植物检疫病害症状观察

实验指导实验一植物检疫病害症状观察一、目的要求通过对几种植物检疫病害的症状观察，了解植物检疫病害的种类及其多样性，初步认识几种植物检疫病害，为今后病害的诊断奠定基础。二、仪器与用品实体显微镜、手持放大镜、症状挂图、模型等。三、实验材料（1）小麦矮腥黑穗病(TilletiacontroversaKuhn)（2）玉米霜霉病(Peronosclerosporaspp)（3）玉米干腐病(DiplodiazeaeLev.)（4）棉黄萎病(VerticilliumdahliaeKleb.)（5）栗疫病(Endothiaparasitica(Murr.)P.J.etH.W.Anders)（6）苹果黑星病(Venturiainaequalis(Cooke)Wint.)（7）水稻细菌性条斑病(Xanthomonasoryzaepv.Oryzicolakuhn)（8）柑橘溃疡病(Xanthomonascitri(Hasse)Dowson)（9）松材萎蔫线虫病(BursaphelenchusxylophilusNickle)（10）甘薯茎线虫病(DitylenchusdetructorThorne)（11）花生根结线虫病(MeloidogynehaplaGhitwood)（12）南方菜豆花叶病(Southernbeanmosaicvirus)（13）柑橘黄龙病(CitrusHuanglungbin)（14）毒麦(LoliumtemulentumL.)（15）假高梁(Sorghumhalepense(L.)Pers.)四、观察内容和方法1．病状观察：观察各类病害标本的危害部位以及变色、坏死、斑点、腐烂、畸形等，归纳各标本病状特点。2．病症观察：借助手持扩大镜或实体解剖镜观察各种标本的病症特点，是否有霉层、粉、黑点及溢脓等病原菌的繁殖体或营养体。3．观察要点（1）小麦矮腥黑穗病(TilletiacontroversaKuhn)植株特矮，比健壮株矮25%～66%，病株叶上有枯黄色条状病斑；分蘖较多，比正常株多1倍以上；病穗的小穗小花增多，紧密，病穗比正常穗宽大。菌瘿坚实，比麦粒小，近球形、呈深褐色；有鱼腥味。（2）玉米霜霉病(Peronosclerosporaspp)引起系统症状，病叶淡绿至淡黄色或苍白色，紫色条纹和条斑，湿度高时在叶背面形成灰白色霉状物，即病菌的无性繁殖体――游动孢子囊梗和游动孢子囊。引起玉米霜霉病的病原有4种――玉米霜指霉Peronosclerosporamaydis(Racid.)Shaw、菲律宾霜指霉P.philippinensis(Weston)Shaw、甘蔗霜指霉P.sacchari(Miyake)ShiraletHara、高梁霜指霉P.sorghi(WestonetUppal)Shaw。（3）玉米干腐病(DiplodiazeaeLev.)玉米地上部均可发病，但茎秆和果穗受害重。茎秆、叶鞘染病多在近基部的4—5节或近果穗的茎秆产生褐色或紫褐色至黑色大型病斑，后变为灰白色。叶鞘和茎秆之间常存有白色菌丝，严重时茎秆折断，病部长出很多小黑点，即病原菌的分生孢子器。果穗染病多表现早熟、僵化变轻。剥开苞叶可见果穗下部或全穗籽粒皱缩，苞叶和果穗间、粒行间常生有紧密的灰白色菌丝体。病果穗变轻，易折断。严重的籽粒基部或全粒均有少量白色菌丝体，散生很多小黑点。纵剖穗轴，穗轴内侧、护颖上也生小黑粒点，这些症状是识别该病的重要特征。（4）棉黄萎病(VerticilliumdahliaeKleb.)苗期很少发生，一般在棉株现蕾期开始发病，开花结铃期为发病盛期。病株从下部叶片先表现症状，逐渐向上发展。病叶的边缘或主脉之间叶肉出现不规则形、淡黄色斑块。扩大后，主脉附近仍保持绿色，其他部分均变黄色，使叶片呈“西瓜皮状”花斑或“掌状”斑纹，病叶边缘变褐色枯焦。病叶一般不脱落，或自下而上脱落呈光秆。潮湿时病斑上产生白色粉状霉层。剖视病株茎秆，可见木质部导管变褐色。（5）栗疫病(Endothiaparasitica(Murr.)P.J.etH.W.Anders)主要危害主干，亦危害侧枝及枝条，结果树的主枝基部及桠杈处易发病。当年新枝感病，初期在病部表皮出现水渍状、边缘不规则、淡褐至褐色病斑，略隆起，后逐渐扩展，向上下蔓延，直到包围树干。病部组织早期湿腐，有酒糟味，失水后树皮干缩纵裂。树枝连年被害后，病部周围产生愈伤组织，病部变粗，树皮纵裂更趋明显。病皮下常产生黑色小粒点，即病菌的分生孢子器，突破表皮后外露。雨后或湿度大时，常涌出扭曲的丝状、堆状橙黄色的分生孢子角。（6）苹果黑星病(Venturiainaequalis(Cooke)Wint.)主要为害叶片和果实，也能侵害叶柄、花、芽及嫩枝等部位。叶片发病，病斑初为淡黄绿色的圆形或放射状，后渐变褐色，最后变为黑色；病斑直径3～6毫米或更大些；病斑周围有明显的边缘，老叶上更为明显；叶片患病较重时，使叶片变小，变厚，呈卷曲或扭曲状。叶柄被侵染，病斑呈长条形。花梗被害，呈黑色，造成花和幼果的脱落。果实受害，病斑刚开始淡黄绿色，圆形或椭圆形，逐渐变褐色或黑色，表面产生黑色绒状霉层。随着果实生长膨大，病斑逐渐凹陷，硬化，龟裂。（7）水稻细菌性条斑病(Xanthomonasoryzaepv.Oryzicolakuhn)主要为害叶片。病斑初为暗绿色水浸状小斑,很快在叶脉间扩展为暗绿至黄褐色的细条斑，大小约1×10mm，病斑两端呈浸润型绿色。病斑上常溢出大量串珠状黄色菌斑,干后呈胶状小粒，发病严重时条斑融合成不规则黄褐至枯白大斑，与稻白叶枯病类似，但对光看可见许多半透明条斑。另外白叶枯病斑上菌溢不多且不常见到，而细菌性条斑上则常布满小珠状细菌液。（8）柑橘溃疡病(Xanthomonascitri(Hasse)Dowson)叶片受害，最初在叶背出现黄色或暗黄绿色针头大小的油渍状斑点，扩大后，成为近圆形米黄色的病斑，穿透叶片，病斑两面突起，后病部表皮破裂，表面粗糙，木质化，呈灰白色或灰褐色，病部中心凹陷，周围有黄色或黄绿色的晕环，在紧靠晕环处常有褐色的釉光边缘。枝梢和果实受害，病斑特征基本与叶片病斑相似，木质化程度更高，病斑隆起和开裂更显著，但无黄色晕圈。（9）松材萎蔫线虫病(BursaphelenchusxylophilusNickle)线虫侵害木质部，病树针叶变为红褐色，导致全株枯萎死亡，但病叶长时间不脱落，是病害的显著特点。（10）甘薯茎线虫病(DitylenchusdetructorThorne)主要为害薯块，因侵染源不同，症状表现糠心型、裂皮型及混合型3种。糠心型种薯带有线虫，线虫从病秧侵入到块根，从块根顶端发病，后逐渐向下部及四周扩展，起先呈棉絮状白色糠道，后变为褐色，即称核心，有时从外表看不出来，仅重量轻；裂皮型主要由土壤传染，线虫用吻针刺破营块外表皮，钻入内部为害，初外皮褪色，后变青，有的稍凹陷或生小裂口，皮下组织变褐发虚，最后皮层变为暗紫色多龟裂，内部呈褐白色干腐状；混合型既发生糠心，也出现裂皮。（11）花生根结线虫病(MeloidogynehaplaGhitwood)病株生长缓慢或发黄不长，植株矮小，始花期叶片变黄瘦小，叶缘焦枯，提早脱落。花小且开花晚，结果少或不结果。线虫也可侵害果壳、果柄和根颈，果壳受害形成乳白突起的小瘤，后期虫瘤呈褐色疮痂状，但较少见。果柄和根茎形成葡萄状虫瘤簇。（12）南方菜豆花叶病(Southernbeanmosaicvirus)产生退绿斑驳和花叶症。不同品种症状有所差异，有的仅产生坏死斑，有的产生皱缩和沿脉变色症。（13）柑橘黄龙病(Liberobacterasiaticum)以夏、秋新梢发病最多。初期的典型症状是在浓绿的树冠中出现1～2条或多条的发黄枝梢，整张叶片均匀黄化或叶片呈黄绿相间的斑驳状，叶质硬化、无光泽，但在黄梢下部的老叶仍呈正常绿色。后从初发病的枝梢以下的新梢由上而下陆续出现均匀黄化或斑驳症状。