第六章凝胶过滤课件

第六章凝胶过滤第六章凝胶过滤1

凝胶过滤又称凝胶扩散色谱、排阻色谱、限制扩散色谱、分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。凝胶过滤又称凝胶扩散色谱、排阻色谱、限2特点操作简便、设备简单分离效果好，重复性高分离条件缓和应用广泛分辨率不高，分离操作慢特点操作简便、设备简单3第一节凝胶的分类及性质

凝胶：是不溶于水但在水中有较大膨胀度和较好分子筛功能的一类化合物。

主要有葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖。其次，还有聚丙烯酰胺凝胶(生物胶)、交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶，以及交联琼脂糖与葡聚糖共价结合的凝胶等。第一节凝胶的分类及性质凝胶：是不溶于水4一、葡聚糖凝胶

是应用最广的一类凝胶，葡聚糖凝胶的商品名称为sephadex，它是由葡聚糖和3—氯—1，2环氧丙烷(交联剂)在碱性条件下，以透平油作为分散介质，在40℃以醚键相互交联，然后进行酒精脱水，烘干、过筛而成的。一、葡聚糖凝胶是应用最广的一类凝胶，葡聚糖凝5第六章凝胶过滤课件61．理化性质

葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒，在显微镜下放大700倍以上，可见其表面的网状皱纹，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。

1．理化性质7

交联度：交联剂在葡聚糖凝胶中占的百分数。吸水量：每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量。但不包括颗粒间所带的水量膨胀度：每g干胶在水或其他规定的溶剂中，在一定时间与温度条件下膨胀后所占有的体积毫升数。S=V/W

交联度：交联剂在葡聚糖凝胶中占的百分数。8交联度

吸水量

膨胀度

分离对象的大小编号交联度吸液量膨胀速度凝胶网孔分离限凝胶强度大小小大大小慢快大小大小小大交联度9

型号、颗粒大小、分离范围、吸水量、膨胀度、溶胀时间。G后面的编号为膨胀度的10倍。如：sephadexG-25表示每克干胶吸水量为2.5ml。除了在水中溶涨外，葡聚糖凝胶还可在乙醇、甲酰胺、二甲亚砜中溶涨。sephadexG-25在水中只需溶涨3小时，sephadexG-100需要3天才能饱和。商品葡聚糖凝胶的规格型号、颗粒大小、分离范围、吸水量、膨胀度、溶胀时10

2．稳定性

葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。

在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消毒0.5h，其性质并不改变。在0.1mol/LHCl溶液中浸泡1-2h，甚至在0.02mol／LHCl溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。

但是，当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。

2．稳定性11

3．吸附性

葡聚糖凝胶系弱酸性物质、这是由于其每克干胶含10－20ug当量的羧基基团所致。该基团能与分离物中电荷基团(尤其是碱性蛋白质)发生吸附作用。当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。因此进行葡聚糖凝胶层析时，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。

3．吸附性12

新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子质量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响。新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，虽13

二、琼脂糖凝胶

琼脂糖是从琼脂中提纯的，主要由D半乳糖和3,6脱水L半乳糖连接而成的一种线性多糖。

琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。

琼脂糖凝胶的孔径由制胶时琼脂糖的浓度决定，低浓度琼脂糖形成的孔径较大，而高浓度琼脂糖形成的孔径较小。

二、琼脂糖凝胶14

尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可被羧基、甲氧基、硫酸根等取代，因而使琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，样品与凝胶间的相互静电作用产生吸附，从而影响分离效果。但是明显低于葡聚糖。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可被羧15

这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度到45℃以下时，它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。该物质对尿素和盐酸等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在pH4.0—9.0的缓冲液中是稳定的、琼脂糖凝胶置室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝胶。

这种多糖链在100℃左右时呈液态16

琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好，分离范围大。用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。

最好使用条件控制在pH4～9之间，温度0～40℃，超出此范围,可能被破坏。琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶17琼脂糖凝胶规格国产的产品有3种规格：Sepharose2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度为2%、4%、6%。

美国的为Bio－GA，有6个型号:即Bio-G0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。

琼脂糖凝胶规格国产的产品有3种规格：美国的为Bi18浓度大，分离范围小，颗粒强度大。CL交联琼脂糖：

Sepharose与1，3-二溴异丙醇在强碱条件下生成的。比琼脂糖的稳定性提高，PH范围3-14。浓度大，分离范围小，颗粒强度大。19三、聚丙烯酰胺凝胶

是一种全化学合成的人工凝胶。聚丙烯酰胺的商品名为Bio-gelP。它是以甲撑双丙烯酰胺(双体)作交联剂、以过硫酸铵作催化剂，在四甲基乙二胺(TEMED)加速剂的作用下，将丙烯胺(单体)聚合而成的。当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。商品聚丙烯酰胺凝胶型号有Bio-gelP-2到P-300，其阿拉伯数字相当于排阻限度的10-3。三、聚丙烯酰胺凝胶是一种全化学合成的人工20聚丙烯酰胺凝胶的结构单体丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝胶的结构单体丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺21

聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过调整交联度（一般1%-25%）以及凝胶总浓度（5%-25%）来控制。

以（T）代表100mL凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数，称为凝胶浓度。

交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为交联度，以（C）表示。总浓度或交联度增加，孔径减少。

聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过调整交联度（一般1%22

一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并以干凝胶形式出售，使用的必须溶胀。

稳定性：该凝胶不溶于水和普通有机溶剂，能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；在PH1-10或短时间超过此pH范围的溶液中较稳定，要避免长期与强酸和强碱接触，如果与其接触并在高温条件下，酚胺基将迅速发生分解。

物理化学性质一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并以干凝胶形式23

吸附性：聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，如使用离子强度略高的洗脱液操作，此弊病可以克服。不为微生物利用，易保存。吸附性：聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的、酸性和碱性的化合24四、Sephacryl

Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联制成的，此凝胶属硬性凝胶，它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。

Sephacryl吸水时，其珠状颗粒直径为25-75um，通常是用于水相系统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。四、Sephacryl

Sephacry25

化学性质稳定：

它在所有的溶剂中不溶解，化学降解也很少；它可在pH2—11范围内使用，当pH低时，葡聚糖链发生少许水解作用；在0.2mol/LNaOH溶液中(室温)处理100h，对其低流速和多孔性没有明显影响;用去污剂(如SDS)、6mo1／L盐酸胍和8mol/L尿素溶液可作为洗脱剂，高温(120℃)消毒(pH7.0时)处理后，层析性质没有明显变化。

化学性质稳定：26

Sephacryl能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖，甚至大的病毒颗粒（直径＞300－400nm）也可用它分离。Sephacryl能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖27五、Superdex

Superdex是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成的。该凝胶具有良好的分子筛特性和物理、化学稳定性。在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度可在pH3-12范围内变化，溶液中加入去污剂(如1％SDS)和(或)解离剂(如8mol/L尿素、6mol／L盐酸胍)时，也不会影响分离效果。此凝胶共有6种类型。(见书)缺点：对蛋白质有吸附能力。五、SuperdexSuperdex是由28第二节基本原理

当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。第二节基本原理当含有各种组分的样品流291、分子大小不同混合物上柱；2、洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3、大小分子分开；4、大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。

1、分子大小不同混合物上柱；2、洗脱开始，小分子扩散进30

凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而不能排阻某些小分子化合物。任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围均在0－100％之间，其被排阻的程度可以用分配系数Kav(分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示。凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、31

Kav的大小依赖于凝胶床的总体积(Vt)、外水体积(V0)(outervolume)以及分离物本身的洗脱体积(Ve)(elutionvolume)：=

Kav的大小依赖于凝胶床的总体积(Vt)32

在限定的层析条件下，Vt、和V0都为恒定值，而Ve值却是随着分离物分子质量的变化而变化的。分离物分子质量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。

因此，在同一凝胶过滤柱上分离分子质量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续注入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续发生，其最终结果是分子质量大的物质先从柱中流出，分子质量小的物质则后从柱中流出。柱出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子质量不同的物质相互筛分开了。在限定的层析条件下，Vt、和V0都为恒定33

其筛分效果受操作条件(如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等)的影响是显而易见的，但更为直接的影响是Kav值的差异性。Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小、乃至等于1或等于零(即使样品中各组分的分子质量相差很大)，则分离效果很差，或根在不能分开。

Kav值既是判断分离效果的参数，又是测定蛋白质分子质量的重要依据。从公式可以看出，只要测出床体积Vt，和外水体积Vo以及洗脱体积Ve即可计算出Kav值。其筛分效果受操作条件(如基质的颗粒大小34

凝胶床总体积Vt可用两种方法：计算法：即根据层析柱体积计算总体积，可用下列公式：Vt=πR2h在用此公式计算凝胶床总体积时，须精确地分段测量，以防内径不匀造成误差。另外还须注意到，在层析过程中，尤其是软胶操作压力要小，以防凝胶床的高度降低。凝胶床总体积Vt可用两种方法：35

测量法：由凝胶床的组成可知，床体积Vt等于外水体积V0、内水体积Vi与凝胶颗粒实际占有体积Vg之和。即：

Vt=Vo+Vi+Vg因Vg和Vt相比很小，可忽略不计，故：Vt=V0+Vi。

测量法：36当把分子质量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，其在内水体积和外水体积中的分布是不一样的。溶液中的分子大于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中，凝胶床的洗脱体积Ve认刚好等于外水体积V0。即Ve＝V0（Kav＝0）然而，溶液中的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内，凝胶床的洗脱体积应等于凝胶床总体积，即Ve=Vt=V0+Vi（Kav＝1）。而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限者，则有一部分能进入凝胶网孔，故其洗脱体积Ve是在V0和Vt之间。当把分子质量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，其在37不同型号葡聚糖凝胶柱床参数

