第15讲组织工程课件

第15讲组织工程第15讲组织工程1再生凤凰(Chinesephoenix/phoenix)：雄的叫凤，雌的则叫凰。象征祥瑞。神话中说，凤凰每次死后，会周身燃起大火，然后其在烈火中获得重生，并获得较之以前更强大的生命力，称之为“凤凰涅磐”。再生凤凰(Chinesephoenix/phoenix)2蚯蚓被截为两截以后，断面上肌肉组织快速溶解，然后形成新的细胞团。这时，血液中所含的白细胞也会同时集中在切面上，形成特殊的栓塞，从而使伤口快速闭合。中胚层细胞还具有十分强的分化能力，快速移动至伤口切面上来，在切面上形成一个个结节状的凸起，就被称为再生芽。同时，蚯蚓体内的消化道、血管，以及神经系统等组织的细胞，经过许多分裂，快速地向再生芽里不断生长，切面上就会快速地再生出另外一个头来，并且另一端也会自然生出一条尾巴来。蚯蚓被截为两截以后，断面上肌肉组织快速溶解，然后形成新的细胞3器官移植《圣经》中，上帝始造天地耗时七日，在第六日里用泥土按自己的形状捏成个泥人，然后吹了一口仙气于其中，亚当便有了生命。上帝造了亚当之后，让他当世间万物的主宰，还给他建了个园子，取名为伊甸园（Eden），其意为“乐事，愉快”。取其第七肋骨塑成女状，再吹之以仙气，遂成夏娃（意即“赋予生命”）。器官移植《圣经》中，上帝始造天地耗时七日，在第六日里用泥土按4荷马《伊利亚特》中，描绘了一个叫做凯米拉（Chimera）的怪兽：狮头、羊身、蛇尾，并且背部及尾部又分别伸出一羊头和蛇头。在现代移植学中，凯米拉一词译为嵌合体。丹麦童话美人鱼美人鱼（安徒生）荷马《伊利亚特》中，描绘了一个叫做凯米拉（Chimera）的5龙龙是中国的象征、中华民族的象征、中国文化的象征。龙是中国古人对鱼、鳄、蛇、猪、马、牛等动物，和云、雷电、虹霓等自然天象模糊集合而产生的一种神物：马头（驼、牛、扬子鳄头），象鼻，鲤鱼须，蛇身，鹿角，龟眼（兔、虎），鱼鳞，虎掌，鹰爪，牛耳，鱼尾构成的。龙龙是中国的象征、中华民族的象征、中国文化的象征。6换心术传说战国时代的典籍《列子》记载：鲁国的公扈和赵国的齐婴得了痼疾去找神医扁鹊医治。扁鹊对公扈说：“汝志疆而气弱，故足于谋而寡于断。齐婴志弱而气疆，故少于虚而伤于专。故换汝之心，则均善矣。”扁鹊先给他俩喝了一种自治的麻醉药。然后为两人做了开胸术，取出心脏互换。接着给他俩灌服了一种神奇的药物，公扈和齐婴随即苏醒过来，怪疾得以治愈。换心术传说战国时代的典籍《列子》记载：鲁国的公扈和赵国的齐婴7现代的器官移植1936年，一位年仅26岁的青年人，由于一位汞中毒导致肾衰竭，无药可救。前苏联医生沃罗诺夫将一个尸体的肾脏移植到病人体内，但没有获得成功，病人在48小时后死去了。1967年，南非医生巴纳德为一名商人成功地作了人类首例异体心脏移植手术。病人手术后顺利地度过了17天，虽然由于肺炎最终夺取了他的第二次生命，但是，这在人类器官移植史上毕竟是一个里程碑式的伟大成就。现代的器官移植1936年，一位年仅26岁的青年人，由于一位汞8异体移植：较强免疫排斥反应，异体器官来源有限。组织代用品：人体相容性差，不能长久使用，还易引起感染。问题：能否用细胞培养再生组织器官达到替换的目的？/v_show/id_XNTQ1ODgyMDA=.html/gb/wbpaper/2007-12/18/content_1406413.htm异体移植：较强免疫排斥反应，异体器官来源有限。9本节主要内容：1.组织工程技术2.组织工程应用本节主要问题种子细胞、组织工程材料、细胞因子本节主要内容：10

第一部分组织工程技术第15讲组织工程课件11一定义组织工程(TissueEngineering)：是利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术。20世纪80年代提出概念。JosephP.VacantiJohnHomansProfessorofSurgeryatHarvardMedicalschoolRobertLangerProfessorofChemicalandBiomedicalEngineeringatMIT一定义组织工程(TissueEngineering)：12二组织工程三要素1.种子细胞2.支架材料3.生长因子二组织工程三要素1.种子细胞13细胞外基质