随着病程扩展，新长出的新梢日渐细小，在病枝上常见脱了叶的新梢逐渐变成枯枝，并日渐增多，最后全株枝梢都表现症状，最后病树逐渐枯死。（14）毒麦(LoliumtemulentumL.)幼苗基部紫红色，后变绿色，成株茎秆光滑坚硬，叶片狭而薄，叶背光滑，叶面较粗糙，叶脉明显。比小麦矮或比小麦高，穗形扁狭长，波浪形弯曲，每穗具8—19个小穗，每小穗有2—6颗籽粒，互生在穗轴上，小穗上籽粒排成2行，除顶端小穗有2颖外，其它小穗第一颖缺，第二颖大而狭，长短与小穗差不多。籽粒被内、外稃紧包，不易脱离，其腹面可见明显的小穗轴节段，籽粒长椭圆形，腹沟宽，坚硬，无光泽，灰褐色。分长芒毒麦Loliumtemulentumvar．longiaristatumParnell．和田毒麦Loliumtemulentumvar.arvenseBab．两个变种。(15)假高梁(Sorghumhalepense(L.)Pers.)异名顾买草、石茅、阿拉伯高粱、宿根高粱。多年生草本植物，具长的根茎，秆直立，高达1～3米；叶阔，绒状，披针形，中脉白色且加厚；圆锥花序大，15～50cm，淡紫色至紫黑色；主轴粗糙，分枝轮生；小穗成对，无芒，一具柄，一无柄，穗轴顶部3枚小穗且无柄；颖果倒卵形，棕褐色，无光泽，千粒重3.5～4.5g。五、实验作业将观察结果填入下表病害名称寄主名称发病部位症状特点实验二种子洗涤检验法一、目的要求掌握种子洗涤检验法，确定麦种样品表面附着带菌种类和带菌量。二、基本原理洗涤法是种子检验常用的方法之一，用于检测种子表面附着的真菌孢子或颖壳上的病原线虫，如黑粉菌的厚垣孢子、霜霉菌的卵孢子、锈菌的夏孢子以及半知菌的分生孢子等。其方法是将一定量的被检样品放入容器中，加入一定量的无菌水，充分振荡一定时间，使样品表面所带的病菌孢子尽量洗涤下来，而后将洗涤液经离心机沉淀，镜检沉淀物，确定病原菌种类并计数。影响洗涤检验结果可能的因素：（1）洗涤可能不彻底；（2）离心管内悬浮液表面常形成一层极难沉降的孢子薄膜，使部分孢子粘在管壁上；（3）制片时，悬浮液滴于玻片上，由于孢子迅速下降，造成一些视野间孢子分布不均匀；（4）盖玻片下悬浮液的厚薄不同或液滴的大小不同，都可能增加误差。三、材料、试剂与仪器材料带菌麦种。试剂蒸馏水、无菌水、0.1％吐温溶液等。3．仪器显微镜、振荡器、离心机、血球计数器、接物测微尺、药物天平、三角瓶（100ml）、烧杯（100ml）、刻度离心管、滴管、镊子、载玻片、二甲苯（双层瓶装）、镜头纸、脱脂纱布等。四、实验操作从被检种子样品中取25放入三角瓶中，加无菌水50ml，再加0.1％吐温溶液1～2滴，将三角瓶加塞后在振荡器上振荡5～10分钟。将洗涤液分装于两支刻度离心管中，在天平上称重平衡后，放入离心机的对称孔中，以每分钟1500转速度离心5分钟。用吸管吸去上层部分清水，留下1ml管底沉淀液，将两管底沉淀液摇匀，合并后备用。镜检和测定孢子负荷量（通常采用两种方法）。1）普通玻片法①用吸管或滴管吸取上述沉淀液，滴一滴于载玻片中央，小心盖上盖玻片，使这一滴悬浮液正好布满在盖玻片下边，同时避免产生气泡。将载玻片放在显微镜底予定放大倍数下观察，在盖玻片的整个面积下，按图1方式检查10个视野，记录每视野下的病菌孢子种类及数量，重复观察5个玻片，计算每视野下的平均孢子数A。②用测微尺测出所用显微镜一定倍数的目镜与物镜组合放大下的视野直径，在求出视野面积(пr2)，算出所用盖玻片面积（n2，n=18或n=20）包含的视野个数。③测定所用滴管或吸管每毫升洗涤液的滴数m。可用量筒盛水10ml，用滴管或吸管数完10ml的水滴数，求出每毫升水的平均滴数，作为每毫升洗涤液的滴数。④按下面公式计算平均每克种子上的带菌量：每克种子所带孢子数＝（K﹡A﹡L）/W其中，A＝平均每个视野下的孢子数。L＝孢子悬浮液总毫升数。K＝n2／（пr2）﹡m,表示每毫升洗涤液所含有的视野数。W=样品种子的克数。2）血球计数板测数法血球计数板为一特制的厚型载玻片，在其中部有三条玻璃台，中间台上刻有一对每边长1mm的大方格，大方格各边分为20等分，因此1mm2的大方格等分为400个小方格。两边台比中间台高出0.1mm，所以加盖玻片后，形成一个液层深度，也是0.1mm，由以上数据可得出：大方格面积＝1mm×1mm＝1mm2大方格体积＝1mm2×0.1mm＝0.1mm3一个小方格体积＝0.1mm3／400＝1/4000mm3已知：1ml＝1000mm3所以1ml体积应含有的小方格数K＝1000mm3÷1/4000mm3＝4×106个小方格因此每ml菌液中含有的孢子数＝K×N每克种子所带孢子数＝K×N×L/W其中N＝一个小方格中孢子的平均数。L＝计数孢子的洗涤液总毫升数。W＝供检验种子克数。具体实验步骤如下：①取血球计数板一个，用无菌滴管吸取摇匀的菌液少许，滴在中间玻璃台网格上，不要使两边玻璃台沾上菌液，以免加盖玻片后造成中间台上液层深度的误差。②取干净盖玻片一张，盖在两边玻璃台上，勿使产生气泡，使多余的菌液流入液槽内，静止数分钟，使孢子沉积于平面上。③将计数板置载物台上夹稳，先用低倍镜找到方格的位置，再用高倍镜测数，由于生活细胞的折光率和水的折光率相似，观察时应减弱光的亮度。④载高倍镜下，观察五个视野，每个视野任意计数五个小方格内的孢子数，位于小方格四边的压线孢子，只计两边，另两边不计。然后求出一个小方格的孢子平均数。⑤测数完毕，取下盖玻片，用清水把血球计数板冲洗干净，用吸水纸轻轻吸去台上附着的水分，再用擦镜纸小心吸干计数板，注意勿使网格受到磨损，然后放入盒内保存。⑥为提高检验的可靠性，镜检时应有足够的取样，因此本实验要求观察4个重复，最后求取4次观察的平均值，将此值代入公式计算。五、实验作业列出两种测定方法所得的原始数据，计算每克种子上的带菌量，并比较两种检验结果。实验三种传真菌的吸水纸检验法一、目的要求学习利用真菌在自然基物上的自然着生状态鉴定其种类的方法。二、材料、试剂与仪器1．材料小麦、向日葵、玉米、油菜等供检测的各种种子。2．试剂蒸馏水、无菌水、0.1～0.2％2，4－二氯苯氧乙酸钠水溶液、土霉素等。3．仪器显微镜、培养皿、无菌吸水纸、光照培养箱、实体显微镜、冰箱、剪刀、镊子等。四、实验操作常采用以下两种方法：1、常温法①用三层无菌吸水纸铺在消毒培养皿底，注入无菌水，使吸水纸充分吸水达到饱和状态。②将供检验的种子、植物组织，按一定底距离（不要小于1cm），排在吸水纸上，将培养皿置于25℃下培养。培养期间，用12小时近紫外光和12小时黑暗交替处理，无近紫外光管可用黑光灯管或日光灯管代替。一般用2只40w的灯管，培养皿距灯管40cm。培养皿应单放，不能重叠，一般培养3－7d后观察。为了便于检查，可用2，4—二氯苯氧乙酸钠盐，即2，4－D钠盐的0.1～0.2％水溶液代替无菌水，以推迟或阻止种子发芽，但2，4－D的浓度不能超过0.2％，否则有抑菌作用。2、冰冻法在吸水纸上培养过程中，先在10～20℃下培养2～3d，促使萌发，然后放在－20℃冰冻条件过夜，杀死种芽。再移到20℃下培养（亦应作近紫外光和黑暗交替处理，要求同前述），5～7d后镜检。为防治细菌污染，可在水中加入抗生素如土霉素等。3、镜检先在实体显微镜下逐粒种子检查，观察真菌菌落的生长特征，包括菌丝体颜色、疏密度、孢子梗形态、长度及颜色、着生状态、孢子形态、颜色及梗上的着生特点。然后挑取菌落，制片，进行显微镜形态观察。四、实验作业列出供试种子上所带病菌的种类及带菌率。并绘各种病菌自然着生状态简图。实验四细菌的噬菌体检验法一、目的要求掌握细菌的噬菌体检验法。二、基本原理噬菌体是感染细菌的病毒，能在活细胞中寄生繁殖，破坏和裂解寄主细胞，在液体培养时，使混浊的细菌悬浮液变得澄清，在固体平板上培养时，则出现许多边缘整齐，透明光亮的圆形无菌空斑，称为“噬菌斑”，肉眼可分辨。以水稻白叶枯细菌为例，在有水稻白叶枯细菌存在的地方，一般都有相应的噬菌体存在。