基因工程-第6章-基因文库的构建与目的基因的获得课件

第六章基因文库的构建与目的基因的获得第六章基因文库的构建与目的基因的获得1基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定2

目前主要应用化学合成法、目的基因的直接分离法和逆转录法来分离、获得目的基因。PCR技术的问世及其在基因工程中广泛应用，已经大大简化了构建和筛选cDNA文库的工作。此外，新发展起来的转座子标签法（transposontagging）、mRNA差异显示法（mRNAdifferentialdisply）、RFLP及ESTs等技术也已经在分子克隆工作中展现出广阔的前景。目前主要应用化学合成法、目的基因的直接分离法和逆转录法来分36.1基因文库的构建基因组文库（genomicDNAlibrary）是指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶切后（必要时对这些DNA片段进行密度梯度离心或经制备型凝胶电泳进行分级分离，以选择长度适合于插入载体的片段）所产生的基因组片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。6.1基因文库的构建41975年，Clarke和Carbon提出了计算文库中任一DNA序列重组子数目的公式，即N=ln(1-P)/ln(1-f)N为所需要的重组体的数目，P为选出某一基因的期望概率（通常期望为99%），f为单个重组体中的平均插入片段与基因组DNA总量之比。1975年，Clarke和Carbon提出了计算文库中任一D5例如要在一哺乳动物基因组（3×109bp）的17kb片段的文库中，使含有一给定DNA序列达99%的概率，则需N=ln(1-0.99)/ln[1-(1.7×104bp/3×109bp)]=8.1×105即所建的文库至少含有8.1×105以上的重组体，才能代表整个的基因组。

例如要在一哺乳动物基因组（3×109bp）的17kb片段的文6基因组DNA文库有着非常广泛的用途。如用以分析、分离特定的基因片段；通过染色体步行（chromasomewalking）研究基因的组织结构；用于基因表达调空研究；用于人类及动、植物基因组工程的研究等等。基因组文库的构建一般包括下列基本步骤：（1）细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备；（2）载体DNA的制备；（3）载体与外源大片段的连接；（4）体外包装及基因组DNA文库的扩增；（5）重组DNA的筛选和鉴定。基因组DNA文库有着非常广泛的用途。如用以分析、分离特定的基7基因工程-第6章-基因文库的构建与目的基因的获得课件86.2cDNA的合成和克隆6.2.1cDNA文库（cDNAlibrary）的构建和基因的分离cDNA的克隆对于特定基因的分离和特性研究是极有价值的工具。cDNA文库最关键的特征是它包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列，这样使得cDNA文库的复杂性要比基因组文库要低得多。由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各自的mRNA的种类就不同，由此而产生独特的cDNA文库。6.2cDNA的合成和克隆9

