Western Blot实验详细步骤

WesternBlot实验技术制胶SDS分离胶配方表检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。上样先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。上样时从左到右依次上样。若上样组不多时，左右第一孔不加样。要预留Marker的上样孔。电泳转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。（转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。）转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。装置运行时需冰浴。）封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fatmilk封闭）。将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA效果更好）倒好。将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。一抗抗体反应主要采用间接法:即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二抗物质有放射性核素，酶，以及生物素等。将封闭后的杂交膜，在摇床上用TBST洗膜3次×5min，加入经TBST稀释的一抗（用血清封闭液）4℃孵育过夜或室温摇动孵育2-4小时回收一抗稀释液洗膜1、之后，在摇床上用TBST洗膜3次×5min，二抗加入标记的二抗室温1-2小时，二抗不回收注意：一抗稀释液（稀释2000到4000）及孵育条件，孵育时间最好严格按说明书要求来做。例如：CST某些磷酸化抗体要求5%BSA稀释液稀释，4℃平缓震荡过夜。根据不同的目的条件和目标抗体，可剪膜后孵育抗体，即便做单一条带，仍推荐剪膜，在相同体积抗体下，更小的膜可以使抗原和抗体孵育更充分。回收的一抗可加入叠氮钠抑菌（-20°保存影响不大）。二抗作用时间不可太长，2小时之后已无抗原抗体结合，导致背景过深。洗膜1、在摇床上用TBST洗膜3×5min显影打开电源，预冷成像系统，同时开机，打开GE成像软件，等待显示cameraready。暗室红灯下操作，按EP管中加显色剂A、B（4℃保存）按1：1剂量混匀，ECL发光液现配现用。

用滤纸吸干PVDF膜上的TBST洗涤液。平整铺上保鲜膜，将配好的ECL发光液均匀的涂布于PVDF蛋白膜上，盖上另一半保鲜膜，放上合适大小的胶片，保鲜膜平整赶走气泡，关闭成像仪盖子，开始曝光。曝光时间：根据需要，可先曝10-30s，视首曝决定是否再曝，或曝光时间。曝光后可对图像进行调节，通过调试背景亮度及曝光度。显色后strippingStrippingsolution:100mM2-mercaptoethanol,2%(w/v)SDS,62.5mMTris-HCl,pH6.7

方法：将用过的膜浸入strippingbuffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TBST洗4*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。该方法的优点：省事，省力，省钱。

常见问题聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法（常用）和光聚合法。PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳：体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同；带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统：由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性；带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率比连续系统电泳的较好。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。SDS各试剂作用1.过硫酸铵（APS）为催化剂2.四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂：在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构3.SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。4.强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。5.聚丙烯酰胺——为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液选择tris－HCL系统；AP——提供自由基；TEMED——催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）——阳离子去污剂，作用：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。⒈配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCl缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素，当然其他的因素也可以从多方面考虑。⒉样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或β-巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。⒊SDS电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，选择Tris－HCl系统，TEMED与AP：AP催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺，催凝剂，加速AP催化作用；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。⒋提高SDS电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。⒌“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。⒍“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。⒎为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。⒏为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。⒐什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。⒑为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。⒒为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7）；适当降低电压；⒓为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。处理办法：电泳槽正确装配即可。⒔浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。⒕凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。⒖电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。⒗分离胶加上后为什么要立即加水？加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。⒘连续分离胶体系配制（凝胶板厚度0.75mm，长度10cm）100ml体系：双蒸水37.5ml尿素20--50g10×TBE缓冲液8ml30%丙烯酰胺10mlAPS（过硫酸铵）500--800ul[注：现配现用]TEMED（四甲基乙二胺）23.5ulSDS－PAGE电泳的原理及浓缩胶浓缩样品的原理（甘氨酸的作用）

SDS（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术。下面就SDS的基本原理做简单介绍。

SDS－PAGE电泳的基本原理？

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，

SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，

与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为

特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移

速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分

子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它

的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS电泳成功的关键是什么？

①溶液中SDS单体的浓度

SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在，能与蛋白质分子结合的是单体。为了保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1∶4

或1∶3。

②样品缓冲液的离子强度

因为SDS结合到蛋白质上的量仅仅取决于平衡时SDS单体的浓度，不是总浓度，而只有在低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。所

以，SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10-100

mM。

③二硫键是否完全被还原

只有二硫键被完全还原以后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。Sample

buffer中的β-巯基乙醇的浓度常为4-5%，二硫苏糖醇的浓度常为2-3%。前者有挥发性，最好使用前加入。

SDS缓冲液系统的选择，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸盐或者其他？

一般来说，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键

的。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于15

kDa的蛋白样品，可以使用SDS-尿素系统，也可以采用Tris-tricine缓冲系统。

积层胶（或称浓缩胶）的作用原理？

在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在pH6.7时很少解离，其有效泳动速率很低，而氯离子却有很高的泳动速率，蛋白质的泳动速率介于两者之间。加上电

压以后，作为先导离子的氯离子和尾随离子的甘氨酸离子分离开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场强度成反比，这一区带便获得较高的

电压梯度，加速甘氨酸离子的泳动，使其赶上氯离子，建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速率乘积相等的稳定态（我不太明白这句话），使这些带电颗粒以相

同的速度泳动，两种离子之间有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，界面后有一高电压梯度。由于在移动界

面前的蛋白质分子泳动速率比氯离子低，因此氯离子能迅速越过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中，其泳动速率比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质

分子堆积到一起，形成一条狭窄的区带。蛋白质在移动界面中的浓度作用仅取决于样品和浓缩胶中Tris-HCl的浓度（为什么？），而与样品中蛋白质的最初

浓度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶，故对蛋白样品没有分子筛作用。当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时，凝胶的pH明显增加，导致甘氨酸大量解离。此

时，甘氨酸的有效泳动速率明显增加，超越蛋白分子，直接在氯离子后移动。由于凝胶孔径变小，蛋白质分子的迁移速率降低，落在后面的蛋白质便在均一的电压梯

度和pH环境中泳动，并根据其固有的电荷与分子大小进行分离。

可见，甘氨酸并非作为缓冲成分参与，而是作为尾随离子来参与电泳过程。

以上内容主要摘自《蛋白质电泳实验技术》第二版（郭尧君编著)。需要进一步了解相关内容的同学可以查阅该书。

SDS电泳小问答

Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？

A：SDS-聚丙烯酰胺

凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），

SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，

与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为

特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移

速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分

子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它

的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？

A：在SDS－PAGE不连续电

泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，

其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳

动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的

增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进

行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

Q：样品如何处理？

A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1、还原SDS处理：在还原剂中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳

中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。

2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul

20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

Q：SDS电泳凝胶中各主要成分的作用？

A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；

制胶缓冲液：