据测定，噬菌体存在的数量与寄主白叶枯细菌存在的数量有一定的正相关性。因此测定稻种上的白叶枯菌噬菌体存在的数量，可达到检验白叶枯病的目的，测定稻田水中的白叶枯菌噬菌体存在的数量，可作为测报白叶枯病的一种方法。白叶枯病细菌有不同的的菌系，噬菌体也有不同的株系，细菌的不同菌系和噬菌体的不同株系之间的反应是不同的。如果样本中的噬菌体株不能侵染用来测定噬菌体的细菌菌系，在琼脂平板上是不能形成噬菌斑的。因此用白叶枯细菌来测定噬菌体的存在，应选择能被多数噬菌体株系侵染的菌系或用两个菌系混合起来测定，或用从样本来源地分离出来地白叶枯细菌测定噬菌体地存在。噬菌斑的大小和形状，是噬菌体的鉴别性状之一，侵染白叶枯细菌地噬菌体有三种类型，其中一种类型对白叶枯细菌地侵染是专化地，它地噬菌斑直径是3～7mm，另外两种噬菌体是非专化的，它们的噬菌斑直径分别为2～3mm和1～1.2mm。检验稻种上的白叶枯细菌，应以测定专化性噬菌体的存在作为标志。三、材料、试剂与仪器1．材料带菌稻种及病叶，培养3～5天的白叶枯细菌。2．试剂牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉、氯仿、蒸馏水、无菌水。3．仪器灭菌培养皿、量筒（50ml）、烧杯（100ml）、消毒吸管（1mm）、漏斗、研钵、漏斗架、试管架、剪刀、酒精灯、滤纸、火柴、记号笔、药物天平、玻棒、试管、接种环等。四、实验操作制备供检验样品浸提液：取供检稻种10g，脱下谷壳充分打湿，并加搅拌。制备指示菌悬浮液：将培养3天的白叶枯细菌斜面菌种，每管（20×200mm）加灭菌水5ml，用灭菌接种环刮下菌落，搅拌振荡摇，使其成为均匀的细菌悬浮液，其浓度大约为1×108细菌/ml。（注意，指示菌过老，浓度过大或过稀都不宜作测定用。）为了减少杂菌污染，在样品浸提液中加10％的氯仿，猛烈振荡1m后静止15m，氯仿沉入试管下部，上层为清洁的浸提液，供下一步测定用。用吸管向三个培养皿中分别注入0.5ml、1ml、1.5ml的浸提液，然后分别注入指示菌悬浮液1ml混合均匀，静止5分钟后，再加溶化后并保持在45℃的培养基大约10ml，迅速摇匀，放平，待其凝固。待凝固后，在培养皿盖上写上班级、姓名、日期，将培养皿翻过来放在26～27℃的恒温箱中培养。培养12小时后观察统计直径在3mm以上的噬菌斑数目。计算：每克种子所含的噬菌体数＝每毫升浸提液所产生的噬菌斑数×浸提液毫升数÷稻种样品克数。五、实验作业报告个人检查结果，并与所在小组的检验结果和全班的检验结果进行比较，分析成败原因。实验五玉米细菌性枯萎病的接种实验一、目的要求学习检验玉米细菌性枯萎病的接种方法。二、材料、试剂与仪器1．材料培养48小时的玉米细菌性枯萎病病原物、玉米感病品种两叶期幼苗。2．试剂NH4NO3、KNO3、Ca(NO3)2、K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、硼、锰、铜、锌、柠檬酸。3．仪器水培盘、铁丝网、塑料薄膜、光照保湿培养箱、注射器、3号针头等。三、实验操作1、配制育苗培养液：NH4NO31.43g、KNO30.036g、Ca(NO3)20.029g、K2SO40.031g、MgSO4·7H2O0.229g、KH2PO40.192g、硼0.5mg、锰0.25mg、铜0.1mg、锌0.1mg，最后在培养基中加入0.1％浓度柠檬酸。2、育苗：将玉米种子播在水培盘内的铁丝网上，使种子下半部浸入培养液中，盘上覆盖塑料布，置25～30℃下催芽，两天后发芽，移在有光处，维持21～26℃，第五天即有70％的植株可达2叶期。接种：在玉米2叶期，用培养48小时的玉米细菌性枯萎病菌（每毫升含细菌50～500万）以注射器在玉米植株接近叶鞘基部注入菌液0.04ml，接种后置于21～25℃，相对湿度60％以上的光照培养箱内培养，，第5天观察。观察记载：在水培苗上的症状出现早而典型，早期在针眼上下出现点状连片的褪绿小黄斑，不久，在褪绿部位沿叶脉出现水浸状条斑，其上有大量乳白色或淡黄色的菌脓，以后条斑变为褐色，严重时病叶卷曲，新叶被病叶包裹呈畸形。四、实验作业报告接种结果，分析存在问题。实验六植物病毒粒体的电镜观察一、目的要求了解电镜观察植物病毒粒体形态的基本原理；学习常用电镜观察病毒粒体形态观察的制片方法和观察方法。二、基本原理植物病毒粒体非常微小，只能在电镜下观察到。电子显微镜是以电子束为光源的显微镜，分投射和扫描两大类，观察病毒粒体必须采用投射电镜。光学显微镜的标本必须放在载玻片上，但电子束不能穿透玻璃，所以就不能用玻璃作为电镜标本的支架，而是采用极薄的电子透明的薄膜（常用碳膜或聚乙烯缩甲醛膜，Formvar），先制备薄膜附载在金属网（一般为铜网）上，再把标本黏附于这种膜上。在电子光源下，生物样品的反差很小，难以观察清楚，必须用电子染色来加强反差。根据染色效果和成像不同，可分为正染和负染。正染是强化标本的结构，即染色剂与样品结合，增强其散射电子的能力，最终在荧光屏上形成正像。负染是将标本包埋在染色物质里，借助染色剂增强背景对电子散射的作用，而标本在荧光屏上形成暗背景下的亮像。病毒粒体的观察通常采用负染，最常用的染色剂为醋酸铀或磷钨酸，其中所含的重金属离子电子密度较大。三、材料、试剂与仪器1．材料感染TMV的烟草病叶、CMV或TMV的提纯制剂等。2．试剂2％醋酸铀水溶液或3％磷钨酸溶液、灭过菌的蒸馏水。3．仪器投射电子显微镜、铜网（附着有Formvar膜）、昆虫针、凹玻片、手术剪刀、蜡盘、培养皿、圆头玻璃棒、吸水纸、纱布、手术镊子等。四、实验操作（一）样品制备1．浸渍法（1）在凹玻片上滴上两滴2％醋酸铀水溶液（或3％磷钨酸溶液），剪一小块TMV病叶置于染液中，用昆虫针轻刺病叶至液滴呈微绿色，除去病叶。（2）用镊子夹取铜网使有支持膜的表面与样品液表面接触，静置10min取出，用滤纸条吸除多余的液滴，把吸附有样品的铜网置于小培养皿滤条上晾干。2．负染法（1）取CMV或TMV提纯制剂，滴一小滴于蜡盘上。（2）取铜网使有支持膜的表面与样品液表面接触，静置3～5min取出，取出铜网，用滤纸条吸除多余的液滴，稍晾干。（3）取2％醋酸铀水溶液（或3％磷钨酸溶液，注意磷钨酸溶液对CMV有裂解作用），滴一小滴于蜡盘上。吸附有样品的铜网放置于染液表面（样品与溶液接触），静置3～5min。（4）取出铜网，用滤纸条吸除多余的滴液，白炽灯下晾干。（二）电镜观察及照相在专业人员指导下进行。五、实验作业电镜下观察TMV、CMV病毒粒体形态。

取TMV或CMV粒体照片，度量10个粒体形态，根据放大倍数，求算出病毒粒体的大小。实验七植物病毒血清学检测一、目的要求学习利用血清学技术检测植物病毒的方法。二、基本原理抗原与抗体的反应具有高度的特异性。某种病毒只与其自身或抗原性相关的病毒所产生的抗体发生反应，就像钥匙与锁的关系。因此所制备的某种病毒的抗血清（内含相应的抗体）可用于该病毒的检测。在检测中，发生反应的称为血清学阳性，不发生反应的称为血清学阴性。在抗原－抗体相互作用过程中，决定其特异性的部位是抗原决定簇，这是抗原分子表面所具有的某些基团，它既能被动物免疫性淋巴细胞所识别而激发该细胞产生抗体，又能同相应抗体进行特异性结合。抗原决定簇是抗原分子的一小部分，由2～6个氨基酸组成。一般地，植物病毒粒体表面具有多个抗原决定簇，它在与抗体结合中是多价的，而抗体分子是双价的，也就是说，一个病毒粒体可和相应的多个抗体分子相结合，而一个抗体分子可同时结合相应的两个抗原粒体，因此当溶液中存在着适量的抗原和抗体时，抗原粒体借抗体联合逐段发展形成网格结构，最终表现为可见的沉淀，这就是血清学测定中常用的沉淀反应的原理。把抗原、抗体的免疫反应与酶的高效催化反应相结合，产生了一种高效灵敏的血清学检测技术，即酶联免疫吸附测定（Enzyme－LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）。