构建cDNA文库通常包括：（1）mRNA的提取及其完整性的确定；（2）cDNA的合成和克隆；（3）目的cDNA的鉴定等步骤。(1)总RNA的提取(2)mRNA的分离(3)mRNA的纯化(4)cDNA第一条链的合成:①随机引物法；②oligo-dT(12-18)引物法(5)cDNA第二条链的合成(6)cDNA的甲基化和接头的加入(7)cDNA同载体的连接(8)噬菌体蛋白的体外包装（9）噬菌斑原位杂交分离基因构建cDNA文库通常包括：（1）mRNA的提取及其完整性的10基因工程-第6章-基因文库的构建与目的基因的获得课件11基因工程-第6章-基因文库的构建与目的基因的获得课件12总RNA的提取凡与RNA操作有关的玻璃器皿经常规洗净后，用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）浸泡处理（37℃，2小时），再用灭菌双蒸水漂洗几次。高压消毒去除DEPC，然后250℃烘烤4小时以上或180℃8小时以上。塑料器材最好使用灭菌的一次性使用的塑料用品，Eppendorf管、微量加样吸头最好是新的，使用前进行高压灭菌。所有溶液应加DEPC至终浓度0.05%-0.1%，室温处理过夜，然后高压处理。DEPC易与Tris反应，配制Tris溶液的水应先用0.1%DEPC处理，高压消毒，配好后再高压消毒。总RNA的提取131异硫氰酸胍----热苯酚法1）将实验用的全部用品用0.1%的DEPC水浸泡过夜，然后高压灭菌，玻璃器皿在180℃烘烤8h以上，塑料制品80℃烘干。2）将0.1g组织样品在研钵中迅速研成粉末，放入装有1mlGITC试剂的匀浆管中匀浆。匀浆液取出放在1.5ml离心管中，吸打几次以剪切染色质DNA，60℃温浴10min。3）加入等体积60℃苯酚，混匀，抽提。4）冰中冷却，10000rpm离心10min。取上清，用热苯酚重复抽提一次。1异硫氰酸胍----热苯酚法145）等体积氯仿在室温下抽提1-2次后，上清加1/10体积3M乙酸钠和3倍体积无水乙醇，在－20℃沉淀过夜。6）12000rpm离心15min，沉淀溶于0.5mlSTE中，加蛋白酶K至200μg/ml，56℃消化1h。等体积热苯酚：氯仿抽提，冷却离心，重复一次。7）上清加2.5倍体积无水乙醇沉淀过液。离心，70%乙醇洗沉淀，干燥后，溶于适量DEPC水中。5）等体积氯仿在室温下抽提1-2次后，上清加1/10体积3M152用TRIZOL试剂盒提取总RNA1)匀浆在1ml的TRIZOL试剂中加50-100mg组织，样本体积不应超过TRIZOL的10%。用匀浆机高速匀浆2分钟。2)（可选）要分离蛋白、脂肪、多糖或细胞外物质如肌肉、脂肪组织，在匀浆后2-8℃12000g离心10分钟。将上清匀转移至一新的Eppendof管。3)分相15-30℃温育5分钟，完全解离核蛋白复合体。加0.2ml氯仿，用力摇动15秒，15-30℃放置2-3分钟。小于12000g2-8℃离心15分钟。2用TRIZOL试剂盒提取总RNA164)RNA的沉淀转移水相于一新管。加0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10分钟。4-8℃12000g离心10分钟（离心前RNA通常不可见，在管壁或管底形成胶样沉淀）。5）RNA沉淀的洗涤弃上清，每1mlTRIZOL至少加1ml75%的乙醇洗涤RNA一次。2-8℃小于7500g离心5分钟。6）RNA的重溶倒掉乙醇，空气中干燥或真空干燥5-10分钟。加适当的DEPC处理水，吸打几次，放于55-60℃溶解10分钟。-70℃保存。4)RNA的沉淀17RNA变性电泳方法Ⅰ在一灭菌微量离心管中混合下列液体，以制备RNA样品。