(extracellularmatrixc,ECM)（1）定义：动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。（2）分布：结缔组织中ECM含量较高。（3）组成：构成细胞外基质的大分子包括：胶原、非胶原糖蛋白、弹性蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖四大类。（4）功能：1）ECMs提供细胞所需的力学和化学信息，是细胞发挥功能的环境；对细胞群体有支持、保护的作用。2）ECMs对细胞形态、迁移、增殖、分化有调节作用。细胞外基质

(extracellularmatrixc,E14以骨为例1-细胞成骨细胞：合成ECMs、矿物质、胶原，组装成新骨破骨细胞：分泌酶使ECMs、矿物质、胶原被吸收软骨细胞：合成ECMs,构成软骨干细胞2-支架羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH，HA]、胶原纤维3-生长因子骨形态发生蛋白以骨为例1-细胞15（一）种子细胞1.定义种子细胞(Seedcell)：是组织修复或再生的细胞材料。2.来源（1）功能细胞：组织来源的体细胞。（2）干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞。3.特点容易获得和体外培养、遗传稳定。4.问题（1）同种、异种细胞存在免疫排斥等问题。（2）干细胞潜在的理想种子细胞，诱导分化技术有待完善。（3）多种类型细胞协调增殖、分化。（一）种子细胞1.定义16（二）支架材料1.定义组织工程支架材料是指替代细胞外基质使用的生物医学材料。（二）支架材料1.定义172.特点（1）生物相容性：生物医学材料引起宿主反应和产生有效作用的能力。（2）生物降解性：材料完成支架的作用后能被降解，降解速率与细胞生长速率相互协调。（3）合适的三维立体结构。（4）加工性与一定的机械强度。（5）良好的消毒性能。2.特点183.分类有机材料与无机材料；天然材料和人工合成材料；单一材料和复合材料。（1）有机材料1）天然高分子材料胶原、壳聚糖、透明质酸等。3.分类19A蛋白类胶原（Collagen）胶原是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白,是构成细胞外基质的骨架，是胞外基质重要的结构蛋白。根据组成的氨基酸与聚合度不同有10种。具有高度缠绕的螺旋结构的纤丝，由纤丝与其他基质分子相互作用达到组织需要的强度、弹性。成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、上皮细胞等合成或分泌，分布于各个部位。A蛋白类胶原（Collagen）20B多糖类壳聚糖（Chitosan）甲壳质的基本单位是乙酰葡萄糖胺，它是由1000～3000个乙酰葡萄糖胺残基通过β-1，4-糖苷键相互连接而成聚合物，是节肢动物角质内的主要结构多糖。壳聚糖是甲壳质的部分脱乙酰化产物，具有阳离子性质，因此可以吸引糖胺聚糖、蛋白聚糖等带负电荷的大分子聚集在支架内，即利于收集组织液中的生长因子。B多糖类壳聚糖（Chitosan）21透明质酸（Hyaluronicacid,HA）透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重复结构组成的线形多糖结构。在结缔组织中比较丰富。透明质酸可高度水化，对组织的水分平衡和关节的润滑有重要作用，已经在整形外科中被广泛采用。保护及润滑细胞，在化妆品、美容行业广泛使用。透明质酸（Hyaluronicacid,HA）222）合成高分子材料聚乳酸（Polylacticacid，PLA）聚羟基乙酸（Polyglycolicacid，PGA）聚羟基丁酸（Polyhydroxybutyrate,PHB）等。2）合成高分子材料23（2）无机材料氧化铝陶瓷、碳纤维、生物陶瓷、羟基磷灰石、合金等，主要用于人工骨、人工肌腱、人工关节等。