通过化学的方法将酶与抗体结合起来，形成酶标抗体。这些酶标抗体仍能保持其免疫活性，它与相应的抗原起反应，形成酶标记的免疫复合物。而免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，可催化底物发生反应。如果采用无色的底物，而反应产物有色，就能很灵敏地呈现出抗原抗体反应的发生。一般地，是将抗原或抗体包被在固相支持物上（通常采用酶标板），使反应在固体表面进行，以方便操作。三、材料、试剂与仪器1．材料TMV抗血清、正常兔血清、CMV提纯制剂、TMV提纯制剂、CMV病叶、TMV病叶及相应健康寄主叶片等。2．试剂辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔抗体（市售产品）、Na2CO3、NaHCO3、NaN3、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、KCL、牛血清白蛋白、吐温－20、柠檬酸、邻苯二胺、30％H2O2、H2SO4、蒸馏水、精制琼脂粉和生理盐水等。3．仪器40孔或96孔酶标板，酶标仪，台式离心机，冰箱，微量取液器，洗瓶，10ml、200ml量筒，10ml、100ml、500ml烧杯，50ml三角瓶，研钵，记号笔，小塑料袋，小试管，水浴锅，小培养皿，打孔器等。四、实验操作（一）试管沉淀反应（1）将TMV抗血清进行低速离心，用生理盐水稀释20倍，取0.5ml置于小试管底部。（2）将TMV提纯制剂稀释20倍，取0.5ml加入到小试管中，与抗血清混匀。（3）把小试管底部浸入37℃恒温水浴锅中，1h后观察沉淀反应情况。以正常兔血清为对照。（二）双向扩散法（1）取精制琼脂粉1.2g，加生理盐水100ml，加热溶解，倒入小培养皿中，待冷却凝固成厚约2mm凝胶板。（2）将琼脂板放在样品排列图上，用直径7mm左右的打孔器按图形打孔，用解剖针挑出孔中琼脂胶块。样品排列图一般采用梅花形，即中心一孔，围绕其四周分布6个孔，孔距1.5～2.0cm，先在白纸上绘好。（3）加样。中间孔加入TMV抗血清原液，周围各孔分别加入TMV提纯制剂、CMV提纯制剂、TMV病叶抽提液（病叶榨汁加等体积磷酸缓冲液，低速离心去杂质）、CMV病叶抽提液、健叶抽提液、待检病叶抽提液。加样量以加满加样孔但不溢出为宜。以正常兔血清为对照。（4）加样完毕，培养皿放入保湿盘中，37℃反应5～10h，取出培养皿，置黑色背景下观察结果。相应抗原、抗体在最适浓度比例处会形成沉淀线，根据沉淀线的有无判断待检病叶是否含有TMV病原。（三）酶联免疫吸附测定（ELISA）1．缓冲液配制（1）抗原包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液,pH9.6)。Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，NaN30.2g，加蒸馏水至1L。（2）洗涤缓冲液（0.02mol/LPBS-吐温缓冲液PBS-T,pH7.4）。NaCl8.0g，Na2HPO4·12H2O2.93g，KH2PO40.2g，KCl0.2g，NaN30.2g，加蒸馏水至1L，加5ml吐温－20。（3）IgG稀释缓冲液（0.02mol/PBS-T牛血清白蛋白溶液）。取0.1g牛血清白蛋白溶于100ml用灭菌蒸馏水配制的PBS－T缓冲液即可。底物溶液（邻苯二胺溶液，pH5.0）。柠檬酸2.55g，Na2HPO4·12H2O9.2g，加蒸馏水至500ml；称取40mg邻苯二胺，溶于100ml上述缓冲液钟，加30％H2O20.15ml（临用前配制）。（4）终止液（2mol/LH2SO4溶液）。取60ml蒸馏水缓慢加入10ml浓硫酸，混匀后定容至100ml。2．检测（1）制备样品。分别称取病株和健株叶片0.4g于研钵钟充分研磨，用抗原包被缓冲液分别配制1∶10，1∶100，1∶1000样品悬浮液，过滤或3000r/min离心10min，取上清备用。（2）包被抗原。按设计在酶标板相应孔钟加样，每孔200微升，加盖后置4℃冰箱中过夜（或25℃温箱孵育3～5h或37℃孵育2h）。（3）洗板。倒尽酶标板孔中的包被液，用洗涤缓冲液冲洗3次，每次3min（倒除清洗液时可稍用力甩干，使壁底无残留液和气泡）。（4）配制抗血清工作液。根据TMV(或CMV)抗血清效价，用IgG稀释缓冲液配制一定浓度的抗血清工作液（一般可采用500倍，1000倍）。（5）加抗体。按设计向酶标板孔中分别加入抗血清工作液，每孔150微升，37℃温箱孵育1～2h。（6）洗板。洗涤3次（同前）。（7）配制酶标抗体工作液。用IgG稀释缓冲液配制一定浓度的辣根过氧化物酶标羊抗兔抗体工作液（工作浓度按说明书）。（8）加酶标羊抗兔抗体工作液于酶标反应孔中，每孔100微升，37℃温育1h。（9）洗涤3次。同前。（10）加底物溶液，每孔100微升，37℃温育1h。（11）每孔加入一滴终止液终止反应。（12）目测。以颜色深浅记录＋＋＋、＋＋、＋、±、－，或用酶标仪测定波长492nm处的OD值，比阴性对照读数高2倍以上者判断为阳性。必须设置空白对照、健康对照和阳性对照，每个样品应设2～3个重复。反应结束后立即用酶标仪读数。五、所需时间流程琼脂双扩散实验：制备凝胶板、打孔、加样2h温育（37℃）5～10h观察结果。ELISA实验：缓冲液配制1h抗原包被、温育（37℃）2h抗原抗体反应（37℃）2h酶标抗体结合（37℃）1h加入底物__1h_____观察记录30min。六、实验作业完成实验程序，写出实验报告。实验八花生根结线虫病病原鉴定一、目的要求学会掌握鉴定花生根结线虫病的病原方法。二、材料、试剂与仪器1．材料花生根结线虫病病组织。2．试剂与仪器解剖镜、显微镜、拨针（每人2个）、细吸管、凹玻片、小培养皿（￠6cm）、盖玻片、蒸馏水、纱布。三、实验操作组织解剖：将检验的花生根结线虫病材料、根部用水冲洗净（切勿大水冲），而后切取一段组织，放入6cm培养皿中，加少量水，置解剖镜下进行观察。将根部有根瘤（或根结）部分，用拨针，一个固着根，另一个拨针拨开膨大根瘤组织，将可看见乳白色球形、柠檬形的则为根结线虫雌虫。解剖根的同时，可将残余组织中拨开，水中有线形的雄虫。在解剖镜下找根外部即根瘤外部，常附有胶质卵囊，拨开卵囊内有2龄幼虫及卵。需要观察的雌虫、雄虫、二龄幼虫和卵，分别用细吸管将虫吸入滴有蒸馏水的凹玻片内，加盖玻片镜下进行观察其形态。四、实验作业绘出花生根结线虫雌虫、雄虫和二龄幼虫的形态图。附：花生根结线虫病原形态雌虫：梨形、柠檬形或球形，乳白色至淡黄色，体长52～100微米，宽40～60微米。体表薄，有环纹，唇区稍突出，口针长14～16微米，茎部圆球形，有圆而大球，内有瓣膜，排泄管在中食道球前方，背系道腺开口在基部球下方，峡部细短，食道腺覆盖在肠腹面，卵巢1对，卷曲，肛门和阴门位于虫体末端。雄虫：圆筒形，头骨架强壮，半圆形唇区，口针强大，基部球形，1个精等，直伸，尾钝形，无交合散，有交接刺和引带。二龄幼虫：二龄幼虫体长450～490微米，唇区不缢缩，半圆形唇区，口针10微米长，口针基部球圆形，尾圆锥形。实验九植物线虫三个目的区别一、目的要求垫刃目，小杆目和矛线目是常见植物线虫，通过形态观察，掌握区分三个目的方法。二、材料、试剂与仪器1．材料作物根系的土壤（每组100克）。2．试剂与仪器漏斗、漏斗架、纱布、乳胶管、止水夹、￠6cm小培养皿（每2人一套）、拨针（每人2个）、微细吸管、蒸馏水、解剖镜、显微镜、凹玻片、盖玻片、纱布、吸水纸等。三、实验操作1．称取去杂后的土样100克（或干净根系10克）进行贝尔曼（Baermann）漏斗法分离，静置24小时或48小时。