RNA9μl10×TAE4μl甲醛7μl甲酰胺20μl总体积40μl

混匀后，65℃温育15min，取出置冰上。加入RNA上样缓冲液，用1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳buffer为1×TAE。RNA变性电泳18mRNA的分离和纯化具体操作按OligotexmRNAMiniKit说明进行。500μg总RNA于1.5ml离心管中用DEPC处理过的水调至500μl。加OBB500μl和OligotexSuspension45μl,充分混匀。70℃30分钟取出反应，室温放置10分钟。12000rpm离心2分钟，沉淀。用OW2400μl重悬沉淀，然后移到一小离心柱中，12000rpm,离心１分钟。mRNA的分离和纯化19总RNA和mRNA总RNA和mRNA20将这小离心柱移入一新1.5ml离心管中，加400μlOW2，12000rpm,离心１分钟。将这小离心柱移入一新1.5ml离心管中，加20μl热（70℃）OEB到离心柱中，用枪上下吹吸３－４次，12000rpm,离心１分钟。再加2５μl热（70℃）OEB到离心柱中，用枪上下吹吸３－４次，12000rpm,离心１分钟。将这小离心柱移入一新1.5ml离心管中，加400μlOW221第一链的合成在1.5ml离心管中，按顺序加入以下试剂：10×firststrandbuffer5.0μlFirststrandMethylNucleotidemixture5.0μlLinker-primer(1.4μg/μl)2.0μlDEPCwater30.5μlRNaseBlockRibonucleaseInhibitor(40u/μl)1.0μl第一链的合成22振荡混匀，然后加入5μl（5μg）mRNA,混匀。室温放置10分钟，以便模板和引物退火。加入3.5μlMMLV-RT(20u/μl),终体积50μl，混匀，稍离心。取出5ｕL放于含有0.5ｕLα-32PdATP的离心管做对照反应。37℃温育1小时同时准备16℃水浴。将第一链反应液取出，放置在冰上振荡混匀，然后加入5μl（5μg）mRNA,混匀。23第二链的合成在冰上按顺序往第一链反应液中加入以下试剂：10×Secondstrandbuffer20.0μlSecondstranddNTPs6.0μlddH2O108.2μlα-32PdATP2μl稍混匀，离心后加入RNaseH（0.9u/μl）3.5μlDNApolymeraseI(9.0u/μl)11.1μl迅速振荡管子以混匀，稍离心后，在16℃温育2.5小时，然后取出放在冰上。注意：在操作过程中必须保证温度不超过16℃，否则会引起发夹结构的形成，影响cDNA的克隆。第二链的合成24cDNA第一链和cDNA第二链碱变性琼脂糖凝胶电泳的同位素X光片cDNA第一链和cDNA第二链碱变性琼脂糖凝胶电泳的同位素X25cDNA第一链和双链cDNA凝胶电泳cDNA第一链和双链cDNA凝胶电泳26

cDNA末端的补平在反应管中加入BlutingdNTPmix23μlpfuDNApolymerase(2.5u/μl)2.0μl混匀后，72℃温育30分钟，注意：不能超过30分钟。取出反应管，加200μl苯酚：氯仿（1：1）抽提。12000rpm室温离心2分钟，取上清，用等体积氯仿再抽提1次。取上清，加入20μl3MNaAc(PH5.2)，400μl无水乙醇，-20℃过夜沉淀。12000rpm，4℃，离心60分钟。70%乙醇洗沉淀，吸出乙醇后，干燥沉淀。将沉淀溶于9.0μl的EcoRIadapters溶液中。4℃放置至少30分钟，使cDNA完全溶解。cDNA末端的补平27EcoRIadapters的连接在含有cDNA和EcoRIadapters的管中加入10×Ligasebuffer1.0μl10mMrATP1.0μlT4DNAligase(4μg/μl)1.0μl4℃连接两天，将管放在70℃水欲中30分钟，以灭活连接酶。EcoRIadapters的连接28EcoRI末端的激活在反应管中加入10×Ligasebuffer1.0μl10mMrATP2.0μl灭菌水6.0μlT4polynucleotidekinase10μg/μl)1.0μl37℃温育30分钟。70℃温育30分钟以灭活T4polynucleotidekinase1，稍离心。EcoRI末端的激活29