例如：钴、钛、钢铁基合金金属材料组成人工髋关节的股骨头、膝关节的股骨髁的表面，超高分子聚乙烯材料组成人工髋关节的髋臼股、人工膝关节的胫骨平台部分，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥用于人工关节假体与骨组织的固定。（2）无机材料氧化铝陶瓷、碳纤维、生物陶瓷、羟基磷灰石、合金24各种无机材料氧化铝陶瓷碳纤维生物陶瓷羟基磷灰石各种无机材料氧化铝陶瓷碳纤维生物陶瓷羟基磷灰石25（3）复合材料复合材料：由两种或两种以上不同物理化学性质的材料复合而成的新材料，一般由基体材料和增强材料组成。包括无机材料、有机材料、天然材料与合成材料间的组合。例如：羟基磷灰石-甲壳素、羟基磷灰石-PLA、聚乳酸（Polylacticacid,PLA）-聚羟基乙酸（Polyglycolicacid,PGA）：PLGA等。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）（3）复合材料复合材料：由两种或两种以上不同物理化学性质的材26（三）生长因子细胞对外部环境产生的应答是通过感知某种化学信号或物理刺激，并将之传递到细胞核中，促发或者抑制基因的表达实现的。细胞的增殖与分化由各种因子调节。（三）生长因子细胞对外部环境产生的应答是通过感知某种化学信号271.物理因子主要是应力的作用：流体切应力（Flowshearstress）：由血流对血管壁施加的力。体外可采用常流和脉动流循环装置调节切应力大小。张应力（Tensilestress）：体内有心脏搏动，肌肉收缩等张应力。可采用弹性泡沫或纺织网等载体材料模拟体内的张应力。1.物理因子主要是应力的作用：28细胞生长因子细胞生长因子（Cellgrowthfactor）主要是指在细胞间传递信息、对细胞生长具有调节功能的一些多肽。转移生长因子-β（Transforminggrowthfactor-β,TGF-β）：一种分泌型的多功能蛋白，可以调节细胞增殖、分化与细胞外基质分泌，参与炎症和组织的修复。骨形态发生蛋白(Bonemorphogeneticprotein,BMP)：1965年于脱矿化骨的骨基质中发现的，因其能诱导骨、软骨形成而得名。细胞生长因子细胞生长因子（Cellgrowthfacto29成纤维细胞生长因子（Fibroblastgrowthfactor,FGF）：是不含糖的分子量为16KD的单链多肽，因能促进成纤维细胞生长而得名。由于对血管也有较强的促进作用，又称为血管生长因子。可以诱导血管化、骨形成并促进神经再生。表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor,EGF）：是由53个氨基酸组成的单链多肽。是表皮细胞和间充质细胞的一种有效的促分裂剂。能促进伤口愈合，在体外可以刺激角化细胞分裂，在体内促进上皮的再生。成纤维细胞生长因子（Fibroblastgrowthfa30神经生长因子(Nervegrowthfactor,NGF)为神经细胞特异性分泌的营养蛋白，是具有营养、保护神经元及促进突起生长等生物学功能的神经细胞调节因子。对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、修复、再生和功能特性均有重要的调控作用。肝细胞生长因子（Hepatocytegrowthfactor，HGF）因最初被发现可剌激肝细胞合成DNA而得名，是由728个氨基酸残基组成的多肽单链。肝细胞生长因子是目前已知生物活性最广泛的生长因子之一，能刺激多种上皮和内皮细胞进行有丝分裂、运动，能促进肾小管形态发生，在肾脏的发育、再生中具有较强的作用。神经生长因子(Nervegrowthfactor,NG31生长因子研究与制备

—骨形态发生蛋白（BMPs）1965年美国首先从骨基质中分离出骨形态发生蛋白，经过25年才得以纯化。随后克隆了相关基因。原位状态下以ng/g骨基质剂量释放足以促发骨修复，人工基质需要mg/g剂量才能促发骨修复，因此成本非常高。利用转基因技术将BMP基因转染到骨髓细胞中，再将其种植在矿化基质上，达到骨修复的目的。生长因子研究与制备