2．用手捏紧橡胶管，打开止水夹，将底部约5ml悬浮液放入小培养皿内。3．在解剖镜下用微型吸管将分离线虫吸入微细吸管内，移入凹玻片内，加盖玻片。在解剖镜下观察移入线虫的位置所在。4．制成玻片置于显微镜下寻找线虫的位置，然后观察形态，对三个目区别。四、实验作业绘画出垫刃目、矛线目和小杆目具有典型形态特征的线虫图。附：从口腔与食道类型区分三大目：小杆目（Rhabditida）：是腐生线虫，种群范围广，在土壤，淡水，动物或根围附近生存。形态特征是口腔内无口针，只能吞食。食道特点是食道体部宽，中间有一个不发达的假球（无放射肌肉瓣膜）接着峡部，末端为有瓣膜的后食道球。矛线目（Dorylaimida）：有腐生、自由生活，也有植物寄生。形态特征是口腔有轴针，食道特点是食道体部细长，壁很薄，后端膨大呈长瓶状。食道为矛型。垫刃目（Tylenchida）：是植物线虫，大多数线虫寄生于各种植物，也有一些寄生于昆虫和自由生活，口腔内有口针，口腔后有前食道体，中间有中食道球(有放射状肌肉瓣膜)，接着峡部，后面有一后食道路。实验十棉花黄萎病菌分离培养检验一、目的要求学习掌握棉花黄萎病种子带菌检验方法。二、材料、试剂与仪器1．材料感病品种棉种。2．试剂与仪器显微镜、培养基、Φ9cm培养皿、抽滤瓶、镊子、剪刀、酒精灯、火柴、无菌水、硫酸链霉素等。三、实验操作种子洗涤处理将供试种子用洗衣粉充分搓洗，并以清水漂洗数次，然后置于抽滤瓶中（带有侧孔的三角瓶），用带孔的软塞封口，用自来水从瓶口注入，使流水从侧孔流出，连续冲洗24小时，最后倾处多余的自来水。再用无菌水冲洗一次。将种子置于一个宽培养皿中备用，（无自来水冲洗，可在水中浸泡2－3小时）。种子分离将熔化好的培养基倒入灭过菌的培养皿中，倒皿前每个三角瓶加入50毫升硫酸链霉素。将冲洗过的棉籽放入95％的酒精中浸泡3分钟，作表面消毒，然后用无菌水冲洗二次，再用链霉素灭菌漂洗一次，并用无菌吸水纸将棉籽上的水份取掉。将洗涤过的棉籽，仔细用灭过菌的剪刀剪成四瓣，丢弃种仁，使种皮绒毛面紧贴培养基上，每皿放2－3粒。将上述培养皿移置于23℃恒温箱内培养，3－4天后即可观察菌形态特征，并记录每粒菌落数和种子菌率。观察病原菌形态将培养皿置于低倍显微镜下，观察病原菌形态特征。病原菌属半知菌亚门轮枝属，分生孢子梗，呈轮状分枝，一般由2－4层轮枝及一个顶枝组成，每轮有3－5个分枝。分生孢自轮状分生孢子梗顶端单个地裂出，无色、单孢、椭圆形。在环境潮湿时，分生孢子常由水滴包围，于梗端聚集成团，好似“花朵”。培养10－15天左右，在培养基上能形成由许多厚膜细胞结合成近球形地黑色微菌核。四、实验作业绘制棉花黄萎病病原菌形态图。分别统计本组及全班种子带菌率，写出实验报告，并分析存在问题。实验十一几种检疫性病害病原菌形态观察一、目的要求通过病原菌形态和症状观察，掌握该病害的特点。二、材料、试剂与仪器1．材料栗疫病、玉米干腐病、马铃薯癌肿病、苹果黑星病、马铃薯粉痂病等。2．试剂与仪器显微镜、载玻片、盖玻片、拨针、蒸馏水、刀片、表面皿、通草、纱布、吸水纸、棉兰。三、实验操作1．取玉米干腐病材料，在病果穗或茎杆上拨取散生小黑点，置于滴有蒸馏水的载玻片上，加盖玻片。将制好的载玻片置于显微镜下观察病原菌形态。分生孢子器黑褐色、球形或梨形，孔口突出呈乳头状。器内有两种分生孢子，一种为圆柱形或长椭圆形，直或弯曲，顶端圆形，基部平截，淡褐色，有一个隔膜，少数有2个隔膜或无隔膜；另一种为细长线形，单孢无色。有的器里只有线形孢子，有的则两种孢子都有。该病原菌为玉米色二孢（Diplodiazeae）。此外，引起玉米干腐病菌还有大色二胞（D.mocrospora）和纵裂色二胞（D.frumenti）取栗疫病材料，将腐烂树皮含有棕黄色小点的部分取一小块，夹入通草内做徒手切片，挑入比较好的材料制玻片进行镜检观察。无性时期的分生孢子器着生在圆锥形子座中，分生孢子器多室，形状不规则，分生孢子单孢。无色，圆筒形或椭圆形，有性时期子囊壳也产生在座中，子囊壳黑色，长颈瓶状，子囊无色，棍棒状，内含8个子囊孢子，子囊孢子双胞，无色，椭圆形。3．取苹果黑星病叶，用三角针刮取叶背面上的黑褐色霉层，置于滴有蒸馏水的载玻片上，加盖玻片后放入载台上进行镜检。无性阶段为半知菌亚门，丝孢目，暗色科黑星霉属，分生孢子梗丛生，短而直立，基部膨大，不分枝，有分隔，层膝状或结节状，暗褐色，有明显环痕；分生孢子单生，长椭圆形或梨形，基部平截，顶部钝圆或略尖，初无色，后渐变淡褐色，一般单胞，少数为双胞。有性时期子囊壳埋生于落地病叶上，子囊壳黑褐色，球形、有孔口，其内产生50个以上子囊。子囊无色，圆筒状，有短柄，子囊内有8个子囊孢子，淡褐色，卵圆形，双胞，上部尖，下端圆。4．取马铃薯癌肿病材料，用刀片切割表面粗糙具花椰菜花球状的肿瘤块，作徒手切片，挑取好的材料制成玻片进行镜检。该病菌为鞭毛菌亚门壶菌目集壶菌科集壶菌属（Synchytriium）。（1）观察肿大的马铃薯细胞，被侵染的细胞肿大呈莲花座状。（2）组织细胞中有球形或近球形，黄褐色，壁厚，壁上有褶状的突起，则为休眠孢子囊。（3）组织细胞中有卵形或近球形，壁薄，无色或淡色的膨大物，为孢子囊，孢子囊聚生成孢子囊堆，无菌丝体。5．取马铃薯粉痂材料，根部受害最重，块茎次之。在根渐的一侧有单生或群生的肿癌，块茎上出现敺垧琛啊１渖逅酰筛２〈泻稚勰┪菝哝咦佣眩拾肭蛐巍Ｋ怯尚矶嗲蛐味嗫椎暮Ｃ嘧葱菝哝咦幽易槌伞Ｐ菝哝咦幽遥衷残位蚨嘟切危踔粱坡躺交诒＜闹飨赴杏薪洗螅还嬖蛐位蚨嘟切危湫纬孀矗嗪耍释牛纬梢桓龌蚨喔鲂菝哝咦幽叶选４送猓部捎盟逑纯榫ィ导煜吹右褐杏行菝哝咦幽摇８貌『Ρ廾敲鸥拙伲拙品垧杈簦?I>SpongospraSubterrnea）。四、实验作业1．简述上述各植物检疫病害的症状特点、病害部位、病原菌分类地位和病原菌主要形成特征。2．绘出苹果黑星病、玉米干腐病、马铃薯癌肿或马铃薯粉痂病的病原菌图。实验十二同翅目检疫害虫的识别一、试验目的观察几种重要的同翅目检疫害虫的形态特征，掌握与其它同翅目害虫的区别方法。二、材料和用具试验材料葡萄根瘤蚜Viteusvitifolli(Fitch)、苹果绵蚜Eriosomalanigerum(Hau.)，两种蚜虫的成若虫浸泡标本，寄主受害状。试验用具镊子、拨针、实体解剖镜、载玻片。三、观察内容l．葡萄根瘤蚜无翅孤雌蚜根瘤型体长1.15～1.50mm，宽0.75～0.90mm，卵圆形，鲜黄至污黄色，触角和足黑褐色，复眼红色。体背有黑色瘤状突起，头部4个，胸部每节6个，腹部每节4个，瘤上有刚毛l～2根。触角3节，第1、2节等长，第3节远长于前两节，末端有一个圆形感觉圈及3根刺毛。喙7节，端部达后足基节间。气门6对，大，圆形。跗节2节，第2节端部有冠状毛2根，爪l对。腹部无腹管。无翅孤雌蚜叶瘿型长约1.0mm，宽约0.75mm，近圆形，背面无瘤而有细微凹凸皱纹，体背较拱凸。触角第3节末端有刺毛5根，其它与根瘤型相似。有翅孤雌蚜长约0.9mm，宽约0.45mm。长椭圆形，黄至橙黄色，中后胸深红褐色。喙7节，触角3节，各有数根长刚毛；第3节最长，有感觉圈2个，基部的近圆形，端部的卵形。复眼红色，单眼3个。翅上有不明显的半圆形小点，前翅前缘有长形翅痔，径脉不分叉，无Rl，以Rs形成翅痣的内缘，还有3根斜脉，即M、Cul和Cu2。后翅仅有R5，静止时翅平叠于体背。性蚜性母蚜产下的大卵孵出的为雌蚜，产出的小卵孵出的为雄蚜。性蚜无若虫阶段，无翅，无喙，不为害，交配后产越冬卵。雌蚜体长0.38～0.50mm，宽约0.16mm，腹末钝圆。雄蚜体长0.31mm左右，宽约0.13mm，腹末逐渐尖削。末端外生殖器乳突状。黄至黄褐色，眼大深红色，触角灰黑色，触角有1个感觉圈和5根刺毛，体背有不明显的灰黑色瘤状小突起。足灰黑色，跗节1节，腹末无长毛。若蚜共4龄，各部分形态与成虫相似。