XhoI消化在反映管中加入28.0μlXhoIbuffer,3.0μlXhoI,37℃消化2小时。冷却至室温，加入5.0μl10×STEbuffer。这时的cDNA可以进行片段分离了。XhoI消化30cDNA不同大小片段的分离将SepharoseCL-2B和10×STEbuffer从4℃冰箱中取出，平衡至室温。准备50ml的1×STEbuffer。将柱子固定在一个支架上，轻轻混匀SepharoseCL-2B，用1ml移液器将其加入柱子中。加入10ml1×STEbuffer平衡柱子。当在树脂液面上剩大约50μlSTE时，立即加入cDNA样。一旦样品进入SepharoseCL-2B，用移液枪将连接管加满1×STEbuffer。当染料达到柱子管壁刻度为-.4ml时开始接收cDNA，每3滴接一管。当染料达到柱子管壁刻度为.3ml时停止接收cDNA，大约接收12管。cDNA不同大小片段的分离31从每管中取8μl跑5%的非变性丙烯酰胺凝胶电泳。将非变性丙烯酰胺凝胶压片，决定哪几管用于将来与载体的连接。将大于400bp的接收的cDNA合并成一管，用芬：仿（1：1）抽提。12000rpm,室温离心2分钟。取上清，加入等体积的氯仿抽提。12000rpm,室温离心2分钟。取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过液。从-20℃取出沉淀反应，4℃，12000rpm，离心60分钟。去上清，用80%乙醇洗沉淀，室温，12000rpm，离心2分钟。去上清，干燥沉淀，溶于5μl灭菌水中。从每管中取8μl跑5%的非变性丙烯酰胺凝胶电泳。32cDNA片段与载体的连接及噬菌体蛋白的包装按下列比例将合成的cDNA连接到载体上去。Uni-ZAPXRvector(1μg/μl)1.0μl10×ligasebuffer0.5μl10mMrATP0.5μlcDNAsample～100ngT4DNAligase0.5μl加水至5.0μl4℃连接2天。cDNA片段与载体的连接及噬菌体蛋白的包装33取出1μl连接产物，加入GigapackIII包装蛋白进行包装。22℃温育2小时，然后加500μlSM缓冲液，20μl氯仿混匀后稍离心，将管子储存于4℃。准备XL1-BLUEMRF’宿主细菌。取1μl文库，用SM缓冲液将其稀释至102、104、105倍等3个梯度，在每个梯度中分别取lμl放入200μlXL1-BLUEMRF’感受态细胞中。取出1μl连接产物，加入GigapackIII包装蛋白进3437℃培养15分钟。然后加入：2-3mlNZY顶层培养基、15μlIPTG和50μlX-gal。IPTG（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）；X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷）立即铺入NZY固体培养基上，37℃过夜培养，测定文库的滴度。文库的滴度计算公式为：文库滴度（pfu/ml）＝（噬菌斑数／加入μl数）*稀释倍数*103μl/ml37℃培养15分钟。35cDNA文库噬菌斑照片cDNA文库噬菌斑照片36cDNA文库噬菌体PCR电泳图cDNA文库噬菌体PCR电泳图376.2.2从蛋白质已知序列推知C末端5-6个氨基酸的相应DNA序列，合成一组寡聚脱氧核苷酸片段作为引物。在总mRNA中这组引物只与该蛋白质的mRNA可以氢键配对，以此引物进行逆转录，得到特性cDNA。6.2.3利用RT-PCR技术可以得到特定的cDNA。6.3PCR技术分离基因6.2.2从蛋白质已知序列推知C末端5-6个氨基酸的386.4化学法合成目的基因随着寡核苷酸的化学合成的自动化，基因的化学合成变的更经济、容易和准确。化学合成基因对那些其他技术方法不易分离的基因尤为重要。6.4.1基因片段的全化学合成首先合成一个基因的所有片段，相邻的片段间有4-6个碱基的重叠互补，在适当的条件下（主要是温度条件）经退火后，用T4DNA连接酶将各片段以磷酸二酯键的共价键形式连接成一个完整的基因。6.4化学法合成目的基因396.4.2基因的化学-酶促合成此方法是不需要合成组成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相邻的3’末端有一短的顺序相互补，在适当的条件下通过退火形成模板-引物复合体（template-primercomplex），然后在存在四种dNTP的条件下，用E.coli的DNA聚合酶I大片段去填补片段之间的缺口，最后用T4DNA连接酶及适当的限制性内切酶切割后重组入载体。6.4.2基因的化学-酶促合成40第六章基因文库的构建与目的基因的获得第六章基因文库的构建与目的基因的获得41基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定42

