现代分子生物学技术基础之转基因动物和基因打靶技术的分子生物学基础

现代分子生物学技术基础转基因动物和基因打靶技术的分子生物学基础一、转基因动物二、基因打靶技术三、转基因和基因打靶技术的应用一、转基因动物(transgenicanimal)是指基因组中稳定地整合了以实验方法导入的外源基因、并能遗传给后代的一类动物。被导入的外源基因称为转基因(transgene).

转基因动物实验技术包括:转基因动物的制备和运用转基因动物进行后续的研究和开发,后者涉及面广.转基因鼠研究最为深入，以小鼠为例介绍转基因动物制备的过程获取外源目的基因外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物并植入转基因胚胎的发育筛选、鉴定稳定品系的转基因动物繁育转基因小鼠品系

转基因动物技术的主要步骤1制备转基因动物的基因转移方法

1）显微注射法

2）精子介导的DNA转移3）反转录病毒介导DNA转移4）胚胎干细胞转染5）体细胞核移植技术6）其他方法:限制性酶介导的整合等。1）显微注射法(microinjection)：

是发展最早、目前使用最广、最有效的方法.

通过显微操作仪将外源基因注入受体动物的受精卵,转基因可迅速发生整合，由此发育而成的小鼠就是转基因小鼠。然而，DNA在受精卵分裂后发生整合更为常见，这种情况产生的小鼠是一个嵌合体。它既含有转化细胞也含有非转化细胞。若转化的细胞发育成生殖系细胞，则转基因就传递给下一代小鼠。

2）精子介导的DNA转移

精子头在体外可自发地与DNA结合,精子可以用作DNA转移工具。将具有受精能力的精子与外源DNA一起孵育后用于体外受精,并进行胚胎移植,外源基因可整合到基因组。

3）反转录病毒介导基因转移用重组小鼠反转录病毒感染植入前小鼠胚胎或将反转录病毒注射到早期植入后小鼠胚胎。一个载体DNA拷贝会稳定整合到宿主基因组，使小鼠胚胎一些细胞稳定转化，产生嵌合体，后者可繁育出转基因后代。4）通过胚胎干细胞转染制备转基因鼠小鼠胚胎干（ES）细胞来自于交配后3.5-4.5天的胚胎，并产生于囊胚的内细胞团。电击法、逆转录病毒载体法、脂质体包装法等转染方法将目的基因载体转染体外培养的ES细胞。

将转染后的ES细胞注射到宿主囊胚中，再植入假孕母鼠体内，该胚胎将发育成嵌合体。其生殖系若整合了外源基因，经适当交配可获得纯合转基因小鼠．5）体细胞核移植技术将体细胞核植入去核的卵细胞中，体细胞核被卵细胞重新程序化，无论供体细胞的分化状态如何，使其能够重新演绎发育的整个过程。

通常所说的动物克隆指体细胞克隆，即动物的无性繁殖。英国科学家Wilmut等于1997年首次报道应用体细胞核移植技术生产出遐迩闻名的多利羊

若供体细胞核是经过转染而添加了转基因，将其移植到去核卵后发育而成的动物就将是克隆的转基因动物。第一次证实这种设想的是Schniekeetal.他用人的凝血因子IX基因转染培养的羊成纤维细胞，生产一个克隆的转基因羊，叫Polly,在它的乳汁中产出了重组蛋白IX

因子。1998年4月与威尔士山羊戴维产下邦尼，证明了克隆动物也能生育。2003.2.14日苏格兰向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫实施了安乐死。由于早衰问题，人们怀疑“多莉是穿着羔羊服装的老羊”。2转基因表达的调控在一个转基因动物中，转基因的出现其自身并不足以能产生有功能的产物。独立获得的带有相同转基因构件的转基因动物，其转基因表达的水平或模式并不一定相同。影响转基因表达的因素：

1）表达构件上的序列

2）宿主基因组内因素1）表达构件上的序列：

组成性启动子使转基因在任何组织、任何时候都能很强地表达。一般来源于病毒：如SV40早期启动子和增强子，Rous肉瘤病毒长末端重复序列（LTR）启动子和增强子等．没有时空特异性。

将转基因与适当的组织或细胞特异性启动子连接在一起，可获得所期望的空间表达模式。例如，神经特异性烯醇化酶基因只在成熟神经元中表达，其上游1.8kb长的调节元件可调节转基因小鼠中转基因在神经组织特异性表达.