1龄时体椭圆形，头胸部大，而腹部小，2龄变卵圆，根瘤型和有翅型出现黑色背瘤，性母蚜体变狭长而色深，3龄时性母蚜出现黑色翅芽，4龄除体小外，各形态近似成蚜。2．苹果绵蚜（见图l2-1）苹果绵蚜按发育阶段分成虫、卵和若虫三个阶段。成虫还有无翅胎生雌蚜，有翅胎生雌蚜和性蚜，若虫分不同龄期。现分述如下。无翅胎生雌蚜体长1.8～2.2mm，椭圆形，肥胖，赤褐色，体侧具瘤状突起。头宽与前胸等宽，无额瘤，复眼红黑色。触角6节，为体长的1／4，与体同色，第4、5节末端及第6节为黑色，后两节各1个感觉圈。体背蜡腺发达，呈花瓣形，由5～15个蜡孔组成蜡片，头部6～l0片，胸、腹部各节有中蜡片及缘蜡片各l对，第8腹节无中蜡片。腹部膨大，常被白色腊质绵状物。腹管退化仅留痕迹，呈稍隆起的半圆形裂口，位于第5与第6腹节泌腊孔中间。有翅胎生雌蚜体长l.7～2.0mm，翅展5.5mm左右，暗褐色，头、胸黑色，口器伸不到中足基节。白色绵状物较少。复眼红黑色，3个单眼颜色深，触角6节，第3节最长，上有6～20个环形感觉圈，第4节有3～4个，第5节有l～4个，第6节有2个环状感觉圈。前翅中脉有1个分枝。腹管退化为黑色环状小孔，尾片有毛2根。性蚜雌虫体长l.0mm，宽约0.40mm左右，淡黄褐色，头部、触角及足为淡黄绿色，腹部赤褐色，稍被绵状物。触角5节，口器退化。雄蚜体长0.70mm，黄绿色至黑褐或暗绿色，触角5节，末端半透明，无口器，腹部各节中央隆起，有明显沟痕。若虫共4龄。1龄体长0.65mm，略呈圆筒形扁平，黄褐色至赤褐色，触角5节，喙细长，向后伸至尾端以外，体上绵状物较少。2龄体长约0.8mm，略呈楔形，喙长度达腹末的3/4～4/5。3龄体长约1.0mm，圆锥形，赤褐色。4龄体长约1.45mm，体型与成蚜相似，有翅型具两个黑色翅痣，触角5节。四、作业分述两种蚜虫的主要识别特征。附表世界葡萄蚜虫种类检索表（无翅孤雌蚜）1．触角3节……………葡萄根瘤蚜Viteusvitifoliae(Fitch)触角5节或6节…………………22．触角末节短于基部（在根部）…………………3触角末节鞭部长于基部（在地上部）…………43．体呈纺锤形；具分散的短毛，体淡色，体表覆盖白色蜡粉。发生在葡萄根部，易与葡萄根瘤蚜混淆；在草根也会发生。分布南欧、乌克兰的克里来亚、中东和南非……AploneuraampelinusMokrzeckv体圆形、有许多长毛，包括在腹节上特别长的侧毛1--2根。体淡黄或黄褐色，中等大小、近球形、体表覆盖有光泽的白色蜡粉，主要发生在禾本科植物的根部、在中亚也曾在葡萄的根部发现。分布南斯拉夫、中亚、中东、毛里求斯、印度、巴基斯坦、斯里兰卡、中国（台湾）、日本、爪哇、新几内亚、菲律宾、所罗门群岛、澳大利亚、新西兰、阿根廷和巴西………蔗根蚜Geoicalucifuga(Zehntner)4．尾片比腹管色淡。世界广泛分布………………棉蚜AphisgossypiiGlover尾片深色…………55．后足胫节全部黑色。体小、深红褐色至几乎黑色，略有光泽，有稍长并岔开的腹管。有时大量发生在葡萄的嫩枝和叶片上，后期发生在果穗上。夏季在葡萄上生活，秋季迁飞到樱叶荚迷上产卵越冬。在野生葡萄和白藤属植物上也有记录。分布美国的东部和中部、中美洲、以及南美洲由北往南至乌拉圭…………………北美荚迷蚜AphisillinoisensisShimer后足胫节大部分淡色，仅端部黑色。体黑色无光泽、有些无翅成蚜体上有白色蜡斑。寄主植物种类很多，直接危害的重要作物有蚕豆、还能传播30多种植物病毒。广泛分布与北半球温带地区(中国尚未报道)、以及南美洲和非洲较温暖的地区……蚕豆蚜AphisfabaeScopoli实验十三鳞翅目检疫害虫识别一、试验目的观察几种重要的鳞翅目检疫害虫的形态特征，掌握与其它鳞翅目害虫的区别方法。二、材料和用具材料美国白蛾Hyphantriacunea(Drury)、苹果蠹蛾Cydiapomonella(L.)，两种害虫的挂图、生活史标本、幼虫、蛹浸渍标本、成虫针插标本。用具双筒实体解剖镜、载玻片、镊子。三、观察内容1．美国白蛾成虫全体白色、复眼黑褐色、喙短小。前足基节、腿节桔黄色，胫节、跗节内侧白色，外侧大部黑色，胫节近端部有1对一长一短的前胫突，中、后足腿节白色或黄色。胫节、跗节上常有黑斑，后足胫节有l对端距。前翅R1出自中室前外角，R4、R5共柄。后翅R2与M1共柄，前后翅M2与M3均共柄，并从中室后角出。♂体长1215mm，翅展多为40mm左右，触角短栉齿状。褐色，前、后翅多数为纯白色，少数越冬代个体有少数斑点。♀体长9～12mm，翅展多数为30mm左右，触角黑色双栉齿状，内侧齿长约为外侧齿的2/3，多数个体前翅有黑褐色斑，越冬代斑常很多，不同个体斑变化很大，有七列、五列、四列及少斑型。外生殖器的爪形突尖锐，向下弯成钩状，抱握器两瓣对称，内侧中部各1大齿形突，阳茎长过抱器，端部较粗有1簇小刺。幼虫有红头型和黑头型两种，红头型仅分布于美国南部，其余国家和地区均为黑头型。黑头型老熟幼虫体长28～35mm，头部黑色有光泽，头冠、额色淡而明显，胸腹部黄绿色至灰褐色，变化很大，前胸盾、胸足和肛上板黑色。体背有一条深色宽纵带，其上是两列大型黑色毛瘤，侧面着生毛瘤多为桔黄色，毛瘤上着生白色长毛丛，混杂有少量黑毛，气门周围散布浅灰色不规则小班，气门上、下线黄色，体侧和腹面灰黄色，腹足趾钩9～14个，单序异形中列式。我国分布的黑头型幼虫有3种体色变异类型，即普通型（体背一条明显黑色宽纵带），黄色型（体背无黑色宽纵带，整个虫体黄褐色），黑色型（整个虫体黑褐色），普通型数量最多。蛹体长8～15mm，初期淡黄色，有光泽，后变黄色、橙色、最后褐色至暗褐色；头、前胸、中胸及腹背有密而浅的点刻。臀棘8～15个，末端呈瓶状。2．苹果蠹蛾(见图13-1)成虫体长8.0mm，全体灰褐色而带紫色光泽，触角线状；前翅翅面颜色可明显分三区：臀角有一椭圆形深褐色大斑，颜色最深，其有上有3条青铜色条纹，为主要识别特征，翅基褐色，外缘突出略成三角形，杂有较深的斜行波状纹，翅中部色最浅，为淡褐色，也有杂有褐色斜纹。雄蛾前翅反面沿中室的后缘有l条黑色鳞片。雌虫翅缰4根，雄虫仅1根。前翅R4十5和M3的基部通过中室，Cu2不发达，仅留末端一小段，臀脉l根，基部分叉很长。后翅前缘呈弧形拱起，Cu2亦不发达，臀脉2根，第1根基部有短分叉。幼虫老熟幼虫体长l4～20mm。初龄幼虫淡白色，稍大变淡红色，老熟时呈红色。头部黄褐色，前胸盾淡黄色，有规则的褐色斑点，臀板颜色较浅于前胸盾，其上有小的淡褐色斑点。无臀栉，腹足趾钩单序外缺环，趾钩14～30个，多数为19～23个，臀足趾钩单序环形。大龄雄幼虫第5腹节背面近中央可透见1对紫红色睾丸。蛹蛹长7～10mm，全体黄褐色，雌蛹触角不达中足末端，雄蛹触角接近中足末端，第2至第7节各节背面前后均有l排整齐的刺，前排粗大，后排细小，第8至第10腹节的背面仅各有1排，肛门两侧各有2根钩状刺，末端还有6根，共10根。四、作业1．简述美国白蛾主要识别特征。2．比较苹果蠹蛾与其它几种食心虫的主要区别特征。附表苹果蠹蛾及其近似种幼虫检索表幼虫肛门处有臀栉………………2幼虫肛门处无臀栉………………5腹足趾钩为单序环状……………3腹足趾钩为双序环状……………4老熟幼虫体长7-9mm，粉红色，臀栉4-6刺；一般不蛀入果心，常在过皮下浅处取食；被害果蛀孔处形成褐色的“干疤”，疤上常有数个小孔和少许虫粪；幼虫不蛀食桃梢，只为害果实……………苹小食心虫Grapholithainopinata老熟幼虫体长10-13mm，淡红色或淡黄色，臀栉4-7刺；蛀入果心，取食果肉和种子；蛀孔处形成“黑疤”，疤上仅一孔，绝无虫粪，果内可见大量虫粪；还可蛀食桃、李等新梢…………………梨小食心虫G.molest老熟幼虫体长10-12mm，暗红色，臀栉6-7刺；不蛀入果心，只在果皮下局部取食；被害果萼洼处虫粪成堆，粪中可见蛹壳…………………桃白小食心虫Spilonotaalbicana老熟幼虫体长约12mm，桃红色，臀栉4-7刺；幼虫蛀入果核附近，取食近核处叶肉；被害果内可见大量虫粪，但粪中绝无蛹壳………………………李小食心虫G.funebrana5.