—骨形态发生蛋白（BMPs）1965年美32三技术路线与方法三技术路线与方法33（一）细胞接种浸渍法：将经预湿处理材料置于细胞悬浮液中实现细胞接种。沉淀法：将细胞液缓慢逐滴滴加到已经预湿的支架材料上，放置培养箱中2-4小时，待细胞充分粘附后缓慢加入培养液培养。凝胶法：将高密度细胞悬浮液与多种物质如胶原、藻酸纳、几丁质等按照一定工艺复合形成凝胶，细胞均匀地分布于凝胶内。吸附法：将已预湿的支架材料置于培养皿中的细胞悬液中或用滴管将细胞液滴加在材料上，然后利用负压使细胞吸附在材料上。（一）细胞接种浸渍法：将经预湿处理材料置于细胞悬浮液中实现细34（二）细胞因子的控制释放1.在支架材料构建时使细胞因子结合在支架材料内部，并能缓慢释放。2.包埋或者微囊化是目前控制细胞生长因子释放的一个重要方法（二）细胞因子的控制释放1.在支架材料构建时使细胞因子结合在35（三）组织工程生物反应器1.微重力旋转式生物反应器（1）转壁式生物反应器：一般由两个内外同心圆柱组成。内柱由半透膜构成，气体可通过膜交换。内外柱之间充以连续灌注的培养介质。将细胞与培养液置入内、外圆柱体。整个装置可以绕内轴旋转，离心力与重力平衡，为细胞生长提供一个微重力环境。普通培养条件下只能呈二维贴壁生长的哺乳动物细胞表现出三维增殖与分化形成有功能的组织块。（三）组织工程生物反应器1.微重力旋转式生物反应器36（2）流体应力生物反应器模拟人体血管应力环境而设计的用于体外构建组织工程化血管的装置。主要由可以通过循环液体的硅胶管、压力传感器、蠕动泵、储液罐、电磁阀等组成。可通过形成有波动的液流并能控制流量来模拟体内血管的应力环境。（2）流体应力生物反应器37第二部分组织工程应用第15讲组织工程课件38一组织工程皮肤中国每年烧伤、溃疡等皮肤疾病1500万人，需要皮肤移植的约350万，需4亿立方厘米。一组织工程皮肤中国每年烧伤、溃疡等皮肤疾病1500万人，39人工表皮、复合人工皮A表皮B表皮网状棘C真皮乳头D真皮E皮下组织F毛发人工表皮、复合人工皮A表皮40组织工程皮肤技术路线组织工程皮肤技术路线41构建步骤（1）种子细胞与培养液成纤维细胞：DMEM培养基、10%胎牛血清、青霉素、链霉素等。表皮角质形成细胞：DMEM+HamF-12培养基、表皮生长因子等。（2）支架材料聚羟基乙酸（PGA）。构建步骤（1）种子细胞与培养液42（3）构建成纤维细胞-PGA复合物酶法消化收集真皮成纤维细胞，接种在PGA上，加入培养液培养。（4）接种表皮角质形成细胞在前面的复合物上，更换表皮角质形成细胞培养基培养5天左右。（3）构建成纤维细胞-PGA复合物43（5）双层皮肤成熟将复合物放在可渗透膜上，进行气-液界面培养，促进表皮角质形成细胞的进一步分化。再培养1周，形成含真皮和表皮两层结构的组织工程化皮肤。（5）双层皮肤成熟将复合物放在可渗透膜上，进行气-液界面培养44难题：1.血管化：血管生成是指内皮细胞构筑的毛细血管分支和伸展。血管生成有助于损伤组织的修复。2.毛囊、汗腺等再生。所以美容慎用。3.排异性。我国人造皮肤2007年第四军医大学开发成功，进入临床阶段。难题：45二神经修复工程神经远端轴突和髓鞘崩溃时，大量吞噬细胞侵入，一方面清除轴突髓鞘的碎屑，另一方面刺激原来处于休眠状态的雪旺细胞(Schwanncell．SC)分裂和增生，并沿着每一根神经纤维的神经内膜和基底膜排列成柱状，形成一个潜在的管道（即Buengner氏细胞带）；再生轴突通过Buengner氏细胞带，伸延到终末器官，恢复其功能。最后产生髓鞘，形成为有髓神经纤维。（一）种子细胞雪旺细胞(Schwanncell．SC)：SC形成能引导再生轴突生长的Buengner氏细胞带，并能分泌多种细胞因子调控再生轴突生长。二神经修复工程神经远端轴突和髓鞘崩溃时，大量吞噬细胞侵入，46（二）支架材料目前比较常用的生物材料是聚羟基乙酸(polyglyeolicacid．PGA)和聚乳酸(polylacticacid．PLA)。制成直线的丝状有利于SC排列成线状，为形成Buengner氏细胞带制造有利条件。此外材料要及时降解，让位给成长的有髓神经。