型号VtV0ViG-1020.81G-1531.11.5G-25522.5G-501045G-751357G-10017610G-20030920不同型号葡聚糖凝胶柱床参数

型号VtV0ViG-1020.838第三节操作

一、凝胶的选择和处理1．凝胶的选择

选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。

第三节操作

一、凝胶的选择和处理39（1）型号：不同凝胶筛分范围各不相相同Sephadex的分离范围，常用于测定高聚糖或球蛋白。SephadexG型一般适宜于分离蛋白质。如果用于分离核酸时，则限于其空间结构和所带基团的影响。选用高于它们分子质量范围的型号，或者选用适当型号的生物胶和sephacy1。各种型号凝胶的规格和性质不同。

在除去蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶SephadexG-25。当溶液通过G-25柱时．蛋白质被排阻住凝胶外面先流出来，而盐类则扩散到凝胶网孔里后流出来，这样就便蛋白质得到纯化，一般来说，在规定的筛分范围内，混合物之间分子质量差别越大，分离的效果越好。（1）型号：40

（2）粒度：

凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱之间空间小，装柱易均一，流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。由于细颗粒凝胶流速慢，故宜用大直径的层析柱，这类凝胶用于小型试验，可得到满意结果。而粗颗粒凝胶流速快．宜用于小直径的层析柱，如操作得当也可得到较满意的结果。（2）粒度：41

凝胶粒度与洗脱效果的关系图

凝胶粒度与洗脱效果的关系图42

在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μm左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μm左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μm43

对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加以讨论。对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式441．类分离

目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0，小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。1．类分离目的是分开样品中分子量悬殊的“45

例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用SephadexG-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是1000～5000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用SephadexG-15凝胶。例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知462．分级分离

目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1／3。2．分级分离目的是分开分子量不很悬殊的47

因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。如用SephadexG-200分离血清蛋白质的效果要比SephadexG-150为好。但也有人选用G-150，那是因为G-200强度太低不便操作的缘故（见下图）。因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗48不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图49

2．凝胶用量的计算

根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，按下面的公式可计算出所需干凝胶的用量：干凝胶用量(g)＝πr2h/（床体积/g）用此法计算出的干凝胶用量还需增加10％—20％，因为凝胶在处理过程中会有一部分损失掉。

2．凝胶用量的计算503．凝胶的处理干凝胶加入5、10倍的蒸馏水

充分浸泡

去小颗粒

用0.5mol/LNaoH—0.5mol/LNaCl溶液浸泡0.5h

去碱液

蒸馏水洗至中性。

抽气

除去凝胶中的气泡的方法加热煮沸注意点:避免置于酸或碱溶液中加热。3．凝胶的处理51

二、凝胶柱的制备

1．柱的选择

同样直径的层析柱长层析柱比短的分辨率高；同样长度的层析柱直径大的比小的分辨率高；同样体积的层析柱层析柱长的比短的分辨率高。理想的层析柱直径与长度之比是1：25-1：100。层析柱最好有夹央套，这样温度可以控制，得到的结果容易重复。二、凝胶柱的制备52

一般选用细长的柱作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm就足够了。一般选用细长的柱作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高53

2．装柱

2．装柱541）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致，装柱过程中温度也要恒定。2）应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。3）将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直。4）先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要排除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15％。1）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致，装柱过程中温度55

5）柱顶接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注入柱内。注意避免产生气泡。6）柱装好后，停10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。7）柱内胶面上部保留2～3cm洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍住体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来。8）调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。检查流体静压力，不要超过规定数值。如果使用蠕动泵，注意使流速不超过稳定后利用重力调节所达到的流速，一般要低于后者10％。5）柱顶接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注入柱内。注意避免产56

三、加样与洗脱1．加样

加样量与测定方法和层析柱大小有关。如测定样品含量的方法灵敏或床体积小时，加样量可少，否则反之。一般来说，加样量越少，或加样体积越小(样品浓度高时)，分辨率越高。但是，当用于样品的制备和脱盐时、加样量应在不影响分辨率的前提下增大。究竟加样体积多少为宜?这要视被分离物在层析柱的分配系数(Kav)或洗脱体积(Ve)来决定。假设，A、B两个被分离物在层析柱中的洗脱体积分别为Vea、Veb，A、B洗脱体积之差称为分离体积，以Vs表示。则