幼虫前胸侧毛组有3根刚毛，体长14-18mm，浅红或黄绿………………苹果蠹蛾Cydiapomonella幼虫前胸侧毛组有2根刚毛……………………6腹足趾钩为单序环状，体长13-16mm，桃红色……………………桃小食心虫Carposinasasakii腹足趾钩为双序环状或缺环状…………………7老熟幼虫体长18-25mm，暗红色或灰褐色；中、后胸及第1-8腹节各有明显的褐色的大小毛片8个，前排6个，后排2个………………………桃蛀螟Dichocrocispunctiferalis老熟幼虫体长18-22mm，紫红色或灰绿色；中、后胸及第1-8腹节无上述明显的褐色毛片………………梨大食心虫Nephopteryxpirivorella实验十四双翅目检疫害虫识别一、试验目的认识几种重要的双翅目检疫害虫的形态特征，掌握与其它双翅目害虫区别的方法。二、材料和用具１．试验材料黑森瘿蚊Mayetioladestructor(Say)成虫玻片标本、雄性外生殖器玻片标本，幼虫、蛹的浸渍标本。高粱瘿蚊Contariniasorghicola(Coquillet)挂图。柑橘大实蝇Bactroera(Tetradacus)minax(Enderlsin)、蜜柑大实蝇Tetradacustsuneonis(Miyake)、橘小实蝇Dacus(Bactroera)dorsatis(Hendel)、地中海实蝇Ceratitiscapitata(Wiedemana)等四种实蝇的成虫针插标本、幼虫及蛹的浸渍标本。２．实验用具双筒实体解剖镜、载玻片、镊子、解剖针。三、观察内容1．黑森瘿蚊（图14-1）成虫雌虫体长2.5～4mm，初羽化时全体黄褐色或红褐色，后各部分色变暗。头、胸部黑色，触角、足及翅褐色，平衡棒桔红色，额面有一丛黑毛，触角在额的中间基部相连，多数17节，约为体长的l/3，第1节短粗盘状，第2节球状，以后各节为由短颈相连的瓶状，每节长为宽的2倍，末节椭圆形，为前一节长的1/2，各节生有坛形的感觉器，基部环生一周长毛和丝状网。复眼很大且在头顶相接。胸背中区有2条由稀疏白毛组成的纵纹。足细长披黑色鳞毛。跗节5节，第2节长为后3节之和。翅长卵形，翅面生黑短毛，R1仅达前缘中部，Rs纵贯全翅，Cu在中部两支，Cu2与后缘相交处与R1与前缘相交处相对。腹部可见8节，两侧具灰黑色斑条，末端3节为锥形产卵管。雄虫体长2～3mm，初羽化粉红色，后变暗，与雌虫的明显区别是：腹末具向上弯曲而发达的外生殖器，外生殖器由一对大型钳状、2节组成的抱握器以及呈V型的上生殖板(较短)、呈U形的下殖板(较长)和长在中间的阳具组成。卵长0.4～0.5mm，宽0.07～0.085mm，长圆柱形，常2～5粒首尾相接地产生小麦叶片正面叶脉脉沟里，初产淡红黄色，后渐变红褐色有光泽。幼虫老熟幼虫3.5～5mm，呈不对称的纺锤形，前端钝圆后端尖细，共13节，第一节为头部，第2--4节为胸部，其后9节为腹部，头腹面有一深色圆锥体，其上有小突起，体末有2小突，腹面中央有一个棱形纵凹，前胸腹面后缘有一个胸叉（剑骨片）。蛹裸蛹，乳白色至褐色，头顶有1对刚毛，胸背有1对长毛状呼吸管。围蛹壳纺锤形，前端小而圆钝，后端大而具凹缘，栗褐色。形状大小和颜色像亚麻籽。2．高粱瘿蚊成虫♂触角与体等长，♀的仅为体长之半，均为14节；雌虫3--14节的每节中间略收缩，除末节外，每节散布不成轮的毛；雄虫3--14节的每节中间之间非常收缩，除末节外，收缩部分的端部长度等于基部之长度，而每节的加粗部分有一轮毛。头黄色，触角和足褐色，胸部桔红色。雄虫外生殖器的背片和腹片皆作深裂2叶，背片短宽，凹缘宽而呈三角形。产卵器细长，针形，长于虫体，端部具有一对细长瓣状物，瓣长为宽的约5倍。3.柑橘大实蝇成虫体长10--13mm（不包括产卵管），翅展20--40mm，黄褐色，中颜板具1对黑色椭圆形的颜斑；触角芒基部黄色，端部黑色。中胸背板黄褐色，中央一条赤褐色至黑色“人”形斑纹，在此纹两侧各有一条灰黄色粉被条；胸部鬃6对，均黑色。翅透明，前缘带淡棕黄色，其宽度自前缘脉至R2+3脉，翅痣和翅端斑点呈棕色；肘室区棕黄色。足黄色，腿节末端以后色较深。腹部黄色至黄褐色第一节背板扁方形，宽略过于长；第三节背板基部有一黑色横带，与腹背中央从基部伸达腹端的深色纵纹相交成“十”字形；第四背板基部也有黑横带，色较浅，中部间断；第二至四背板侧缘色也较深。幼虫老熟幼虫乳白色，体长14?6mm，胴部11节，前气门扇形，指状突30多个。第2至3节前端和肛门周围各有一列小刺带。第四至十一节腹面前端各有一个梭形区。后其门内侧中间各有1个盘状体。4.蜜柑大实蝇与柑桔大实蝇各虫态形态均很相似，成虫、幼虫的主要区别见下表。虫态蜜柑大实蝇柑橘大实蝇成虫1.颜斑长椭圆形，未充满触角沟端部内侧2.肩板鬃2对(中间的1对较小)，前翅上鬃1对，胸鬃共8对3.产卵管基节长度为腹部长的1/24.雄虫腹节3两侧有栉毛7～8根1.颜斑近圆形，充满触角沟端部内侧2.肩板鬃1对，无前翅上鬃，胸鬃共6对3.产卵管基节长度等于腹部长度4.雄虫腹节3两侧有栉毛8～10根幼虫1.背面第2～4节前端有小刺带2.腹面2～3节有小刺带1.背面仅2～3节有小刺带2.腹面仅第2节有小刺带5．橘小实蝇(图14-4，5)成虫体长6.5～7.5mm（不包括产卵器），翅展12～14mm。头、胸黑色，额上有3对褐色侧纹和1个中央圆斑，胸部两侧有鲜明柠檬黄色纵条斑（死虫为暗黑色），肩胛、背侧片及小盾片均黄色。前翅透明，翅脉黄色，翅面有褐色带纹，前缘带约达第一端室外角。腹部黄褐色，第1节黑褐色，第2节前半部有黑色横纹，第3节的前部和两侧及第4节两侧为黑褐色，第3节至第5节中央有黑色纵条纹，胸鬃分别为：肩板鬃2对，背侧鬃2对，前翅上鬃1对，后翅上鬃2对，小盾前鬃l对，小盾鬃1对，中侧鬃1对。雌虫产卵器较短小，长度不超过第5腹节，基部不膨大。幼虫老熟幼虫体长约10mm，黄白色。前气门粗短而小，呈杯状，前缘具指突10～13个，后气门新月形，有3个长椭圆形裂口，外侧4丛细毛群，内侧扣状突大而明显。6．地中海实蝇成虫体长4～5mm，翅长4.5mm。头部黄色，略有光泽，复眼紫红色，具绿色光泽(死虫无)。主要特征：中胸盾片具黑色大斑，与淡色区域彼此镶嵌而构成复杂的花斑；肩胛具一黑斑；小盾片端部3黑斑联合成一大斑，约占小盾片端部的1/2～2/3。翅透明，有黄色、褐色及黑色的斑点，并有断续的带纹。前缘带沿翅前缘可达R4+5脉；沿m-m横脉有红黄色的端前横带几乎与前缘垂直；沿中脉横脉(m-cu)有呈褐色的中横带，达翅的后缘。无后端横带。雄虫头部前对上侧额鬃特化成的匙形额附器黑色，表面常覆银灰色粉被，末端尖锐。腹部心形，浅黄色；密被黑色刚毛，第2、4节背板后缘各有一银灰色横带。其它特征：胸部背面有光泽，胸鬃粗而长，黑色；足浅黄色；后足胫节有一排较长的黄毛；前腿节上侧毛为黑色（♂）或黄色（♀）。幼虫老熟幼虫体长7～10mm，宽1.5～2mm。头梯形，老熟时常弯曲呈钩状。触角2节，基节短粗，端节细长，幼虫胴部11节，前气门扇状，指突7～12个，典型的9～10个，后气门亦有3对裂口。腹部l、2节间，3、4节间和肛门周围的小刺呈环带。蛹长4～4.3mm，宽2.1～2.4mm，长椭圆形，黄褐色至黑褐色。两前气门间突起，两后气门间亦突起，并有一条黄色带。四、作业1．绘出黑森瘿蚊脉相图。2．绘出柑桔大实蝇成虫胸鬃和腹部形态特征图3．绘出柑桔大实蝇幼虫前、后气门特征图。4．简述地中海实蝇主要识别特征。附实蝇科常用鉴定特征成虫常用特征成虫常用特征为头部和胸部的鬃（bristle），腹部背板的斑纹，翅的斑纹以及足上的一些特征。