基因工程产品分离纯化技术课件

基因工程产品分离纯化技术基因工程产品分离纯化技术1内容一.基因工程表达产物的特点二.基因工程药物分离纯化技术的要求三.分离纯化的基本过程四.如何选择分离纯化的方法五.基因工程产品中试的研究内容一.基因工程表达产物的特点2一、基因工程表达产物的特点

基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质。它的制得具有以下特点：一、基因工程表达产物的特点基因工程药物的分3①表达产物在初始料中含量较低；②含有大量细胞及代谢产物；③表达产物稳定性差，易失活变性；①表达产物在初始料中含量较低；②含有大量细胞及代谢产物；③表4④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；⑤对其质量要求纯度高、无菌、无热原④表达产物的种类繁多、结构不一、⑤对其质量要求纯度高、无菌、5二、分离纯化的技术要求①技术条件温和能保持产物生物活性。②选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。③收率要高。④两个技数间能直接衔接，不需要对物料加以处理。⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。二、分离纯化的技术要求①技术条件温和能保持产物生物活性。③收6⒈细胞破碎与固液分离⑴细胞收集：离心法、膜分离法。⑵细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法。⑶固液分离⒈细胞破碎与固液分离⑴细胞收集：离心法、膜分离法。7目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。2.目的产物的分离纯化目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。2.目的产物的分离纯8

产物特性作用等电点决定离子交换种类及条件相对分子量选择不同孔径的介质疏水性与疏水、反相介质结合的程度生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用温度及流程时间产物的特性在分离纯化中的作用产物特性9⑵热原质的去除热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。⑶病毒的去除层析或过滤可将病毒去除。⑵热原质的去除热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去10三、分离纯化的基本过程分离纯化原则分离策略粗纯色谱技术与精纯三、分离纯化的基本过程分离纯化原则11（一）、分离纯化原则要建立一个方便灵敏的蛋白检测方法，以估价每一步的提纯程度；分离步骤要尽可能少；初步分离要快速，精纯要高分辨率；尽可能避免带入有害物质;每步需统计：得率、纯度、纯化倍数（一）、分离纯化原则要建立一个方便灵敏的蛋白检测方法，以估价12（二）、分离纯化策略（二）、分离纯化策略13（三）、粗纯固液分离胞内表达分泌表达菌体包涵体裂解液复性液上清粗提液捕获目的产物破菌、离心、洗涤柱层析/沉淀/超滤裂解：尿素、盐酸胍复性：稀释、柱复性（三）、粗纯固液分离胞内表达分泌表达菌体包涵体裂解液复性液上14Howtobreakthebacteriacells?UltrosonicationHigh-pressurehomogenizerHowtobreakthebacteriacell15Seperationandclarification

——Cross-flowfiltration——High-speedCentrifugationSeperationandclarification16（四）精纯除宿主来源DNA除宿主来源蛋白质除宿主来源内毒素或致病因子除目的产物的异构体——色谱技术的应用精纯的主要目的：（四）精纯——色谱技术的应用精纯的主要目的：17

基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。层析因固相介质不同又分为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。色谱分离原理基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品18

将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。样品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成分分离的目的。将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等19常用色谱分离技术凝胶过滤（分子排阻）层析（GF，SEC）离子交换层析（IEX）疏水作用层析（HIC）亲和层析（AC）反相色谱层析（RPC）医学全在线()常用色谱分离技术凝胶过滤（分子排阻）层析（GF，SEC）医学20（四）精纯（1）（四）精纯（1）21（四）精纯（2）2-3步柱层析：离子交换（IEX）、疏水（HIC）、凝胶过滤（GF）尽量避免采用亲和层析（AC）尽量避免采用反相层析（RPC）除细菌内毒素用阴离子交换（AEX）（四）精纯（2）2-3步柱层析：离子交换（IEX）、疏水22AIEXTechniqueUltrafiltrationUFSuperdex200p.g.GFPurification

factorQSepharoseFF10timespurification82%yieldPhenylSepharoseHPHICY.-F.Liaoetal.(1996)J.Biol.Chem.271,2834863622719Purificationofrecombinanta-mannosidasefromPichiapastorisAIEXTechniqueUltrafiltrationUF23中试规模中压层析系统—AKTAexplorer100中试规模中压层析系统—AKTAexplorer10024AKTAexplorer100色谱系统工作流程AKTAexplorer100色谱系统工作流程25⒈根据产物表达形式来选择四、如何选择分离纯化的方法