Vs=Vea—Veb三、加样与洗脱573．凝胶柱的鉴定

新装的吸附柱用适当的缓冲液平衡后，将带色的蓝色葡聚糖-2000、或者红色葡聚糖、细胞色素C、血红蛋白等物质配成2mg/ml的溶液过柱，观察色带是否均匀下降，如均匀下降，则表明柱中凝胶是均匀的，或者说柱中没裂缝和气泡，是可以使用的，否则就须重新装柱。3．凝胶柱的鉴定58

由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应尽可能大才好，但样品浓度过大往往导致粘度增大，而使层析分辨率下降（下图）。一般要求样品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），这样才不致于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以不大于4％为宜。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱。由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应尽可能大才59样品黏度对洗脱曲线的影响（1）加葡萄糖2000，使终浓度为5%，相对粘度11.8;（2）加葡萄糖2000，使终浓度为2.5%，相对粘度4.2;（3）加葡萄糖2000，使终浓度为1%.样品黏度对洗脱曲线的影响（1）加葡萄糖2000，使终浓度为560

2．洗脱

所有的洗脱液均以能溶解被洗脱物质和不使其变性或失活为原则。除个别特殊情况外，一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、Tis-HCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液，有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。洗脱时的流速要严格控制，否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定，理想的分配系数就难以测出。控制流速的最好装置是恒流泵(微量泵)，它不仅可以使流速恒定，而且还可以使其在较大范围内选择。另一种是恒压重力洗脱。凝胶过滤层析的洗脱流速与操作压、层析柱体积以及基质的性质是有密切关系的。2．洗脱61流速对洗脱曲线的影响

流速对洗脱曲线的影响62

对强度较大的凝胶，如SephadexG-10～50，在相当大的柱压范围内流速（Ⅴ）与操作压（F）成正比，与柱长（L）成反比：Ⅴ=KΔP／L

而对于强度差的凝胶，符合以上公式压力范围很小。进一步加大压力时，由于凝胶颗粒变形流速反而降低。

对强度较大的凝胶，如Sepha63各种层析柱装置的操作压（或静水压）（a），（b）操作压等于柱或贮液器内液面和出水接管末端的高度差；（c），（d）压力的大小是由恒压瓶内空气入口管的底部至出口接管末端的高度计算。向下（c）或向上（d）移动出水管无关紧要各种层析柱装置的操作压（或静水压）64

四、凝胶柱的再生及保存1、再生仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后即可再次使用；但使用过多次后，由于凝胶床体积变小、流动速度降低或污染杂质过多等原因，致使其正常性能受到影响。在此情况下，如欲重复使用，就须进行再生处理。方法是：先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行平衡，平衡毕，即可重复使用；另一种方法是，把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理后重新装柱即可再行使用。四、凝胶柱的再生及保存65保存方法：

湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收缩，再抽干乙醇，用60-80℃的暖风吹干，在室温下保存。半缩法：是过度法，用60%-70%的乙醇使凝胶部分脱水，然后封口，4℃保存。保存方法：湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水66第六章凝胶过滤课件67第四节应用一、脱盐和浓缩二、分离生命物质三、去热源物质四、测定分子质量五、其他第四节应用一、脱盐和浓缩681、脱盐高分子溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。优点：

操作简便、快速、蛋白质和酶类等不易变性适用的凝胶：

SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、61、脱盐高分子溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这69

用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡上样用同样缓冲液洗脱收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类蛋白质不会因为脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上

用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡上样用同样缓冲液洗脱702、分离提纯凝胶过滤的载体可以根据它们的孔径分为很多种不同的规格。每种规格都有其特定的分级的范围，一旦超出分组范围，不论是其上限还是下限，即使分子量有大有小，但载体的排阻情况基本相同，就不能分离。在凝胶过滤层析时，要根据所要纯化的样品的分子量选择所用的凝胶过滤的基质。

2、分离提纯凝胶过滤的载体可以根据它们的孔径分为很多种不同的71天花粉毒蛋白的凝胶过滤分离交联葡聚糖凝胶G-50柱(1.8cm×100cm)用50mmol/LTris-HCl,pH7.8缓冲液平衡天花粉硫酸铵糊(90％饱和度的沉淀)溶于2m1平衡缓冲液中上样洗脱天花粉毒蛋白除去不溶物↓↘↘↓天花粉毒蛋白的凝胶过滤分离交联葡聚糖凝胶G-50柱(1.8c72

733、测定高分子物质的分子量测大于所用载体上限分子的洗脱体积测小于下限的分子的洗脱体积标定凝胶过滤柱的Vo标定凝胶过滤柱的Vi测定一系列已知分子量的标淮样品在柱上的洗脱体积Ve以(Ve-Vi)／(Vo-Vi)和1ogMw作图测得了待测分子量的样品的Ve由(Ve-Vi)／(Vo-Vi)从标准曲线上可以求得未知样品的分子量蓝色葡聚糖氨基酸、有色盐类↓↓↓↓↓↘↙以标准样品的分子量的1ogMw对Ve作图or3、测定高分子物质的分子量测大于所用载体上限分子的洗脱体积测74分子量的测定方法有两种