（二）支架材料目前比较常用的生物材料是聚羟基乙酸(polyg47（三）生物人工肝生物人工肝（Bioartificialliver）由肝细胞、专用反应器和体外循环系统三大部分组成，是将患者的血桨在体外循环代谢的一种辅助装置。由许多空心的纤维毛细管集束组成，肝细胞在毛细管外空间培养或者粘附在微载体上培养，患者血桨通过泵循环进入毛细管，这样肝细胞和血桨间分子可以自由交换，肝细胞吸收氧和营养物，脱除血桨中的有害、有毒物质，并将肝细胞代谢物质传输至血桨内输送回体内。提供肝细胞生长因子等生长因子在体外维持正常功能。（三）生物人工肝生物人工肝（Bioartificialli48最新进展成体干细胞再生角膜：/v_show/id_XMjE5NTAwMzI=.html干细胞培育人心脏组织：/v_show/id_XMjE5Nzg1MTI=.html最新进展成体干细胞再生角膜：49组织工程问题与挑战1.干细胞诱导分化技术2.种子细胞分离与培养3.接种支架材料的方法4.支架材料的设计与优化5.细胞因子的释放、与支架材料相结合的设计，种子细胞表达6.血管化7.复杂性：多细胞协同培养、分化控制8.体外组织器官再生机理有待揭示组织工程问题与挑战1.干细胞诱导分化技术50补充阅读文献补充阅读文献51结束语当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。WhenYouDoYourBest,FailureIsGreat,SoDon'TGiveUp,StickToTheEnd结束语52谢谢大家荣幸这一路，与你同行It'SAnHonorToWalkWithYouAllTheWay演讲人：XXXXXX时间：XX年XX月XX日

谢谢大家演讲人：XXXXXX53第15讲组织工程第15讲组织工程54再生凤凰(Chinesephoenix/phoenix)：雄的叫凤，雌的则叫凰。象征祥瑞。神话中说，凤凰每次死后，会周身燃起大火，然后其在烈火中获得重生，并获得较之以前更强大的生命力，称之为“凤凰涅磐”。再生凤凰(Chinesephoenix/phoenix)55蚯蚓被截为两截以后，断面上肌肉组织快速溶解，然后形成新的细胞团。这时，血液中所含的白细胞也会同时集中在切面上，形成特殊的栓塞，从而使伤口快速闭合。中胚层细胞还具有十分强的分化能力，快速移动至伤口切面上来，在切面上形成一个个结节状的凸起，就被称为再生芽。同时，蚯蚓体内的消化道、血管，以及神经系统等组织的细胞，经过许多分裂，快速地向再生芽里不断生长，切面上就会快速地再生出另外一个头来，并且另一端也会自然生出一条尾巴来。蚯蚓被截为两截以后，断面上肌肉组织快速溶解，然后形成新的细胞56器官移植《圣经》中，上帝始造天地耗时七日，在第六日里用泥土按自己的形状捏成个泥人，然后吹了一口仙气于其中，亚当便有了生命。上帝造了亚当之后，让他当世间万物的主宰，还给他建了个园子，取名为伊甸园（Eden），其意为“乐事，愉快”。取其第七肋骨塑成女状，再吹之以仙气，遂成夏娃（意即“赋予生命”）。器官移植《圣经》中，上帝始造天地耗时七日，在第六日里用泥土按57荷马《伊利亚特》中，描绘了一个叫做凯米拉（Chimera）的怪兽：狮头、羊身、蛇尾，并且背部及尾部又分别伸出一羊头和蛇头。在现代移植学中，凯米拉一词译为嵌合体。丹麦童话美人鱼美人鱼（安徒生）荷马《伊利亚特》中，描绘了一个叫做凯米拉（Chimera）的58龙龙是中国的象征、中华民族的象征、中国文化的象征。龙是中国古人对鱼、鳄、蛇、猪、马、牛等动物，和云、雷电、虹霓等自然天象模糊集合而产生的一种神物：马头（驼、牛、扬子鳄头），象鼻，鲤鱼须，蛇身，鹿角，龟眼（兔、虎），鱼鳞，虎掌，鹰爪，牛耳，鱼尾构成的。龙龙是中国的象征、中华民族的象征、中国文化的象征。59换心术传说战国时代的典籍《列子》记载：鲁国的公扈和赵国的齐婴得了痼疾去找神医扁鹊医治。扁鹊对公扈说：“汝志疆而气弱，故足于谋而寡于断。齐婴志弱而气疆，故少于虚而伤于专。故换汝之心，则均善矣。”扁鹊先给他俩喝了一种自治的麻醉药。然后为两人做了开胸术，取出心脏互换。接着给他俩灌服了一种神奇的药物，公扈和齐婴随即苏醒过来，怪疾得以治愈。