抗胰蛋蛋白酶酶；◆可利用用家禽禽作为为生物反反应器器，生产产人类类大量量需要要的重要蛋蛋白质质。◆基因治治疗◆利用基基因工工程技技术，，将特特异基基因导导入并并整合合到具具有遗遗传缺缺陷的的患者者的基基因组组中，，以治治疗遗遗传疾疾病的的方法法，通通常叫叫做基基因治治疗(genetherapy)。◆目前最最常用用的方方法是是利用用病毒毒DNA作载体体，构构建重重组DNA分子，，用病病毒包包装物物包装装后形形成的的重组组去毒毒病毒毒感染染患者者的细细胞，，将正正常基基因整整合到到染色色体上上。第二节节鱼鱼类类基因因工程程以鱼类类为研研究对对象，，应用用基因因工程程技术术于鱼鱼类遗遗传育育种和和海水水鱼类类资源源开发发研究究的一一门应应用性性，技技术强强的分分支学学科。。本节以以海洋鱼鱼类为研究究对象象进行行介绍绍。进入上上世纪纪90年代，，我国国水产产品总总量已已跃居居世界界首位位，水水产养养殖产产量超超过捕捕捞产产量，，水产产业的的发展展由捕捕捞型型转向向增养养型。。其中，，海水水养殖殖的发发展尤尤为迅迅速。。相比比贝类类和虾虾类养养殖，，海水水鱼类类的养养殖发发展较较慢。。制约因因素较较大的的是越越冬问问题，，多数数海水水养殖殖品种种在4℃以上才才能越越冬，，8℃℃以上才才能摄摄食和和维持持缓慢慢生长长。其其次海海水鱼鱼的遗遗传育育种和和全人人工繁繁殖育育苗问问题尚尚未彻彻底解解决，，育苗苗成活活率较较低。。根据目目前研研究现现状和和发展展趋势势，海海水鱼鱼类基基因工工程的的研究内内容主要为为：分离和和克隆隆海水水鱼类类中的的有用用基因因;筛选适适用海海水鱼鱼类基基因克克隆和和表达达的载载体及及表达达体系系。利用转转基因因技术术，将将外源源基因因导入入海水水鱼中中，培培育性性状优优良的的转基基因海海水鱼鱼类品品系。。1.海水鱼鱼类基基因的的分离离和克克隆基因的的分离离包括括构建建基因因文库库和从从基因因文库库中筛筛选分分离目目的基基因两两大步步骤。。几种重重要的的海水水鱼类类基因因生长激激素基基因抗冻蛋蛋白基基因催乳素素基因因和生生长催催乳素素基因因抗冻蛋蛋白基基因大多数数海水水鱼类类的血血清在在-0.6℃℃即冻结结，因因此无无法在在温度度过低低的海海域中中生存存，但但仍有有一些些海水水鱼类类可以以生存存在这这些严严寒海海域中中。早在1957年，Scholander等人首首次观观察和和研究究了这这些鱼鱼类的的抗冻冻特性性。他他们发发现在在北极极海水水鱼的的血清清中存存在一一种生生物大大分子子，它它们起起着降降低血血清凝凝固点点的作作用。。此此后，，DeVries等人从从南极极鱼血血清中中分离离和分分析了了这种种生物物大分分子，，发现现它们们是一一类有有特殊殊化学学结构构的糖糖蛋白白，称称为抗抗冻糖糖蛋白白（AFGP）。上世纪纪80年代，，加拿拿大Choy等人发发现了了另一一类抗抗冻蛋蛋白。。他们们从产产自北北大西西洋沿沿岸海海域的的美洲洲大绵绵鳚、、冬鲽鲽和杜杜父鱼鱼中分分离出出3种类型型的抗抗冻蛋蛋白（（AFP）。当当AFP增至一一定浓浓度，，可以以完全全抑制制冰晶晶的形形成，，因此此即使使在低低于-1.7℃℃的低温温条件件下，，含有有一定定浓度度AFP的血清清也不不会冻冻结，，这就就是极极地和和北大大西洋洋海域域的海海水鱼鱼能够够在严严寒海海水中中生存存的原原因。。用这几几种抗抗冻蛋蛋白基基因构构建的的各种种表达达重组组体已已经成成功地地应用用于转转抗冻冻蛋白白基因因鱼类类的研研究和和基因因工程程菌表表达生生产抗抗冻蛋蛋白的的应用用研究究。2.海水鱼鱼类的的基因因转移移在海水水鱼类类基因因工程程育种种研究究方面面，目目前所所开展展的工工作主主要是是应用用转基基因技技术将将外源源目的的基因因导入入受体体鱼类类的生生殖系系细胞胞内，，使之之整合合于受受体细细胞的的染色色体中中，通通过改改变受受体鱼鱼遗传传物质质组成成的方方式达达到培培育优优良性性状的的新品品种的的目的的。鱼类转转基因因技术术研究究始于于淡水水鱼。。1985年，我我国学学者朱朱作言言等人人首次次报道道了转转基因因鱼试试验成成功。。他们们将小鼠金金属硫硫蛋白白启动动子-人生长长激素素基因因组体体（mMT-hGH）导入金金鱼受受精卵卵中，，获得得了第第一批批转基基因鱼鱼。海海水鱼鱼类的的转基基因研研究直直到90年代初初才有有报道道，加加拿大大研究究者成成功地地将海水鱼鱼的生生长激激素基基因和和抗冻冻蛋白白基因因导入入鲑科科鱼类类，培育育出个个体较较对照照鱼30倍的““超级级鱼””和能能够表表达抗抗冻蛋蛋白的的转基基因大大西洋洋鲑。。