（1）求解法为了求得上述方程中的两个常数K和C,先以两个已知分子量的蛋白质过柱。设其分子量分别为M1、M2，洗脱体积分别为Vl、V2，解方程组：

Ve1=C-KLogM1

Ve2=C-KLogM2

求得C和K以后，将任何一个待测物质的Ve值代入方程便可计算得出其分子量。分子量的测定方法有两种（1）求解法为了求得上述方程中的75

（2）标准曲线法对于特定的测定系统，先以3个以上（最好更多些）的已知分子的标准蛋白（目前已有配套标准蛋白系列产品出售）过柱，测取各自的Ve值。以Ve作纵坐标，LogM作横坐标制做标准曲线。在同一测定系统中测出未知物质的Ve值便可由标标准曲线求得分子量。分子量在10000～150000之间的球形蛋白用此法测出的分子量误差在10％左右。对于线性分子的误差还可大于此值。

如果以Ve／Vo对分子量对数作图，同样也可以得到一个线性关系的标准曲线。Ve／Vo与柱子大小无关，也不受吸附效应的影响，因此测定效果较好。蛋白质、酶、激素、多肽、多核苷酸、多糖类高分子量生化产品都可以用凝胶过滤法测定分子量。（2）标准曲线法对于特定的测定系统，先以3个以上（最好76第六章凝胶过滤课件774、高分子溶液的浓缩将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外离心或过滤，去除溶胀的凝胶浓缩的高分子溶液↓4、高分子溶液的浓缩将SephadexG-25或50干胶投入785、蛋白质复性研究变性蛋白加入凝胶柱高浓度变性剂存在，蛋白呈无规则卷曲变性蛋白体积大，只能进入颗粒间隙，迁移速度快变性剂分子量小，进入颗粒内部，迁移速度慢缓冲液洗脱蛋白变性剂浓度降低，转成复性缓冲液变性蛋白复性，以天然形态洗脱出柱↓↓↓↓↓↓5、蛋白质复性研究变性蛋白加入凝胶柱高浓度变性剂存在，蛋白呈79凝胶过滤层析经常遇见的问题

1．流速慢（1）有气泡、出水管阻塞（2）没打开夹子（3）柱压太紧（操作压过大、长期使用、接头漏气）

2．柱内产生气泡

（1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流（2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧凝胶过滤层析经常遇见的问题1．流速慢80

3．条带扭曲

（1）胶面不平（2）样品或洗脱液中有颗粒（3）装柱不均匀4．分辩率不高

（1）装柱不均匀（2）样品量过大（3）流速太快（4）柱不垂直或柱不合适（5）长菌（6）柱下口软管太长（7）胶不适当3．条带扭曲81第六章凝胶过滤第六章凝胶过滤82

凝胶过滤又称凝胶扩散色谱、排阻色谱、限制扩散色谱、分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。凝胶过滤又称凝胶扩散色谱、排阻色谱、限83特点操作简便、设备简单分离效果好，重复性高分离条件缓和应用广泛分辨率不高，分离操作慢特点操作简便、设备简单84第一节凝胶的分类及性质

凝胶：是不溶于水但在水中有较大膨胀度和较好分子筛功能的一类化合物。

主要有葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖。其次，还有聚丙烯酰胺凝胶(生物胶)、交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶，以及交联琼脂糖与葡聚糖共价结合的凝胶等。第一节凝胶的分类及性质凝胶：是不溶于水85一、葡聚糖凝胶

是应用最广的一类凝胶，葡聚糖凝胶的商品名称为sephadex，它是由葡聚糖和3—氯—1，2环氧丙烷(交联剂)在碱性条件下，以透平油作为分散介质，在40℃以醚键相互交联，然后进行酒精脱水，烘干、过筛而成的。一、葡聚糖凝胶是应用最广的一类凝胶，葡聚糖凝86第六章凝胶过滤课件871．理化性质

葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒，在显微镜下放大700倍以上，可见其表面的网状皱纹，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。

1．理化性质88

交联度：交联剂在葡聚糖凝胶中占的百分数。吸水量：每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量。但不包括颗粒间所带的水量膨胀度：每g干胶在水或其他规定的溶剂中，在一定时间与温度条件下膨胀后所占有的体积毫升数。S=V/W