换心术传说战国时代的典籍《列子》记载：鲁国的公扈和赵国的齐婴60现代的器官移植1936年，一位年仅26岁的青年人，由于一位汞中毒导致肾衰竭，无药可救。前苏联医生沃罗诺夫将一个尸体的肾脏移植到病人体内，但没有获得成功，病人在48小时后死去了。1967年，南非医生巴纳德为一名商人成功地作了人类首例异体心脏移植手术。病人手术后顺利地度过了17天，虽然由于肺炎最终夺取了他的第二次生命，但是，这在人类器官移植史上毕竟是一个里程碑式的伟大成就。现代的器官移植1936年，一位年仅26岁的青年人，由于一位汞61异体移植：较强免疫排斥反应，异体器官来源有限。组织代用品：人体相容性差，不能长久使用，还易引起感染。问题：能否用细胞培养再生组织器官达到替换的目的？/v_show/id_XNTQ1ODgyMDA=.html/gb/wbpaper/2007-12/18/content_1406413.htm异体移植：较强免疫排斥反应，异体器官来源有限。62本节主要内容：1.组织工程技术2.组织工程应用本节主要问题种子细胞、组织工程材料、细胞因子本节主要内容：63

第一部分组织工程技术第15讲组织工程课件64一定义组织工程(TissueEngineering)：是利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术。20世纪80年代提出概念。JosephP.VacantiJohnHomansProfessorofSurgeryatHarvardMedicalschoolRobertLangerProfessorofChemicalandBiomedicalEngineeringatMIT一定义组织工程(TissueEngineering)：65二组织工程三要素1.种子细胞2.支架材料3.生长因子二组织工程三要素1.种子细胞66细胞外基质

(extracellularmatrixc,ECM)（1）定义：动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。（2）分布：结缔组织中ECM含量较高。（3）组成：构成细胞外基质的大分子包括：胶原、非胶原糖蛋白、弹性蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖四大类。（4）功能：1）ECMs提供细胞所需的力学和化学信息，是细胞发挥功能的环境；对细胞群体有支持、保护的作用。2）ECMs对细胞形态、迁移、增殖、分化有调节作用。细胞外基质

(extracellularmatrixc,E67以骨为例1-细胞成骨细胞：合成ECMs、矿物质、胶原，组装成新骨破骨细胞：分泌酶使ECMs、矿物质、胶原被吸收软骨细胞：合成ECMs,构成软骨干细胞2-支架羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH，HA]、胶原纤维3-生长因子骨形态发生蛋白以骨为例1-细胞68（一）种子细胞1.定义种子细胞(Seedcell)：是组织修复或再生的细胞材料。2.来源（1）功能细胞：组织来源的体细胞。（2）干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞。3.特点容易获得和体外培养、遗传稳定。4.问题（1）同种、异种细胞存在免疫排斥等问题。（2）干细胞潜在的理想种子细胞，诱导分化技术有待完善。（3）多种类型细胞协调增殖、分化。（一）种子细胞1.定义69（二）支架材料1.定义组织工程支架材料是指替代细胞外基质使用的生物医学材料。（二）支架材料1.定义702.特点（1）生物相容性：生物医学材料引起宿主反应和产生有效作用的能力。（2）生物降解性：材料完成支架的作用后能被降解，降解速率与细胞生长速率相互协调。（3）合适的三维立体结构。（4）加工性与一定的机械强度。（5）良好的消毒性能。2.特点713.分类有机材料与无机材料；天然材料和人工合成材料；单一材料和复合材料。（1）有机材料1）天然高分子材料胶原、壳聚糖、透明质酸等。3.