我国国研究究者者在在世世纪纪初初也也将将海海水水鱼鱼生生长长激激素素成成功导导入入我我国国重重要要的的海海水水经经济济鱼鱼类类真真鲷鲷和和牙鲆鲆，，培培育育出出生生长长速速度度明明显显加加快快的的转转基基因海海鱼鱼群群体体。。鱼类类作作为为转转基基因因研研究究的的实实验验动动物物，，比比哺哺乳乳动动物物等等具具有有更更多多的的优优点点：：鱼类类怀怀卵卵量量大大，，一一次次可可产产几几万万个个至至几几十十万万个个；；大多多数数种种鱼鱼类类的的卵卵子子卵卵径径大大，，卵卵质质透透明明，，便便于于进进行行显显微微注注射射等等遗遗传传操操作作；；鱼类类是是体体外外受受精精体体外外发发育育，，易易于于进进行行人人工工受受精精和和控控制制胚胚胎胎发发育育的的条条件件。。2.1.显微微注注射射法法显微微注注射射法法是是目目前前最最常常用用的的方方法法，，导导入入外外源源基基因因的的成成功功率率也也比比较较高高。。主主要要包包括括两两种种方方式式：：(1)卵母母细细胞胞的的细细胞胞核核注注射射；；(2)受精精卵卵的的细细胞胞质质注注射射。。显微微注注射射法法的的优优点点是是外外源源基基因因的的导导入入整合合效效率率较较高高，缺缺点点是是需需要要贵贵重重精精密密仪仪器器，，技术术操操作作难难度度较较大大，，并并且且外外源源基基因因的的整整合合位位点点和和整整合合的的拷拷贝贝数数都都无无法法控控制制，，易易造造成成宿宿主主动动物物基基因因组组的的插插入入突突变变，，引引起起相相应应的的性性状状改改变变，，重重则则致致死死。并并且且，，显显微微操操作作处处理理对对鱼鱼类类卵卵子子有有机械械损损伤伤，，受受精精卵卵的的成成活活率率受受到到很很大大影影响响。2.2电脉脉冲冲法法外源源DNA在电电脉脉冲冲作作用用下下进进入入受受精精卵卵。。谢岳岳峰峰等等(1989)以泥泥鳅鳅脱脱膜膜受受精精卵卵为为材材料料，，电电穿穿孔孔转转移移外外源源基基因因，，获获得得了了10%的转转基基因因泥泥鳅鳅。。Powers(1992)采用用电电穿穿孔孔法法和和显显微微注注射射法法，，将将线线性性化化DNA导入入斑斑马马鱼鱼、、斑斑鲴鲴和和鲤鲤受受精精卵卵。。电电穿穿孔孔法法产产生生的的转转基基因因鱼鱼数数量量比比显显微微法法的的多多。。Zhao(1993)证明明电电穿穿孔孔导导入入的的GH基因因不不仅仅能能表表达达，，而而且且还还能能遗遗传传。。Powers(1992)采用用电电穿穿孔孔法法获获得得的的转转基基因因斑斑马马鱼鱼和和鲤鲤的的子子一一代代约约一一半半携携带带外外源源基基因因并并能能有有效效表表达达。。缺点优点操作作比比较较简简单单，，是是处处理理大大量量的的受受精精卵卵的的理理想想方方法法。缺点点是是导导入入无无定定向向性性，，转转移移率率较较低低，，针针对对不不同同种种鱼鱼需需要要建建立立相相应应的的电电脉脉冲冲条条件件(脉冲冲电电压压、、脉脉冲冲时时间间、、脉脉冲冲次次数数、、间间隔隔时时间间、、脉脉冲冲介介质质)等。。2.3精子子载载体体导导入入法法利用用精精子子作作为为转转基基因因载载体体，，借借助助受受精精作作用用把把外外源源基基因因导导入入受受精精卵卵，，整整合合到到受受精精卵卵的的基基因因组组中中，，是是构构建建转转基基因因动动物物的的一一种种新新的的尝尝试试。。目前鱼类类的成功功报道有有6种。Khoo等(1992)将斑马鱼鱼精子与与pUSVCAT质粒在PBS中22℃保育30~40min，得到23.3%(环状质粒粒DNA)和37.5%(线状质粒粒DNA)的阳性率率。Sin等(1993)将大鳞大大麻哈鱼鱼的精子子与外源源基因混混合，经经电脉冲冲处理后后再受精精，获得得5％～10%的转基因因阳性率率。于健康等等(1994)将金鱼精精子与AFP基因在Niu——Twitty液中4℃保温30min后，再与与卵子受受精，经经PCR法和Southernblot分子杂交交法检查查，阳性性率为26%。该法较简简单、方方便，依依靠生理理受精过过程，免免去了对对原核的的损伤。。通过此此法获得得的精卵卵受精和和受精卵卵成活率率几乎不不会受到到影响。。但精子子携带基基因转移移法仍存存在转基基因阳性性率低、、转移率率不稳定定等缺点点。2.4染色体片片段显微微注入法法这是一种种超大型型外源DNA转移获得得转移染染色体鱼鱼的方法法。就是是从染色色体上显显微切割割特定的的染色体体片段，，然后注注入受体体动物受受精卵中中。3.外源基因因整合的