交联度：交联剂在葡聚糖凝胶中占的百分数。89交联度

吸水量

膨胀度

分离对象的大小编号交联度吸液量膨胀速度凝胶网孔分离限凝胶强度大小小大大小慢快大小大小小大交联度90

型号、颗粒大小、分离范围、吸水量、膨胀度、溶胀时间。G后面的编号为膨胀度的10倍。如：sephadexG-25表示每克干胶吸水量为2.5ml。除了在水中溶涨外，葡聚糖凝胶还可在乙醇、甲酰胺、二甲亚砜中溶涨。sephadexG-25在水中只需溶涨3小时，sephadexG-100需要3天才能饱和。商品葡聚糖凝胶的规格型号、颗粒大小、分离范围、吸水量、膨胀度、溶胀时91

2．稳定性

葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。

在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消毒0.5h，其性质并不改变。在0.1mol/LHCl溶液中浸泡1-2h，甚至在0.02mol／LHCl溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。

但是，当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。

2．稳定性92

3．吸附性

葡聚糖凝胶系弱酸性物质、这是由于其每克干胶含10－20ug当量的羧基基团所致。该基团能与分离物中电荷基团(尤其是碱性蛋白质)发生吸附作用。当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。因此进行葡聚糖凝胶层析时，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。

3．吸附性93

新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子质量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响。新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，虽94

二、琼脂糖凝胶

琼脂糖是从琼脂中提纯的，主要由D半乳糖和3,6脱水L半乳糖连接而成的一种线性多糖。

琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。

琼脂糖凝胶的孔径由制胶时琼脂糖的浓度决定，低浓度琼脂糖形成的孔径较大，而高浓度琼脂糖形成的孔径较小。

二、琼脂糖凝胶95

尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可被羧基、甲氧基、硫酸根等取代，因而使琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，样品与凝胶间的相互静电作用产生吸附，从而影响分离效果。但是明显低于葡聚糖。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可被羧96

这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度到45℃以下时，它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。该物质对尿素和盐酸等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在pH4.0—9.0的缓冲液中是稳定的、琼脂糖凝胶置室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝胶。

这种多糖链在100℃左右时呈液态97

琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好，分离范围大。用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。

最好使用条件控制在pH4～9之间，温度0～40℃，超出此范围,可能被破坏。琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶98琼脂糖凝胶规格国产的产品有3种规格：Sepharose2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度为2%、4%、6%。

美国的为Bio－GA，有6个型号:即Bio-G0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。

琼脂糖凝胶规格国产的产品有3种规格：美国的为Bi99浓度大，分离范围小，颗粒强度大。CL交联琼脂糖：

Sepharose与1，3-二溴异丙醇在强碱条件下生成的。比琼脂糖的稳定性提高，PH范围3-14。浓度大，分离范围小，颗粒强度大。100三、聚丙烯酰胺凝胶

是一种全化学合成的人工凝胶。聚丙烯酰胺的商品名为Bio-gelP。它是以甲撑双丙烯酰胺(双体)作交联剂、以过硫酸铵作催化剂，在四甲基乙二胺(TEMED)加速剂的作用下，将丙烯胺(单体)聚合而成的。当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。商品聚丙烯酰胺凝胶型号有Bio-gelP-2到P-300，其阿拉伯数字相当于排阻限度的10-3。三、聚丙烯酰胺凝胶是一种全化学合成的人工101聚丙烯酰胺凝胶的结构单体丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝胶的结构单体丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺102

聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过调整交联度（一般1%-25%）以及凝胶总浓度（5%-25%）来控制。

以（T）代表100mL凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数，称为凝胶浓度。

交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为交联度，以（C）表示。总浓度或交联度增加，孔径减少。

聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过调整交联度（一般1%103

一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并以干凝胶形式出售，使用的必须溶胀。

稳定性：该凝胶不溶于水和普通有机溶剂，能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；在PH1-10或短时间超过此pH范围的溶液中较稳定，要避免长期与强酸和强碱接触，如果与其接触并在高温条件下，酚胺基将迅速发生分解。

物理化学性质一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并以干凝胶形式104

吸附性：聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，如使用离子强度略高的洗脱液操作，此弊病可以克服。不为微生物利用，易保存。吸附性：聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的、酸性和碱性的化合105四、Sephacryl

Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联制成的，此凝胶属硬性凝胶，它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。

Sephacryl吸水时，其珠状颗粒直径为25-75um，通常是用于水相系统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。四、Sephacryl

Sephacry106

化学性质稳定：

它在所有的溶剂中不溶解，化学降解也很少；它可在pH2—11范围内使用，当pH低时，葡聚糖链发生少许水解作用；在0.2mol/LNaOH溶液中(室温)处理100h，对其低流速和多孔性没有明显影响;用去污剂(如SDS)、6mo1／L盐酸胍和8mol/L尿素溶液可作为洗脱剂，高温(120℃)消毒(pH7.0时)处理后，层析性质没有明显变化。

化学性质稳定：107

Sephacryl能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖，甚至大的病毒颗粒（直径＞300－400nm）也可用它分离。Sephacryl能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖108五、Superdex