分类72A蛋白类胶原（Collagen）胶原是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白,是构成细胞外基质的骨架，是胞外基质重要的结构蛋白。根据组成的氨基酸与聚合度不同有10种。具有高度缠绕的螺旋结构的纤丝，由纤丝与其他基质分子相互作用达到组织需要的强度、弹性。成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、上皮细胞等合成或分泌，分布于各个部位。A蛋白类胶原（Collagen）73B多糖类壳聚糖（Chitosan）甲壳质的基本单位是乙酰葡萄糖胺，它是由1000～3000个乙酰葡萄糖胺残基通过β-1，4-糖苷键相互连接而成聚合物，是节肢动物角质内的主要结构多糖。壳聚糖是甲壳质的部分脱乙酰化产物，具有阳离子性质，因此可以吸引糖胺聚糖、蛋白聚糖等带负电荷的大分子聚集在支架内，即利于收集组织液中的生长因子。B多糖类壳聚糖（Chitosan）74透明质酸（Hyaluronicacid,HA）透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重复结构组成的线形多糖结构。在结缔组织中比较丰富。透明质酸可高度水化，对组织的水分平衡和关节的润滑有重要作用，已经在整形外科中被广泛采用。保护及润滑细胞，在化妆品、美容行业广泛使用。透明质酸（Hyaluronicacid,HA）752）合成高分子材料聚乳酸（Polylacticacid，PLA）聚羟基乙酸（Polyglycolicacid，PGA）聚羟基丁酸（Polyhydroxybutyrate,PHB）等。2）合成高分子材料76（2）无机材料氧化铝陶瓷、碳纤维、生物陶瓷、羟基磷灰石、合金等，主要用于人工骨、人工肌腱、人工关节等。例如：钴、钛、钢铁基合金金属材料组成人工髋关节的股骨头、膝关节的股骨髁的表面，超高分子聚乙烯材料组成人工髋关节的髋臼股、人工膝关节的胫骨平台部分，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥用于人工关节假体与骨组织的固定。（2）无机材料氧化铝陶瓷、碳纤维、生物陶瓷、羟基磷灰石、合金77各种无机材料氧化铝陶瓷碳纤维生物陶瓷羟基磷灰石各种无机材料氧化铝陶瓷碳纤维生物陶瓷羟基磷灰石78（3）复合材料复合材料：由两种或两种以上不同物理化学性质的材料复合而成的新材料，一般由基体材料和增强材料组成。包括无机材料、有机材料、天然材料与合成材料间的组合。例如：羟基磷灰石-甲壳素、羟基磷灰石-PLA、聚乳酸（Polylacticacid,PLA）-聚羟基乙酸（Polyglycolicacid,PGA）：PLGA等。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）（3）复合材料复合材料：由两种或两种以上不同物理化学性质的材79（三）生长因子细胞对外部环境产生的应答是通过感知某种化学信号或物理刺激，并将之传递到细胞核中，促发或者抑制基因的表达实现的。细胞的增殖与分化由各种因子调节。（三）生长因子细胞对外部环境产生的应答是通过感知某种化学信号801.物理因子主要是应力的作用：流体切应力（Flowshearstress）：由血流对血管壁施加的力。体外可采用常流和脉动流循环装置调节切应力大小。张应力（Tensilestress）：体内有心脏搏动，肌肉收缩等张应力。可采用弹性泡沫或纺织网等载体材料模拟体内的张应力。1.物理因子主要是应力的作用：81细胞生长因子细胞生长因子（Cellgrowthfactor）主要是指在细胞间传递信息、对细胞生长具有调节功能的一些多肽。转移生长因子-β（Transforminggrowthfactor-β,TGF-β）：一种分泌型的多功能蛋白，可以调节细胞增殖、分化与细胞外基质分泌，参与炎症和组织的修复。骨形态发生蛋白(Bonemorphogeneticprotein,BMP)：1965年于脱矿化骨的骨基质中发现的，因其能诱导骨、软骨形成而得名。细胞生长因子细胞生长因子（Cellgrowthfacto82成纤维细胞生长因子（Fibroblastgrowthfactor,FGF）：是不含糖的分子量为16KD的单链多肽，因能促进成纤维细胞生长而得名。