目前主要应用化学合成法、目的基因的直接分离法和逆转录法来分离、获得目的基因。PCR技术的问世及其在基因工程中广泛应用，已经大大简化了构建和筛选cDNA文库的工作。此外，新发展起来的转座子标签法（transposontagging）、mRNA差异显示法（mRNAdifferentialdisply）、RFLP及ESTs等技术也已经在分子克隆工作中展现出广阔的前景。目前主要应用化学合成法、目的基因的直接分离法和逆转录法来分436.1基因文库的构建基因组文库（genomicDNAlibrary）是指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶切后（必要时对这些DNA片段进行密度梯度离心或经制备型凝胶电泳进行分级分离，以选择长度适合于插入载体的片段）所产生的基因组片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。6.1基因文库的构建441975年，Clarke和Carbon提出了计算文库中任一DNA序列重组子数目的公式，即N=ln(1-P)/ln(1-f)N为所需要的重组体的数目，P为选出某一基因的期望概率（通常期望为99%），f为单个重组体中的平均插入片段与基因组DNA总量之比。1975年，Clarke和Carbon提出了计算文库中任一D45例如要在一哺乳动物基因组（3×109bp）的17kb片段的文库中，使含有一给定DNA序列达99%的概率，则需N=ln(1-0.99)/ln[1-(1.7×104bp/3×109bp)]=8.1×105即所建的文库至少含有8.1×105以上的重组体，才能代表整个的基因组。

例如要在一哺乳动物基因组（3×109bp）的17kb片段的文46基因组DNA文库有着非常广泛的用途。如用以分析、分离特定的基因片段；通过染色体步行（chromasomewalking）研究基因的组织结构；用于基因表达调空研究；用于人类及动、植物基因组工程的研究等等。基因组文库的构建一般包括下列基本步骤：（1）细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备；（2）载体DNA的制备；（3）载体与外源大片段的连接；（4）体外包装及基因组DNA文库的扩增；（5）重组DNA的筛选和鉴定。基因组DNA文库有着非常广泛的用途。如用以分析、分离特定的基47基因工程-第6章-基因文库的构建与目的基因的获得课件486.2cDNA的合成和克隆6.2.1cDNA文库（cDNAlibrary）的构建和基因的分离cDNA的克隆对于特定基因的分离和特性研究是极有价值的工具。cDNA文库最关键的特征是它包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列，这样使得cDNA文库的复杂性要比基因组文库要低得多。由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各自的mRNA的种类就不同，由此而产生独特的cDNA文库。6.2cDNA的合成和克隆49

