单基因遗传性疾病分子诊断

单基因遗传病的分子生物学检验MolecularDiagnosisforMonogenicInheritedDiseases遗传病分类

单基因遗传病

多基因遗传病

体细胞遗传病

染色体病

线粒体遗传病第一节概述基因突变点突变(PointMutation)插入或缺失(Indels)缺失或重复(Deletion/Duplication)基因倒位(Inversion)基因融合(Fusion)动态突变(Dynamic)单基因遗传病分子生物学检验的策略直接诊断间接诊断血红蛋白病血友病迪谢内营养不良症脆性X综合症成年型多囊肾第二节血红蛋白病的分子生物学检验镰状细胞贫血（SICKLECELLANAEMIA）1949年世界上最早发现的第一个分子病，由此开创了疾病分子生物学。患者出生半年后，症状和体征逐渐出现，生长发育不良，易发生感染。有贫血、黄疸和肝、脾增大，心、肺功能常受损，可发生充血性心力衰竭,甚至产生肌肉骨骼痛、腹痛等痛性危象。诊断：本病的诊断并不困难，重要的是要考虑到本病的可能性而不遗漏本病。根据种族和家族史、镰变试验阳性、血红蛋白电泳显示主要成分为HbS，再结合临床表现，即可明确诊断。实验室检查：1.外周血血红蛋白为50～100g/L。网织红细胞计数常在10%以上。红细胞大小不均，可见有核红细胞、靶形红细胞、异形红细胞。镰状红细胞并不多见，若发现则有助于诊断。通常采用“镰变试验”检查有无镰状细胞。2.骨髓象示红系显着增生，在再生障碍危象时增生低下，在巨幼细胞危象时有巨幼细胞变。3.血清胆红素轻～中度增高，溶血危象时显着增高。本病的溶血虽以血管外溶血为主，但也存在着血管内溶血。4.血浆结合珠蛋白降低，血浆游离血红蛋白可能增高。5.红细胞半衰期测定显示红细胞生存时间明显缩短至5～15天[正常为(28±5)天]。6.血红蛋白电泳显示HbS占80%以上，HbF增多至2%～15%，HbA2

正常，而HbA缺如。β珠蛋白基因的第6位密码子由正常的GAG突变为GTG（A→T），使其编码的β珠蛋白N端第6位氨基酸由正常的谷氨酸变成了缬氨酸，形成HbS。这种血红蛋白分子表面电荷改变，出现一个疏水区域，导致溶解度下降。在氧分压低的毛细血管中，溶解度低的HbS聚合形成凝胶化的棒状结构，使红细胞变成镰刀状。ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA

ATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA

已知突变Gene部位和性质，合成寡和苷酸探针，32P标记，进行SouthernBlot杂交/斑点杂交。NormalβΑGeneProbeMutationβSGeneProbeASO探针诊断正常探针突变探针βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS斑点杂交结果点突变：SouthernBlot斑点杂交PCR-RFLPPCR-测序PCR-SSCPDHPLCβ地中海贫血LCRεGγAγψβ1δβIVS-IIVS-IIEXON-IIVS-IEXON-IIIVS-IIEXON-III-29(A→G)-28(A→G)Codons14-15(+G)Codons17(A→T)IVS-Int1(G→T)IVS-Int5(G→C)Codons41-42(-4bp)Codons43(G→T)Codons71-72(+A)IVS-IInt654(G→T)0.1%6.5%0.6%11.8%0.6%5.3%0.1%17.0%中国人β地贫突变位点与频率31.8%14.1%1．PCR-RDB（反向点杂交）2．PCR-ASO3．AS-PCR4．基因芯片5．突变寡核苷酸延伸扩增反向点杂交同时诊断β基因多个点突变M1M2M3M4M5M6

正常探针突变探针

基因芯片技术

现在已经开发了多种诊断β地贫的芯片检测阅读系统，系统多采用国际先进的PCR体外扩增结合DNA芯片反向点杂交检测技术，可快速准确检测全血样本中β珠蛋白基因上多个基因位点的突变

在β珠蛋白基因第2内含子第654位核苷酸C→T突变（IVS-II-654C→T，简称b654），是中国人所特有的，而且是最常见的β地贫基因突变之一，占中国人b地贫总数的17%。β654mRNA的剪接模式ABCb-globingenemRNA(N)mRNA(M)IVSIIVSII654*579↓73bpIVSIIVSIINormalPatient254bp181bpRT-PCRα地中海贫血ζψζψα2ψα1α2α1θ1ζψζψα2ψα1α1θ1ζψζψα2ψα1θ1表型基因型正常人αα/αα静止型α地中海贫血α－/αα轻型α地中海贫血－－/ααHbH病α－/－－HbBart综合征－－/－－α地贫的基因诊断α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1～4个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个αGene时可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe14kb10kbaa/aaaa/a-aa/--a-/----/--

正常缺1缺2缺3缺4

血友病是一种遗传性出血性疾病。发病原因是由于患者的血液中先天缺乏某种因子，根据缺乏因子的不同分为三种类型：血友病甲（缺乏凝血因子VⅢ，又称血友病A）、血友病乙（缺乏凝血因子Ⅸ，又称血友病B）和血友病丙（缺乏凝血因子Ⅺ）。血友病A和血友病B均属X性联隐性遗传，一般由女性传递，男性发病。血友病丙较少见，为常染色体不完全隐性遗传，男女均可发病。通常所说的血友病是指血友病甲。第三节血友病的分子生物学检验血友病ＡFⅧ的基因结构

FⅧ基因位于X染色体长臂末端（Xq28），包括26个外显子和25个内含子，全长186kb血友病Ａ的遗传方式和基因突变遗传方式：XR至1994年已报道FⅧ基因点突变174种，缺失117种，插入10种。由于导致HAFⅧ基因的点突变多，故在实际工作中不可能对每一病人作点突变的检测，所以DNA多态性的连锁分析仍然是血友病Ａ基因诊断的常用手段。PCR-RFLP连锁分析法（间接诊断）是正常的突变基因FVIII基因倒位第四节迪谢内肌营养不良的分子生物学检验Thedystrophingeneisthelargestgenefoundinnature,measuring2.4Mb第五节脆性X综合征的分子生物学检验ExpandedRepeats-HuntingtonDisease(CAG)10-26(CAG)35-41(CAG)42-121(CAG)27-35NormalAtriskforexpansionVariablepenetranceAffectedATCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGTTCRepeatExpansions主要通过基因和DNA多态的连锁分析作出诊断。连锁分析是基于遗传标记与致病基因连锁，子代是否获得遗传标记间接地判断做出诊断。遗传标记是基因组中的DAN多态性位点，如RFLP，VNTR等。间接诊断例：成年型多囊肾病——APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKD——基因定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APK