Superdex是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成的。该凝胶具有良好的分子筛特性和物理、化学稳定性。在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度可在pH3-12范围内变化，溶液中加入去污剂(如1％SDS)和(或)解离剂(如8mol/L尿素、6mol／L盐酸胍)时，也不会影响分离效果。此凝胶共有6种类型。(见书)缺点：对蛋白质有吸附能力。五、SuperdexSuperdex是由109第二节基本原理

当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。第二节基本原理当含有各种组分的样品流1101、分子大小不同混合物上柱；2、洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3、大小分子分开；4、大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。

1、分子大小不同混合物上柱；2、洗脱开始，小分子扩散进111

凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而不能排阻某些小分子化合物。任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围均在0－100％之间，其被排阻的程度可以用分配系数Kav(分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示。凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、112

Kav的大小依赖于凝胶床的总体积(Vt)、外水体积(V0)(outervolume)以及分离物本身的洗脱体积(Ve)(elutionvolume)：=

Kav的大小依赖于凝胶床的总体积(Vt)113

在限定的层析条件下，Vt、和V0都为恒定值，而Ve值却是随着分离物分子质量的变化而变化的。分离物分子质量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。

因此，在同一凝胶过滤柱上分离分子质量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续注入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续发生，其最终结果是分子质量大的物质先从柱中流出，分子质量小的物质则后从柱中流出。柱出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子质量不同的物质相互筛分开了。在限定的层析条件下，Vt、和V0都为恒定114

其筛分效果受操作条件(如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等)的影响是显而易见的，但更为直接的影响是Kav值的差异性。Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小、乃至等于1或等于零(即使样品中各组分的分子质量相差很大)，则分离效果很差，或根在不能分开。

Kav值既是判断分离效果的参数，又是测定蛋白质分子质量的重要依据。从公式可以看出，只要测出床体积Vt，和外水体积Vo以及洗脱体积Ve即可计算出Kav值。其筛分效果受操作条件(如基质的颗粒大小115

凝胶床总体积Vt可用两种方法：计算法：即根据层析柱体积计算总体积，可用下列公式：Vt=πR2h在用此公式计算凝胶床总体积时，须精确地分段测量，以防内径不匀造成误差。另外还须注意到，在层析过程中，尤其是软胶操作压力要小，以防凝胶床的高度降低。凝胶床总体积Vt可用两种方法：116

测量法：由凝胶床的组成可知，床体积Vt等于外水体积V0、内水体积Vi与凝胶颗粒实际占有体积Vg之和。即：

Vt=Vo+Vi+Vg因Vg和Vt相比很小，可忽略不计，故：Vt=V0+Vi。

测量法：117当把分子质量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，其在内水体积和外水体积中的分布是不一样的。溶液中的分子大于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中，凝胶床的洗脱体积Ve认刚好等于外水体积V0。即Ve＝V0（Kav＝0）然而，溶液中的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内，凝胶床的洗脱体积应等于凝胶床总体积，即Ve=Vt=V0+Vi（Kav＝1）。而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限者，则有一部分能进入凝胶网孔，故其洗脱体积Ve是在V0和Vt之间。当把分子质量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，其在118不同型号葡聚糖凝胶柱床参数

型号VtV0ViG-1020.81G-1531.11.5G-25522.5G-501045G-751357G-10017610G-20030920不同型号葡聚糖凝胶柱床参数

型号VtV0ViG-1020.8119第三节操作

一、凝胶的选择和处理1．凝胶的选择

选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。

第三节操作

一、凝胶的选择和处理120（1）型号：不同凝胶筛分范围各不相相同Sephadex的分离范围，常用于测定高聚糖或球蛋白。SephadexG型一般适宜于分离蛋白质。如果用于分离核酸时，则限于其空间结构和所带基团的影响。选用高于它们分子质量范围的型号，或者选用适当型号的生物胶和sephacy1。各种型号凝胶的规格和性质不同。

在除去蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶SephadexG-25。当溶液通过G-25柱时．蛋白质被排阻住凝胶外面先流出来，而盐类则扩散到凝胶网孔里后流出来，这样就便蛋白质得到纯化，一般来说，在规定的筛分范围内，混合物之间分子质量差别越大，分离的效果越好。（1）型号：121

（2）粒度：

凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱之间空间小，装柱易均一，流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。由于细颗粒凝胶流速慢，故宜用大直径的层析柱，这类凝胶用于小型试验，可得到满意结果。而粗颗粒凝胶流速快．宜用于小直径的层析柱，如操作得当也可得到较满意的结果。（2）粒度：122

凝胶粒度与洗脱效果的关系图

凝胶粒度与洗脱效果的关系图123

在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μm左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μm左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μm124

对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加以讨论。对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式1251．类分离

目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0，小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。1．类分离目的是分开样品中分子量悬殊的“126