构建cDNA文库通常包括：（1）mRNA的提取及其完整性的确定；（2）cDNA的合成和克隆；（3）目的cDNA的鉴定等步骤。(1)总RNA的提取(2)mRNA的分离(3)mRNA的纯化(4)cDNA第一条链的合成:①随机引物法；②oligo-dT(12-18)引物法(5)cDNA第二条链的合成(6)cDNA的甲基化和接头的加入(7)cDNA同载体的连接(8)噬菌体蛋白的体外包装（9）噬菌斑原位杂交分离基因构建cDNA文库通常包括：（1）mRNA的提取及其完整性的50基因工程-第6章-基因文库的构建与目的基因的获得课件51基因工程-第6章-基因文库的构建与目的基因的获得课件52总RNA的提取凡与RNA操作有关的玻璃器皿经常规洗净后，用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）浸泡处理（37℃，2小时），再用灭菌双蒸水漂洗几次。高压消毒去除DEPC，然后250℃烘烤4小时以上或180℃8小时以上。塑料器材最好使用灭菌的一次性使用的塑料用品，Eppendorf管、微量加样吸头最好是新的，使用前进行高压灭菌。所有溶液应加DEPC至终浓度0.05%-0.1%，室温处理过夜，然后高压处理。DEPC易与Tris反应，配制Tris溶液的水应先用0.1%DEPC处理，高压消毒，配好后再高压消毒。总RNA的提取531异硫氰酸胍----热苯酚法1）将实验用的全部用品用0.1%的DEPC水浸泡过夜，然后高压灭菌，玻璃器皿在180℃烘烤8h以上，塑料制品80℃烘干。2）将0.1g组织样品在研钵中迅速研成粉末，放入装有1mlGITC试剂的匀浆管中匀浆。匀浆液取出放在1.5ml离心管中，吸打几次以剪切染色质DNA，60℃温浴10min。3）加入等体积60℃苯酚，混匀，抽提。4）冰中冷却，10000rpm离心10min。取上清，用热苯酚重复抽提一次。1异硫氰酸胍----热苯酚法545）等体积氯仿在室温下抽提1-2次后，上清加1/10体积3M乙酸钠和3倍体积无水乙醇，在－20℃沉淀过夜。6）12000rpm离心15min，沉淀溶于0.5mlSTE中，加蛋白酶K至200μg/ml，56℃消化1h。等体积热苯酚：氯仿抽提，冷却离心，重复一次。7）上清加2.5倍体积无水乙醇沉淀过液。离心，70%乙醇洗沉淀，干燥后，溶于适量DEPC水中。5）等体积氯仿在室温下抽提1-2次后，上清加1/10体积3M552用TRIZOL试剂盒提取总RNA1)匀浆在1ml的TRIZOL试剂中加50-100mg组织，样本体积不应超过TRIZOL的10%。用匀浆机高速匀浆2分钟。2)（可选）要分离蛋白、脂肪、多糖或细胞外物质如肌肉、脂肪组织，在匀浆后2-8℃12000g离心10分钟。将上清匀转移至一新的Eppendof管。3)分相15-30℃温育5分钟，完全解离核蛋白复合体。加0.2ml氯仿，用力摇动15秒，15-30℃放置2-3分钟。小于12000g2-8℃离心15分钟。2用TRIZOL试剂盒提取总RNA564)RNA的沉淀转移水相于一新管。加0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10分钟。4-8℃12000g离心10分钟（离心前RNA通常不可见，在管壁或管底形成胶样沉淀）。5）RNA沉淀的洗涤弃上清，每1mlTRIZOL至少加1ml75%的乙醇洗涤RNA一次。2-8℃小于7500g离心5分钟。6）RNA的重溶倒掉乙醇，空气中干燥或真空干燥5-10分钟。加适当的DEPC处理水，吸打几次，放于55-60℃溶解10分钟。-70℃保存。4)RNA的沉淀57RNA变性电泳方法Ⅰ在一灭菌微量离心管中混合下列液体，以制备RNA样品。

RNA9μl10×TAE4μl甲醛7μl甲酰胺20μl总体积40μl

混匀后，65℃温育15min，取出置冰上。加入RNA上样缓冲液，用1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳buffer为1×TAE。RNA变性电泳58mRNA的分离和纯化具体操作按OligotexmRNAMiniKit说明进行。500μg总RNA于1.5ml离心管中用DEPC处理过的水调至500μl。加OBB500μl和OligotexSuspension45μl,充分混匀。70℃30分钟取出反应，室温放置10分钟。12000rpm离心2分钟，沉淀。用OW2400μl重悬沉淀，然后移到一小离心柱中，12000rpm,离心１分钟。mRNA的分离和纯化59总RNA和mRNA总RNA和mRNA60将这小离心柱移入一新1.5ml离心管中，加400μlOW2，12000rpm,离心１分钟。将这小离心柱移入一新1.5ml离心管中，加20μl热（70℃）OEB到离心柱中，用枪上下吹吸３－４次，12000rpm,离心１分钟。再加2５μl热（70℃）OEB到离心柱中，用枪上下吹吸３－４次，12000rpm,离心１分钟。将这小离心柱移入一新1.5ml离心管中，加400μlOW261第一链的合成在1.5ml离心管中，按顺序加入以下试剂：10×firststrandbuffer5.0μlFirststrandMethylNucleotidemixture5.0μlLinker-primer(1.4μg/μl)2.0μlDEPCwater30.5μlRNaseBlockRibonucleaseInhibitor(40u/μl)1.0μl第一链的合成62振荡混匀，然后加入5μl（5μg）mRNA,混匀。室温放置10分钟，以便模板和引物退火。加入3.5μlMMLV-RT(20u/μl),终体积50μl，混匀，稍离心。取出5ｕL放于含有0.5ｕLα-32PdATP的离心管做对照反应。37℃温育1小时同时准备16℃水浴。将第一链反应液取出，放置在冰上振荡混匀，然后加入5μl（5μg）mRNA,混匀。63第二链的合成在冰上按顺序往第一链反应液中加入以下试剂：10×Secondstrandbuffer20.0μlSecondstranddNTPs6.0μlddH2O108.2μlα-32PdATP2μl稍混匀，离心后加入RNaseH（0.9u/μl）3.5μlDNApolymeraseI(9.0u/μl)11.1μl迅速振荡管子以混匀，稍离心后，在16℃温育2.5小时，然后取出放在冰上。注意：在操作过程中必须保证温度不超过16℃，否则会引起发夹结构的形成，影响cDNA的克隆。第二链的合成64cDNA第一链和cDNA第二链碱变性琼脂糖凝胶电泳的同位素X光片cDNA第一链和cDNA第二链碱变性琼脂糖凝胶电泳的同位素X65cDNA第一链和双链cDNA凝胶电泳cDNA第一链和双链cDNA凝胶电泳66