分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低纯化前必须浓缩可用沉淀和超滤法。⒈根据产物表达形式来选择四、如何选择分离纯化的方法分泌型表26产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式,它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质,在一定程度上有利于分离纯化.为了获得周质蛋白经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透压休克的方法来获得。产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式,它27可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换28⒉根据分离单元之间的衔接选择

应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。

先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。⒉根据分离单元之间的衔接选择应选择不同机制的分离29随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。

层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤。随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤30

分离纯化工艺应遵循以下原则：⑴具有良好的稳定性和重复性⑵尽可能减少组成工艺的步骤⑶各技术步骤间要相互适应和协调⒊根据分离纯化工艺的要求来选择分离纯化工艺应遵循以下原则：⒊根据分离纯化工31⑷工艺过程中尽可能少用试剂⑸工艺所用时间要短⑹工艺和技术必须高效收率高易操作能耗低⑺具有较高的安全性⑷工艺过程中尽可能少用试剂32SDS-PAGETotalproteinsHighSaltIonexchangeGel-filtrationAffinitySDS-PAGETotalproteins33中试研究的概念与原则中试的研究内容中试样品的用途五、基因工程药物的中试研究医学全在线()中试研究的概念与原则五、基因工程药物的中试研究医学全在线34一、中试研究的概念与原则中试研究的概念：*从实验室阶段向生产阶段过渡的一个中间阶段；*是在中试规模下，对一系列工艺参数和质量控制体系进行研究的过程；*目的是建立一条完全模拟生产实际状况的小型质控与生产流水线。一、中试研究的概念与原则中试研究的概念：35生产的批量要达到一定的规模，以满足检定、稳定性研究、非临床研究和临床试验需要工艺要稳定（观察3-5批）、工艺规模可同等条件放大需建立生产全过程的质控体系要符合GMP条件要符合成本控制原则中试研究的原则：中试研究的原则：36二、中试研究的内容发酵分离纯化制剂配制培养基和各参数对生长曲线、表达曲线、表达水平、总产量的影响。指标：表达水平、蛋白总量、菌重/体积各分离纯化步骤的参数对下述指标的影响：纯度、产量、得率、比活性等各参数对工艺得率、半成品及成品质量的影响工艺过程菌种菌体/上清各纯化中间体原液半成品成品质控点工艺依据、质控指标稀释、除菌分装、冻干质量标准、稳定性研究《制造与检定规程》二、中试研究的内容发酵分离纯化制剂配制培养基和各参数对生长曲37三、中试样品的用途注册检定与标准复核（1-3批，原液与成品6倍全检定用量）标准品或参考品制备非临床研究临床试验稳定性研究（原液与半成品）三、中试样品的用途38作业基因工程表达产物的特点是什么？如何根据产物的特性来设计分离纯化路线？分离纯化应遵循的原则是什么？中试的概念、原则分别是什么？作业基因工程表达产物的特点是什么？39谢谢！医学全在线()谢谢！医学全在线40(1)凝胶过滤层析此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。SephadexG10-G200(葡聚糖凝胶)Sepharose2B,4B,6B(琼脂糖凝胶)SephacrylS100,S200,S300,S400(聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶)(1)凝胶过滤层析此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质41分子筛层析的工作原理也叫凝胶过滤层析分子筛层析的工作原理也叫凝胶过滤层析42带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠43凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠441、根据不同分子量选择不同凝胶Sephadex:交联葡聚糖G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值X10Sepharose：琼脂糖凝胶Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶凝胶过滤的过程凝胶过滤的过程45凝胶柱的选择凝胶柱的选择462、凝胶的前处理溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。碱洗：用0.5MNaOH溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。酸洗：用0.5MHCl溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。2、凝胶的前处理溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸47将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4~1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。3、装柱将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。3、装柱484、样品上柱、洗脱、收集