由于对血管也有较强的促进作用，又称为血管生长因子。可以诱导血管化、骨形成并促进神经再生。表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor,EGF）：是由53个氨基酸组成的单链多肽。是表皮细胞和间充质细胞的一种有效的促分裂剂。能促进伤口愈合，在体外可以刺激角化细胞分裂，在体内促进上皮的再生。成纤维细胞生长因子（Fibroblastgrowthfa83神经生长因子(Nervegrowthfactor,NGF)为神经细胞特异性分泌的营养蛋白，是具有营养、保护神经元及促进突起生长等生物学功能的神经细胞调节因子。对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、修复、再生和功能特性均有重要的调控作用。肝细胞生长因子（Hepatocytegrowthfactor，HGF）因最初被发现可剌激肝细胞合成DNA而得名，是由728个氨基酸残基组成的多肽单链。肝细胞生长因子是目前已知生物活性最广泛的生长因子之一，能刺激多种上皮和内皮细胞进行有丝分裂、运动，能促进肾小管形态发生，在肾脏的发育、再生中具有较强的作用。神经生长因子(Nervegrowthfactor,NG84生长因子研究与制备

—骨形态发生蛋白（BMPs）1965年美国首先从骨基质中分离出骨形态发生蛋白，经过25年才得以纯化。随后克隆了相关基因。原位状态下以ng/g骨基质剂量释放足以促发骨修复，人工基质需要mg/g剂量才能促发骨修复，因此成本非常高。利用转基因技术将BMP基因转染到骨髓细胞中，再将其种植在矿化基质上，达到骨修复的目的。生长因子研究与制备

—骨形态发生蛋白（BMPs）1965年美85三技术路线与方法三技术路线与方法86（一）细胞接种浸渍法：将经预湿处理材料置于细胞悬浮液中实现细胞接种。沉淀法：将细胞液缓慢逐滴滴加到已经预湿的支架材料上，放置培养箱中2-4小时，待细胞充分粘附后缓慢加入培养液培养。凝胶法：将高密度细胞悬浮液与多种物质如胶原、藻酸纳、几丁质等按照一定工艺复合形成凝胶，细胞均匀地分布于凝胶内。吸附法：将已预湿的支架材料置于培养皿中的细胞悬液中或用滴管将细胞液滴加在材料上，然后利用负压使细胞吸附在材料上。（一）细胞接种浸渍法：将经预湿处理材料置于细胞悬浮液中实现细87（二）细胞因子的控制释放1.在支架材料构建时使细胞因子结合在支架材料内部，并能缓慢释放。2.包埋或者微囊化是目前控制细胞生长因子释放的一个重要方法（二）细胞因子的控制释放1.在支架材料构建时使细胞因子结合在88（三）组织工程生物反应器1.微重力旋转式生物反应器（1）转壁式生物反应器：一般由两个内外同心圆柱组成。内柱由半透膜构成，气体可通过膜交换。内外柱之间充以连续灌注的培养介质。将细胞与培养液置入内、外圆柱体。整个装置可以绕内轴旋转，离心力与重力平衡，为细胞生长提供一个微重力环境。普通培养条件下只能呈二维贴壁生长的哺乳动物细胞表现出三维增殖与分化形成有功能的组织块。（三）组织工程生物反应器1.微重力旋转式生物反应器89（2）流体应力生物反应器模拟人体血管应力环境而设计的用于体外构建组织工程化血管的装置。主要由可以通过循环液体的硅胶管、压力传感器、蠕动泵、储液罐、电磁阀等组成。可通过形成有波动的液流并能控制流量来模拟体内血管的应力环境。（2）流体应力生物反应器90第二部分组织工程应用第15讲组织工程课件91一组织工程皮肤中国每年烧伤、溃疡等皮肤疾病1500万人，需要皮肤移植的约350万，需4亿立方厘米。一组织工程皮肤中国每年烧伤、溃疡等皮肤疾病1500万人，92人工表皮、复合人工皮A表皮B表皮网状棘C真皮乳头D真皮E皮下组织F毛发人工表皮、复合人工皮A表皮93组织工程皮肤技术路线组织工程皮肤技术路线94构建步骤（1）种子细胞与培养液成纤维细胞：DMEM培养基、10%胎牛血清、青霉素、链霉素等。表皮角质形成细胞：DMEM+HamF-12培养基、表皮生长因子等。（2）支架材料聚羟基乙酸（PGA）。构建步骤（1）种子细胞与培养液95（3）构建成纤维细胞-PG