酶促反应进程定时法三课件

第二十三章临床酶学检验的原理和方法第二十三章临床酶学检验的原理和方法1临床酶学检验基本特点基本方法1、项目多，应用广2、含量少，难度大3、高灵敏度4、高特异度1、活性测定法2、质量测定法临床酶学检验基本特点基本方法1、项目多，应用广1、活性测定法2第一节酶活性测定的理论基础一、酶促反应进程二、定时法三、连续检测法第一节酶活性测定的理论基础一、酶促反应进程3米-曼方程最大反应速率底物浓度米氏常数反应速度一、酶促反应进程K1K2E+SESE+PK-1酶底物酶-底物复合物酶产物

Vmax［S］V0=Km+［S］米-曼方程最大反应速率底物浓度米氏常数反应速度一、酶促反应进4（一）Km

Km是酶的特征性常数之一。若v=0.5Vmax，则Km=[S]，可见Km值等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度。Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。1．1／Km可近似地表示酶对底物的亲和力的大小，Km值越小，表示酶与底物的亲和力越大，反之亦然。2．如果一个酶有几种底物，则对每一种底物各有一个特定的Km值，其中Km值最小的底物大都是该酶的最适底物或天然底物。（一）Km5

3．如已知酶的Km，可计算某一底物浓度时反应速率v和最大速率Vmax的比值，并可推知酶的活性中心被底物饱和的分数。同样，如要求v和Vmax有一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其Km的多少倍4．利用工具酶来测定体液中某一成分的浓度或某一酶的催化活性浓度时，可根据米-曼方程或其衍变方程式来计算工具酶的用量。5．测定Km值可鉴别不同来源但催化相同反应的酶是同一种酶或是同工酶。

6．如一个酶催化正逆两个方向，测定正逆两个方向底物的Km及底物浓度，可大体推测该酶在体内催化反应的方向及其催化效率。7．在代谢酶系中，当一组酶催化连续的代谢反应时，如已知各酶的Km及其相应底物的浓度，有助于寻找代谢的限速步骤。一般Km值最大的酶所催化的反应为该酶系的限速步骤。3．如已知酶的Km，可计算某一底物浓度时反应速率v和最大速6（二）VmaxVmax表示在一定酶量下的最大反应速率，即酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比。在酶的浓度不变时，对于特定底物而言，Vmax也是一个常数。（二）Vmax7零级一级[P][S]V＝dpdt时间延滞期线性期非线性期酶促反应时间进程曲线零级一级[P][S]V＝dpdt时间延滞期线性期非线性期酶8（一）延滞期延滞期（lagphase）是指反应初开始的一段时间，可以是几秒至几分钟。此时[S]不断下降，随之有相应[P]产生。由于多种因素的影响，该其酶促反应速率比较慢。1、单一酶促反应的延滞期：是指酶促反应开始到达最大反应速率所需要的时间。2、酶偶联反应的延滞期（一）延滞期延滞期（lagphase）是指反应初开始的9（二）线性期延滞期后，在过量底物存在的条件下，酶促反应速率达到最大反应速率并保持相对恒定的一段时期，该期在时间进程曲线中呈直线或接近直线状态，称为线性期(linearphase)。因底物量足够，在线性期酶促反应速率不受底物浓度的影响，产物[P]和底物[S]变化与时间t成直线关系，因此该期的酶促反应速率能反映酶活性的大小。（二）线性期10（三）非线性期非线性期又称底物耗尽期，是指线性期后反应速度明显下降，酶促反应进程曲线偏离直线的一段时期。根据酶促反应进程曲线中线性期的反应速度才能准确计算出酶活性浓度，因此，不论哪种酶活性浓度测定方法，都应该尽量保证在酶促反应进程的线性期进行检测，否则将导致误差。在延滞期、非线性反应期所测得的结果往往不准确。（三）非线性期根据酶促反应进程曲线中线性期的反应速度才能准确11酶促反应进程定时法三课件12 二、定时法为了计算酶活性浓度，必须根据线性反应期（零级反应期）的反应速率才能准确计算出酶活性浓度，否则将导致误差。酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度达到Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的V，此时V与[E]之间有线性关系。 二、定时法为了计算酶活性浓度，必须根据线性反应期（13酶活性浓度测定方法①量气法其原理是通过测量一封闭反应系统中气体变化后的气体体积或压力，从而计算出气体的变化量适用于测定在反应中产生或消耗气体的酶②分光光度法酶促反应的底物与产物结构不同，光吸收谱也有差异，不仅能在可见光范围测定有色溶液的浓度，还能在紫外光波长范围测定特异的带有双键或环状结构的无色物质③荧光法和放射性核素法通过荧光光度计测定酶促反应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比④其它方法