如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。4、样品上柱、洗脱、收集如图装好层析装置，打开下495、凝胶的再生及保存再生

用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能凝胶的保存方法

0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷返回5、凝胶的再生及保存再生返回50

如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。带有SO3－或COO－基团，通常以SO3－Na＋或COO－H＋形式出现的叫做阳离子交换基；

带有N＋（C2H5）基团通常以N＋（C2H5）Cl－出现的叫做阴离子交换基。(2)离子交换层析如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，51阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，52阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素53时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH

值。当pI<pH时，蛋白质带净负电荷；而当

pI>pH时，蛋白质带净正电荷。举一例子：已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存54阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质高离子强度洗脱液洗高离子强度洗脱液洗加样平衡液洗收集返回阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质高离子强度洗脱液洗高离子55特点：利用样品与介质疏水性大小进行分离，样品不必脱盐。原理：1.疏水作用，Pr与疏水固定相结合。

（1）Pr表面的疏水补丁。

（2）Pr局部变性，暴露疏残基。（3）高盐浓度下

1mol/L(NH4)2SO4,2mol/LNaCl,Pr表面疏水表面与固定相结合。(3)疏水层析特点：利用样品与介质疏水性大小进行分离，样品不必脱盐。(3)56原理：2.吸附剂：

配体：苯基C6，辛基C8，烷基C18

介质：硅胶、树脂如phenyl、

sepharoseFF、

sepharoseCL-4B疏水层析原理：2.吸附剂：

配体：苯基C6，辛基C857洗脱：盐浓度高，疏水弱的Pr先流出；

盐浓度低，疏水强的Pr后流出。疏水层析返回洗脱：盐浓度高，疏水弱的Pr先流出；

盐浓度低58

依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。(4)亲和层析(4)亲和层析59亲和色谱颗粒具有极强的专一性亲和色谱颗粒具有极强的专一性60含配体溶液收集目的蛋白

洗下未结合的蛋白混合蛋白样品平衡液带有配体的树脂珠（或胶粒）含配体溶液收集目的蛋白洗下未结合的蛋白混合蛋白样品平衡液带61亲和层析过程返回亲和层析过程返回62流动相极性＞固定相极性色谱根据极性分类流动相极性＜固定相极性反相色谱正相色谱返回固定相：烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS柱或C18柱就是最典型的代表，其极性很小。

适于分离非极性、弱极性离子型样品，是当今液相色谱的最主要分离模式。

固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。

适于分离脂荣、水溶性的极性、强极性化合物

流动相极性＞固定相极性色流动相极性＜固定相极性反相色谱正相色63

当外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物常常聚集在一起形成大约0.5～1μm的折光小体，称包涵体。包涵体中大部分（占50％以上）是克隆表达的产物，这些产物的一级结构是正确的，但没有经过正确折叠形成天然的高级结构，因此没有生物学活性。包涵体必须经过溶解复性才能得到具有生物学活性的目的蛋白。

1、什么是包涵体？2、何谓复性？复性是非折叠形式的变性蛋白在适当环境中折叠成活性蛋白的过程，它是从包涵体纯化重组活性蛋白过程中最关键、最复杂的步骤。医学全在线()

当外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物常常聚集在一64基因工程产品分离纯化技术基因工程产品分离纯化技术65内容一.基因工程表达产物的特点二.基因工程药物分离纯化技术的要求三.分离纯化的基本过程四.如何选择分离纯化的方法五.基因工程产品中试的研究内容一.基因工程表达产物的特点66一、基因工程表达产物的特点