通过诱导型启动子最大限度调控基因时间表达模式，它可通过调控一个特殊化学物质供给而开或关基因。

2）宿主基因组内因素转基因整合是随机的,受局部调节元件和染色质结构的影响而产生位置效应。整合到一个增强子附近，其表达可能增强；若转基因整合到异染色质结构域内，则其表达受抑制。转基因技术的共同特点是导入的外源基因随机整合。其结果可能如下:①能够有效地表达,且不影响动物发育及

正常生理功能。②不能有效表达,整合入动物细胞基因组中的外源基因无功能。③外源基因整合导致动物细胞正常基因

失活或激活癌基因,动物不能正常发育、繁殖。二、基因定点整合技术—基因打靶(genetargeting)

基因打靶:

是利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源序列发生同源重组的性质,以定点修饰改造染色体上某一基因的方法。

基因打靶的可能结局如下:(1)在受体细胞基因组中定点引入一个原本不存在的完全新的基因,称之为基因

击入(geneknock-in)。(2)靶基因被灭活，即基因敲除(geneknock-out)(3)靶基因被导入的外源基因替代基因打靶的原理:同源重组。是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或相似DNA序列间(同源序列间)的重组。体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为“靶子”,经构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”,外源基因进入受体细胞后不再随机整合,而是“弹头”锚准“靶子”进行准确的定点整合。1）、获得外源目的基因2）、靶向载体选择3）、构建同源打靶重组子4）、小鼠ES细胞的准备5）、打靶重组子导入ES细胞及药物选择6）、靶向基因-ES细胞转入囊胚7）、ES-胚胎移入假孕的雌性受体鼠及发育8）、嵌合小鼠的近亲交配1基因打靶的步骤:

打靶载体中的主要结构成分:(1)与靶基因同源的DNA片段

(2)质粒基本骨架.(3)标记基因:

由于真核细胞中同源重组的发生率很低,需在载体上添加用于选择的

(正、负)标记基因,筛选打靶重组的靶细胞.

由于同源重组的频率很低,因而筛选并富集真正发生了同源重组的细胞至关重要。学者们设计了正负双向选择系统,鉴别定点与随机整合。正选择基因多为neo基因,整合neo基因的细胞对G418具有抗性.负选择基因常用HSV-TK

基因,可使无毒的丙氧鸟苷(GANC)转变为毒性核苷酸,而杀死细胞.

2基因打靶的筛选系统同源重组时,只有同源区以内部分发生重组,同源区以外部分被切除。置换型载体含有正负选择基因各一,正选择基因多为neo

基因,位于同源区内,其在随机整合和同源重组(定点整合)中均正常表达。负选择基因如HSV-TK在靶基因同源区之外．在同源重组时,TK基因将被切除而丢失,而随机整合时TK基因保留。用G418作正筛选,选出含有neo基因的细胞株(整合的细胞),未整合的细胞被G418杀死。再用丙氧鸟苷（GANC）作负筛选淘汰含有TK基因的细胞(随机整合的细胞),保留未含TK基因的同源重组(定点整合)的细胞。根据打靶载体的设计不同,同源重组可以在靶基因位点造成插入、置换或缺失,目前被广泛接受和使用的基因打靶设计策略如下:

插入型载体策略置换型载体策略

“打了就走”策略(HitandRunStrategy)

标记和交换法等3基因打靶策略插入型载体策略载体设计时,选择标记基因在同源序列之外或之内,导入宿主细胞前将打靶载体在同源区制造一个线性化缺口,整个载体插入染色体同源区,使同源序列增加一个拷贝

缺点:不能直接区别出外源DNA定点整合或随机插入的细胞克隆,

留下的选择标记基因可能影响邻近基因表达,并可能产生串联重复序列不稳定,发生第二次重组.打靶载体靶基因座同源重组后的基因座置换型载体策略

打靶载体同源区内插入正选择基因(如neo基因)以筛选出打靶载体整合入基因组的细胞;负选择基因(如tk基因)连在同源区外侧，同源重组时发生双交换,负选择基因被切除；随机整合时,负选择基因被插入基因组中。据此可筛选出定点整合的细胞此方法是目前应用较广泛的一种策略。打靶载体靶基因座同源重组后的基因座以上两种方法共同的缺点：靶位点上最终留下了有转录活性的外源标记基因,

不利于研究基因组中更精细、复杂的改变.

又建立了一些改进的技术“打了就走”策略(HitandRunStrategy)该方法分两步进行:

第一步:设计含有HSV-tk基因、neo

基因和所需突变序列的插入型载体,转染入宿主细胞后将整个插入靶位点。用G418富集发生整合的细胞。

第二步:插入的重复序列区可自发进行第二次染色体内同源重组,将负选择标记基因、载体序列和一个拷贝的同源序列切除,可留下带有理想突变的靶基因,用TK抗性筛选富集发生了染色体内重组的细胞“打了就走”策略(HitandRunStrategy)

打靶载体靶基因座同源重组后的基因座1染色体内发生同源重组同源重组后的基因座2优点:无标记基因残留

缺点:第二步染色体内重组无法控制,可能最后留在基因组中的仍是无突变的原始基因.