例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用SephadexG-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是1000～5000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用SephadexG-15凝胶。例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知1272．分级分离

目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1／3。2．分级分离目的是分开分子量不很悬殊的128

因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。如用SephadexG-200分离血清蛋白质的效果要比SephadexG-150为好。但也有人选用G-150，那是因为G-200强度太低不便操作的缘故（见下图）。因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗129不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图130

2．凝胶用量的计算

根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，按下面的公式可计算出所需干凝胶的用量：干凝胶用量(g)＝πr2h/（床体积/g）用此法计算出的干凝胶用量还需增加10％—20％，因为凝胶在处理过程中会有一部分损失掉。

2．凝胶用量的计算1313．凝胶的处理干凝胶加入5、10倍的蒸馏水

充分浸泡

去小颗粒

用0.5mol/LNaoH—0.5mol/LNaCl溶液浸泡0.5h

去碱液

蒸馏水洗至中性。

抽气

除去凝胶中的气泡的方法加热煮沸注意点:避免置于酸或碱溶液中加热。3．凝胶的处理132

二、凝胶柱的制备

1．柱的选择

同样直径的层析柱长层析柱比短的分辨率高；同样长度的层析柱直径大的比小的分辨率高；同样体积的层析柱层析柱长的比短的分辨率高。理想的层析柱直径与长度之比是1：25-1：100。层析柱最好有夹央套，这样温度可以控制，得到的结果容易重复。二、凝胶柱的制备133

一般选用细长的柱作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm就足够了。一般选用细长的柱作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高134

2．装柱

2．装柱1351）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致，装柱过程中温度也要恒定。2）应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。3）将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直。4）先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要排除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15％。1）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致，装柱过程中温度136

5）柱顶接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注入柱内。注意避免产生气泡。6）柱装好后，停10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。7）柱内胶面上部保留2～3cm洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍住体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来。8）调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。检查流体静压力，不要超过规定数值。如果使用蠕动泵，注意使流速不超过稳定后利用重力调节所达到的流速，一般要低于后者10％。5）柱顶接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注入柱内。注意避免产137

三、加样与洗脱1．加样

加样量与测定方法和层析柱大小有关。如测定样品含量的方法灵敏或床体积小时，加样量可少，否则反之。一般来说，加样量越少，或加样体积越小(样品浓度高时)，分辨率越高。但是，当用于样品的制备和脱盐时、加样量应在不影响分辨率的前提下增大。究竟加样体积多少为宜?这要视被分离物在层析柱的分配系数(Kav)或洗脱体积(Ve)来决定。假设，A、B两个被分离物在层析柱中的洗脱体积分别为Vea、Veb，A、B洗脱体积之差称为分离体积，以Vs表示。则

Vs=Vea—Veb三、加样与洗脱1383．凝胶柱的鉴定

新装的吸附柱用适当的缓冲液平衡后，将带色的蓝色葡聚糖-2000、或者红色葡聚糖、细胞色素C、血红蛋白等物质配成2mg/ml的溶液过柱，观察色带是否均匀下降，如均匀下降，则表明柱中凝胶是均匀的，或者说柱中没裂缝和气泡，是可以使用的，否则就须重新装柱。3．凝胶柱的鉴定139

由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应尽可能大才好，但样品浓度过大往往导致粘度增大，而使层析分辨率下降（下图）。一般要求样品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），这样才不致于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以不大于4％为宜。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱。由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应尽可能大才140样品黏度对洗脱曲线的影响（1）加葡萄糖2000，使终浓度为5%，相对粘度11.8;（2）加葡萄糖2000，使终浓度为2.5%，相对粘度4.2;（3）加葡萄糖2000，使终浓度为1%.样品黏度对洗脱曲线的影响（1）加葡萄糖2000，使终浓度为5141

2．洗脱

所有的洗脱液均以能溶解被洗脱物质和不使其变性或失活为原则。除个别特殊情况外，一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、Tis-HCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液，有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。洗脱时的流速要严格控制，否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定，理想的分配系数就难以测出。控制流速的最好装置是恒流泵(微量泵)，它不仅可以使流速恒定，而且还可以使其在较大范围内选择。另一种是恒压重力洗脱。凝胶过滤层析的洗脱流速与操作压、层析柱体积以及基质的性质是有密切关系的。2．洗脱142流速对洗脱曲线的影响

流速对洗脱曲线的影响143

对强度较大的凝胶，如SephadexG-10～50，在相当大的柱压范围内流速（Ⅴ）与操作压（F）成正比，与柱长（L）成反比：Ⅴ=KΔP／L

而对于强度差的凝胶，符合以上公式压力范围很小。进一步加大压力时，由于凝胶颗粒变形流速反而降低。

对强度较大的凝胶，如Sepha144各种层析柱装置的操作压（或静水压）