基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质。它的制得具有以下特点：一、基因工程表达产物的特点基因工程药物的分67①表达产物在初始料中含量较低；②含有大量细胞及代谢产物；③表达产物稳定性差，易失活变性；①表达产物在初始料中含量较低；②含有大量细胞及代谢产物；③表68④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；⑤对其质量要求纯度高、无菌、无热原④表达产物的种类繁多、结构不一、⑤对其质量要求纯度高、无菌、69二、分离纯化的技术要求①技术条件温和能保持产物生物活性。②选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。③收率要高。④两个技数间能直接衔接，不需要对物料加以处理。⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。二、分离纯化的技术要求①技术条件温和能保持产物生物活性。③收70⒈细胞破碎与固液分离⑴细胞收集：离心法、膜分离法。⑵细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法。⑶固液分离⒈细胞破碎与固液分离⑴细胞收集：离心法、膜分离法。71目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。2.目的产物的分离纯化目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。2.目的产物的分离纯72

产物特性作用等电点决定离子交换种类及条件相对分子量选择不同孔径的介质疏水性与疏水、反相介质结合的程度生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用温度及流程时间产物的特性在分离纯化中的作用产物特性73⑵热原质的去除热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。⑶病毒的去除层析或过滤可将病毒去除。⑵热原质的去除热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去74三、分离纯化的基本过程分离纯化原则分离策略粗纯色谱技术与精纯三、分离纯化的基本过程分离纯化原则75（一）、分离纯化原则要建立一个方便灵敏的蛋白检测方法，以估价每一步的提纯程度；分离步骤要尽可能少；初步分离要快速，精纯要高分辨率；尽可能避免带入有害物质;每步需统计：得率、纯度、纯化倍数（一）、分离纯化原则要建立一个方便灵敏的蛋白检测方法，以估价76（二）、分离纯化策略（二）、分离纯化策略77（三）、粗纯固液分离胞内表达分泌表达菌体包涵体裂解液复性液上清粗提液捕获目的产物破菌、离心、洗涤柱层析/沉淀/超滤裂解：尿素、盐酸胍复性：稀释、柱复性（三）、粗纯固液分离胞内表达分泌表达菌体包涵体裂解液复性液上78Howtobreakthebacteriacells?UltrosonicationHigh-pressurehomogenizerHowtobreakthebacteriacell79Seperationandclarification

——Cross-flowfiltration——High-speedCentrifugationSeperationandclarification80（四）精纯除宿主来源DNA除宿主来源蛋白质除宿主来源内毒素或致病因子除目的产物的异构体——色谱技术的应用精纯的主要目的：（四）精纯——色谱技术的应用精纯的主要目的：81

基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。层析因固相介质不同又分为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。色谱分离原理基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品82

将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。样品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成分分离的目的。将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等83常用色谱分离技术凝胶过滤（分子排阻）层析（GF，SEC）离子交换层析（IEX）疏水作用层析（HIC）亲和层析（AC）反相色谱层析（RPC）医学全在线()常用色谱分离技术凝胶过滤（分子排阻）层析（GF，SEC）医学84（四）精纯（1）（四）精纯（1）85（四）精纯（2）2-3步柱层析：离子交换（IEX）、疏水（HIC）、凝胶过滤（GF）尽量避免采用亲和层析（AC）尽量避免采用反相层析（RPC）除细菌内毒素用阴离子交换（AEX）（四）精纯（2）2-3步柱层析：离子交换（IEX）、疏水86AIEXTechniqueUltrafiltrationUFSuperdex200p.g.GFPurification

factorQSepharoseFF10timespurification82%yieldPhenylSepharoseHPHICY.-F.Liaoetal.(1996)J.Biol.Chem.271,2834863622719Purificationofrecombinanta-mannosidasefromPichiapastorisAIEXTechniqueUltrafiltrationUF87中试规模中压层析系统—AKTAexplorer100中试规模中压层析系统—AKTAexplorer10088AKTAexplorer100色谱系统工作流程AKTAexplorer100色谱系统工作流程89⒈根据产物表达形式来选择四、如何选择分离纯化的方法

分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低纯化前必须浓缩可用沉淀和超滤法。⒈根据产物表达形式来选择四、如何选择分离纯化的方法分泌型表90产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式,它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质,在一定程度上有利于分离纯化.为了获得周质蛋白经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透压休克的方法来获得。产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式,它91可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换92⒉根据分离单元之间的衔接选择

应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。

先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。⒉根据分离单元之间的衔接选择应选择不同机制的分离93随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。