头部顶鬃（verticalbristles）位于复眼的上内角；又分为内顶鬃和外顶鬃。后头顶鬃（postverticalbristles）位于单眼三角区后，通常1对，也有2对的；又称为后顶鬃。单眼鬃（ocellarbristles）位于单眼三角区内；常1对，又称为眼鬃。额鬃（frontalbristles）位于单眼三角区前，分为两排，又分上侧额鬃和下侧额鬃。后头鬃（post-orbitalbristles）位于复眼后缘，并与后缘平行的一列鬃，又称为眶鬃或眼后鬃。胸部胸鬃肩鬃（humeralbristles）位于肩胛上，又称肩板鬃。沟前鬃（presuturalbristles）位于中胸缝（又称横沟或盾前沟）前。背侧鬃（notopleuralbristles）位于背侧板胛（又称背侧片）上；又分为前背侧鬃和后背侧额鬃；也称背侧片鬃。背中鬃（dorsocentralbristles）位于中胸背板中央，在侧后缝色条与中后缝侧条之间。本科仅为后背中鬃(posteriord．b．)。前翅上鬃(supraalarbristles)位于前翅基部的上方，在背侧鬃与后翅上鬃之间，又称翅上鬃。后翅上鬃(postalarbristles)位于平衡棒基部的上方，在前翅上鬃之后，又称翅后鬃或翅内鬃。小盾前鬃(antteriorscutellarbristles)位于小盾沟前。小盾鬃(scutellarbristles)位于小盾片的边缘。又称小盾缘鬃(marginals.b.)。本书采用以ComstocketNeedham(康一尼)系统为基础的经陆近仁教授修改的系统。其中M3+4在有的系统中又命名为cu脉，Cu1十1A又命名为A脉；臀室(A)又命名为基肘室。本科特征是有基中室及臀空，且臀空末端伸出成锐角。二、幼虫常用特征实蝇科幼虫属无足型中的无头型(即蛆型)幼虫。其气门类型属两端气门式，前气门位于前胸左右侧，前气门端部有指状突(digit)，蝇类的腹部末端(即第8腹节)后方平坦，为后气门板，一对后气门即位于其上，后气门常各有三个气门裂口。常用鉴定特征有头咽骨(cephalopharyngealskeleton)(包括口钩、口后片和咽骨片等)，前(胸)气门，后气门(片)与后气门裂(posteriorspiracleslit)，腹部末端的小乳头状突起和瘤，以及局部的臀叶等。这些特征(见图17—4)，可用来鉴定亚科、属和种，有的还可鉴定龄期。如：一龄幼虫一般无前气门；后气门仅有2个后气门裂；口钩无横脊，且极小(但色较深，呈褐色，与其它部分相比，明显可见)。二龄幼虫具前气门，其前缘中间深陷将其分成两片，每片顶端具一些小的指状突起，突起数目与三龄的相同；后气门有3个后气门裂；头咽骨进一步骨化，黑褐色至黑色，各部发达、明显。三龄幼虫具前气门，但其前缘平直，不分成两片；后气门也有3个后气门裂，但裂口细长，头咽骨的口钩无齿片(端前片)，咽骨片前面部分短。实验十五鞘翅目检疫害虫识别（一）一、试验目的认识几种重要的鞘翅目检疫害虫的形态特征，掌握与其它鞘翅目害虫区别的方法。二、材料和用具1．试验材料谷斑皮蠹Trogodermagranarium(F.)、稻水象甲Lissorhoptrusoryzopilus(K.)、墨西哥棉铃象AnthonomusgrandisBohenman、马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata(Say)等四种害虫挂图，2．生活史标3．本、成虫针插标4．本、幼虫和蛹的浸渍5．标6．本。7．试验用具双筒实体解剖镜、载玻片、镊子、解剖针。三、观察内容1．谷斑皮蠹成虫♀体长平均2.8lmm，♂平均1.99mm，体宽平均1.64mm。长椭圆形，两侧近平行，淡红褐色，深褐色或黑色，有光泽。头部颏的前缘中央具深凹，两侧钝圆。触角11节。♀触角棒一般4节，有时3节，末端圆锥形，长略大于宽；♂触角棒5节，末节长圆锥形，长约等于第9、10节之和。触角窝后缘隆线特别退化，♂约消失全长的1／3，而♀消失2/3。前胸背板基部的中央和两侧有不明显的黄色和白色毛斑。鞘翅略宽于前胸，有模糊的红褐色花毛斑，毛斑由基部的环状带、近中部的亚中带和端部的亚端带组成。雄虫外生殖器的阳茎背片骨化均匀，第9腹节的“桥”下端呈弧形，雌虫交配囊内成对骨片细小，有少量齿。幼虫老熟时体长约5.3mm，宽约1.5mm，纺锤形，乳白至黄褐色，触角3节，第1节周缘3／4生刚毛，第2节只1根，第3节无刚毛。上内唇（epipharynx）前缘4根中刚毛两侧的2根刚毛较细，其前端感觉环上有乳突（papillae）4个。这是此虫截然区别于黑斑皮蠹以外的所有其他已知斑皮蠹幼虫的特征。头、胸、腹背面均覆细长的芒刚毛。腹部9节。各腹节背板后侧区生有箭刚毛并形成毛簇，极少生在背中线附近，腹末有2簇长的芒刚毛。谷斑皮蠹与黑斑皮蠹T.glabrusHerbst近似。二者的区别见下表：黑斑皮蠹谷斑皮蠹成虫1．♂触角棒6-7节2．前胸腹板有一低而宽的明显中纵隆线3．后胸腹板基部1/3有明显的侧中陷线1．♂触角棒5节2．前述隆线不明显3．后胸腹板的侧中陷线极短或缺幼虫腹部第8背板有前脊沟腹部第8背板无前脊沟2．马铃薯甲虫成虫体长9～11.5mm，宽6.1～7.6mm，椭圆形，头、胸部及鞘翅淡黄色至红褐色，头、胸部具黑色斑纹；前胸缘近黄色；每鞘翅上有5条黑色条纹，鞘翅刻点粗大，排成不规则的刻点行，腹面淡黄至黄色，具黑色斑纹；足淡黄至黄色，关节区域和跗节暗色至黑色。以此可与北美其它种区别。头顶上斑通常三角形，称头盖前侧斑，复眼后各有一黑斑，称头盖后侧斑。下颚须末节端部截形，短于其前1节。触角11节，鞭状，1--6节褐色有光泽，7--11节黑色。前胸背板有10余个黑斑，中间每个较大略作V形。鞘翅条纹全部由翅基部延伸至翅端；缝合缘黑色。条纹l与之在翅端几乎相接，条纹2、3在翅端连接。腹部淡黄至黄色，腹板1～5节侧缘具黑斑，1--4节在腹部中央两侧有长椭圆形黑斑。马铃薯甲虫与伪马铃薯甲虫L.juncta(Germar)的主要区别马铃薯甲虫伪马铃薯甲虫鞘翅刻点排列很不规则排列规则成行腿节外缘无黑斑有黑斑3．稻水象甲(见图15-3)成虫体长2.6～3.8mm，宽l.l5～1.75mm。体表密被相互连接的鳞片。前胸背板中区前缘至后缘及两鞘翅合缝处侧区自基部至端部1／3处的鳞片是黑色，分别组成明显的广口瓶状和椭圆形的黑色大斑。头及前胸背板两侧基部，复眼四周、3对足基节基部、第3、4腹板以及第5节末端鳞片黄色，其余各部鳞片均灰色。喙与前胸背板等长，触角红褐色，10节，柄节棒状，索节l膨大呈球状，索节2长大于宽，索节3～6宽大于长，棒节1光滑无色，长为棒节2与3之和，棒节2和3密被细毛。前胸背板两侧缘中间略凸，小盾片不明显，鞘翅两侧近平行，长为宽的1.5倍，末端较半截，肩明显斜形。腿节棒状无齿，胫节细长弯曲，中足胫节两侧多具一列长毛（游泳毛）。跗节第3节不呈两叶状。幼虫老熟幼虫体长约8mm，白色，无足，头部褐色。体细长，略向腹面弯曲，活虫体可透见体内气管系统。第2～7腹节背面各有1对略向前弯曲的钩状突起，气门位于管中，借以获得空气。蛹白色，复眼红褐色，大小及形态近似成虫。蛹在土茧中化成。土茧直径5mm，不正球形，粘附于根上。4．墨西哥棉铃象成虫体长3～4mm，宽1～3mm，长椭圆形，红褐至红黑色，被覆灰至褐色茸毛。触角细长，鞭节7节，头圆锥形，被覆茸毛和大而稀的刻点。额有小窝，前胸背板宽约为长的1.5倍，基部左右各有浅凹1个，后角直角形，前端圆形。前缘之后缩成浅槽。沿中线密布茸毛。鞘翅长椭圆形，行纹的刻点深而互相接近，行间凸，有皱纹。足相当粗，腿节棍棒形。前足腿节有2个粗大的刺，内侧的齿长而壮，外侧的尖三角形，二者在基部相互连接，中足和后足腿节只有1个齿。在美国和墨西哥，与墨西哥棉铃象近缘的有野棉铃象A．grandisthurberiae