又建立了标记和交换法(TagandExchange)等

需构建两个打靶载体,进行两步同源重组。第一个打靶载体是含HSV-tk和neo基因的置换型载体,两选择基因均位于同源区内,转染细胞用G418筛选neo阳性重组克隆。

第二步构建含有突变目的基因的打靶载体,此载体与第一步的重组克隆再进行重组,使突变基因替代第一步的同源片断,用GANC

筛选第二次发生同源重组的克隆。

此方法能更精确地引入突变,以研究基因突变在个体水平的意义标记和交换策略打靶载体1靶基因座打靶载体2同源重组后的基因座1同源重组后的基因座2常规基因打靶技术优点:外源基因能定点整合,问题:基因打靶无明显时空特异性。4

条件性基因打靶技术:通过基因转移对基因座上的基因进行有限制的修饰：可局限于某种细胞组织类型、某个发育阶段或二者兼而有之。条件性基因打靶技术是在常规基因打靶技术基础上使用了重组酶系统，特别是Cre/loxP系统。

Cre重组酶是在噬菌体中发现的酶体系,可识别特异的loxP位点，后者是一段34bp的DNA回文结构。若两个loxP位点方向相同，Cre重组酶将它们之间的间隔序列切除.Cre/loxP系统发挥作用的途径有三种:1在一种动物系中整合含loxP

位点的打靶载体

;另一种动物系中整合和表达Cre基因,使两种动物系的个体间交配可诱导产生重组;2用质粒或病毒载体瞬时表达Cre基因;3体外产生和纯化Cre蛋白,需要时直接注射到细胞.

“条件性”主要由控制Cre酶的时空特异性表达来实现，采用不同时空特异性表达的启动子启动Cre酶表达，能在小鼠发育的特定阶段或特定组织达到条件性基因打靶目的。尤其是“条件性基因敲除”。

第一步,构建置换型打靶载体,并在目的基因两侧分别引入loxP

位点。若两个loxP位点方向相同，它们之间的间隔序列将被切除.

应用此打靶载体产生含两个loxP位点和标记基因的转基因敲除小鼠。“条件性基因敲除”策略

第二步,若需在感兴趣的特定细胞中表达Cre重组酶:再构建一个Cre重组酶表达载体，含有组织或细胞特异性的基因启动子,获得这样的转基因小鼠。

将两只小鼠杂交,可获得既含有loxP位点,又在特定细胞中启动Cre重组酶表达的小鼠。Cre重组酶对loxP位点进行识别,而将loxP位点之间的靶基因切除,在特定细胞中灭活靶基因。

对于时间和发育阶段特异性基因打靶来说,主要通过加入时间和发育阶段特异性基因的启动子或可诱导性启动子来实现。Gu等报道DNA聚合酶β的条件敲除。

基因打靶方法用一个两侧带有loxP序列的同源基因片段替代内源基因一个重要外显子。带有这种靶突变的小鼠与带有在T淋巴细胞特异性启动子控制下的Cre转基因品系小鼠交配。杂交的后代被确认含有两个转基因并且生长到成年。Cre产物只在T淋巴细胞表达，敲除T淋巴细胞中靶基因的重要外显子并使其失活。基因组编辑（genomeediting）指对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等识别特定序列的核酸酶➔DNA断点➔修复＋编辑：非同源端连接机制；同源重组机制核酸酶：锌指核酸内切酶（ZFN）：锌指蛋白+FOK1转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN）CRISPR/Cas9系统三、

转基因和基因打靶技术在生物医学中的应用▶1基因表达和功能的研究在动物中添加基因、选择性删除和改变特异基因,为整个有机体内基因功能分析奠定了有力的基础。2疾病模型的建立：自然界已提供一些疾病动物模型，有些是通过随机突变产生的，但它们不是按照预想方式产生。用基因转移技术可以建立特定突变基因型动物，增加它们在遗传和表型水平与人类疾病相似的机会。▶3重组蛋白质的生产。培养的细胞和转基因动物可作为生产重组蛋白质的“生物反应器”。因为在哺乳动物系统重组蛋白质经历了真正的转录后修饰，因此它在生产治疗性人蛋白质上具有特殊优势。▶4）基因治疗潜力的开发人体细胞的基因转移使基因缺陷的纠正和改善成为可能。动物模型的研究为该研究奠定了重要基