层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤。随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤94

分离纯化工艺应遵循以下原则：⑴具有良好的稳定性和重复性⑵尽可能减少组成工艺的步骤⑶各技术步骤间要相互适应和协调⒊根据分离纯化工艺的要求来选择分离纯化工艺应遵循以下原则：⒊根据分离纯化工95⑷工艺过程中尽可能少用试剂⑸工艺所用时间要短⑹工艺和技术必须高效收率高易操作能耗低⑺具有较高的安全性⑷工艺过程中尽可能少用试剂96SDS-PAGETotalproteinsHighSaltIonexchangeGel-filtrationAffinitySDS-PAGETotalproteins97中试研究的概念与原则中试的研究内容中试样品的用途五、基因工程药物的中试研究医学全在线()中试研究的概念与原则五、基因工程药物的中试研究医学全在线98一、中试研究的概念与原则中试研究的概念：*从实验室阶段向生产阶段过渡的一个中间阶段；*是在中试规模下，对一系列工艺参数和质量控制体系进行研究的过程；*目的是建立一条完全模拟生产实际状况的小型质控与生产流水线。一、中试研究的概念与原则中试研究的概念：99生产的批量要达到一定的规模，以满足检定、稳定性研究、非临床研究和临床试验需要工艺要稳定（观察3-5批）、工艺规模可同等条件放大需建立生产全过程的质控体系要符合GMP条件要符合成本控制原则中试研究的原则：中试研究的原则：100二、中试研究的内容发酵分离纯化制剂配制培养基和各参数对生长曲线、表达曲线、表达水平、总产量的影响。指标：表达水平、蛋白总量、菌重/体积各分离纯化步骤的参数对下述指标的影响：纯度、产量、得率、比活性等各参数对工艺得率、半成品及成品质量的影响工艺过程菌种菌体/上清各纯化中间体原液半成品成品质控点工艺依据、质控指标稀释、除菌分装、冻干质量标准、稳定性研究《制造与检定规程》二、中试研究的内容发酵分离纯化制剂配制培养基和各参数对生长曲101三、中试样品的用途注册检定与标准复核（1-3批，原液与成品6倍全检定用量）标准品或参考品制备非临床研究临床试验稳定性研究（原液与半成品）三、中试样品的用途102作业基因工程表达产物的特点是什么？如何根据产物的特性来设计分离纯化路线？分离纯化应遵循的原则是什么？中试的概念、原则分别是什么？作业基因工程表达产物的特点是什么？103谢谢！医学全在线()谢谢！医学全在线104(1)凝胶过滤层析此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。SephadexG10-G200(葡聚糖凝胶)Sepharose2B,4B,6B(琼脂糖凝胶)SephacrylS100,S200,S300,S400(聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶)(1)凝胶过滤层析此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质105分子筛层析的工作原理也叫凝胶过滤层析分子筛层析的工作原理也叫凝胶过滤层析106带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠107凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠1081、根据不同分子量选择不同凝胶Sephadex:交联葡聚糖G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值X10Sepharose：琼脂糖凝胶Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶凝胶过滤的过程凝胶过滤的过程109凝胶柱的选择凝胶柱的选择1102、凝胶的前处理溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。碱洗：用0.5MNaOH溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。酸洗：用0.5MHCl溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。2、凝胶的前处理溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸111将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4~1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。3、装柱将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。3、装柱1124、样品上柱、洗脱、收集

如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。4、样品上柱、洗脱、收集如图装好层析装置，打开下1135、凝胶的再生及保存再生

用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能凝胶的保存方法

0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷返回5、凝胶的再生及保存再生返回114

如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。带有SO3－或COO－基团，通常以SO3－Na＋或COO－H＋形式出现的叫做阳离子交换基；

带有N＋（C2H5）基团通常以N＋（C2H5）Cl－出现的叫做阴离子交换基。(2)离子交换层析如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，115阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，116阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素117时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH

值。当pI<pH时，蛋白质带净负电荷；而当

pI>pH时，蛋白质带净正电荷。举一例子：已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在