cDNA末端的补平在反应管中加入BlutingdNTPmix23μlpfuDNApolymerase(2.5u/μl)2.0μl混匀后，72℃温育30分钟，注意：不能超过30分钟。取出反应管，加200μl苯酚：氯仿（1：1）抽提。12000rpm室温离心2分钟，取上清，用等体积氯仿再抽提1次。取上清，加入20μl3MNaAc(PH5.2)，400μl无水乙醇，-20℃过夜沉淀。12000rpm，4℃，离心60分钟。70%乙醇洗沉淀，吸出乙醇后，干燥沉淀。将沉淀溶于9.0μl的EcoRIadapters溶液中。4℃放置至少30分钟，使cDNA完全溶解。cDNA末端的补平67EcoRIadapters的连接在含有cDNA和EcoRIadapters的管中加入10×Ligasebuffer1.0μl10mMrATP1.0μlT4DNAligase(4μg/μl)1.0μl4℃连接两天，将管放在70℃水欲中30分钟，以灭活连接酶。EcoRIadapters的连接68EcoRI末端的激活在反应管中加入10×Ligasebuffer1.0μl10mMrATP2.0μl灭菌水6.0μlT4polynucleotidekinase10μg/μl)1.0μl37℃温育30分钟。70℃温育30分钟以灭活T4polynucleotidekinase1，稍离心。EcoRI末端的激活69

XhoI消化在反映管中加入28.0μlXhoIbuffer,3.0μlXhoI,37℃消化2小时。冷却至室温，加入5.0μl10×STEbuffer。这时的cDNA可以进行片段分离了。XhoI消化70cDNA不同大小片段的分离将SepharoseCL-2B和10×STEbuffer从4℃冰箱中取出，平衡至室温。准备50ml的1×STEbuffer。将柱子固定在一个支架上，轻轻混匀SepharoseCL-2B，用1ml移液器将其加入柱子中。加入10ml1×STEbuffer平衡柱子。当在树脂液面上剩大约50μlSTE时，立即加入cDNA样。一旦样品进入SepharoseCL-2B，用移液枪将连接管加满1×STEbuffer。当染料达到柱子管壁刻度为-.4ml时开始接收cDNA，每3滴接一管。当染料达到柱子管壁刻度为.3ml时停止接收cDNA，大约接收12管。cDNA不同大小片段的分离71从每管中取8μl跑5%的非变性丙烯酰胺凝胶电泳。将非变性丙烯酰胺凝胶压片，决定哪几管用于将来与载体的连接。将大于400bp的接收的cDNA合并成一管，用芬：仿（1：1）抽提。12000rpm,室温离心2分钟。取上清，加入等体积的氯仿抽提。12000rpm,室温离心2分钟。取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过液。从-20℃取出沉淀反应，4℃，12000rpm，离心60分钟。去上清，用80%乙醇洗沉淀，室温，12