1.按监测方法分类2.按反应时间分类(1)定时法（取样法、终点法、两点法）(2)连续监测法（动力学法、速率法）酶活性浓度测定方法①量气法其原理是通过测量一封闭反应系统中气14定时法（取样法、终点法、两点法）定时法:早期测定酶活性浓度的方法，大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。优点：设备简单，操作方便，测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择不考虑对酶活性的影响。（一）定时法的特点定时法（取样法、终点法、两点法）定时法:早期测定酶活性浓度的15缺点：难以确定选定的反应时间是否处于线性期反应1反应3反应2定时法中可能引起的误差缺点：难以确定选定的反应时间是否处于线性期反应1反应3反应216注意事项①用定时法测定酶活性浓度，必须了解不同酶促反应速率和时间的关系，②应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间，然后在这段时间进行测定，③避开延滞期和一级反应。

在实际工作中，延滞期很难确定，而且一般很短，对酶活性测定产生的影响不大。但非线性期的影响不容忽视，随着保温时间的延续，酶变性失活加速，逆反应加强，对活性测定产生的影响非常明显。注意事项在实际工作中，延滞期很难确定，而且一般很短，对酶活性17（二）酶活性的计算根据测定方法的不同，可以利用标准比较法、标准曲线法或吸光系数法计算出酶活性浓度单位。酶活性国际单位定义为每升样品中每分钟生成1μmol为1U/L（二）酶活性的计算根据测定方法的不同，可以利用标18三、连续监测法（动力学法、速率法）

即指连续测定酶促反应过程中某一产物或底物浓度随时间变化的多点数据，求出酶促反应初速度，间接计算出酶活性浓度的方法。其是临床测定酶活性浓度最常用方法。三、连续监测法（动力学法、速率法）即指连续测定酶促反应19（一）连续监测法的特点优点：连续观测反应进程，容易找到直线区域，选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在短时间内完成测定。缺点：连续监测法在特定条件下进行，要求足够的底物浓度和精确控制温度、PH等反应条件，对仪器要求较高，需要具有恒温装置和连续记录吸光度装置。①自动生化分析仪能自动获取规定时间内的信号，自动判断非线性度，所以连续监测法更适合于自动化仪器。②目前已取代固定时间法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法。（一）连续监测法的特点优点：连续观测反应进程，容易找到直线区20（二）酶活性的计算用连续监测法进行酶活性测定时，根据摩尔吸收系数可以进行酶活性浓度的计算。（二）酶活性的计算用连续监测法进行酶活性测定时，根据摩尔吸收21连续监测法检测酶活性浓度时，使用摩尔消光系数（ε）。其定义为：特定条件下，一定波长的光，光径为1.0cm时，通过所含吸光物质的浓度为1.00mol/L时的吸光度。目前实验室常用的计算方式连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化（ΔA/min）U/L＝ΔAmin×V×106ε×v×LΔA—吸光度变化106—把mol换算成μmolv—样品量（ml）L—比色杯光径（cm）V—反应体系体积（ml）ε—摩尔消光系数（cm2·mol-1）连续监测法检测酶活性浓度时，使用摩尔消光系数（ε）。其定义为22自动生物化学分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上讲V，v和L均为固定值，ε为常数，则可将公式简写为：

U/L＝ΔAmin×KV×106ε×v×LK=

K为酶活性浓度定量系数

主要用于临床酶活性测定的计算与校正

K值设置应考虑酶的参考值上限及测定时间两方面。

自动生物化学分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上讲V，v和23（三）连续监测法的方法类型1.直接连续监测法是在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物某些理化性质的变化（如：A、荧光、旋光性，pH、电导率、粘度等），从而计算出酶活性浓度。评价：方法简单，但只有底物与产物之间，在理化性质方面有显著性差异时，才能使用直接法，只有很少一部分酶能用直接法测定。根据检测物质是否为待测酶的底物或产物，可将连续监测法分为：直接连续监测法和间接连续监测法。（三）连续监测法的方法类型1.直接连续监测法是在不终止酶促反242.间接连续监测法（1）一步间接连续监测法在原反应体系中加入一些试剂，其只和反应产物迅速作用，产生可被检出的物质，但该试剂不和酶反应，也不影响酶的活性。SPE+试剂可被检出的物质（2）酶偶联法目前应用最多，即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶的酶促反应偶联起来，最后的反应产物可直接监测，进而推测出第一个酶的活性浓度。2.间接连续监测法（1）一步间接连续监测法在原反应体系25反应模式ABPExEi被测酶被测酶始发反应始发反应指示反应指示酶指示反应指示酶ABCPExEaEi辅助酶辅助反应酶偶联体系辅助酶辅助反应酶偶联反应反应模式ABPEx26酶偶联反应时相

酶偶联反应一开始不能反映酶活性，在反应中存在几个时相。以临床常规酶学分析中常见的ALT的检测为例，在该酶偶联体系中的指示酶为脱氢酶，反应原理如下：L-丙氨酸＋α-酮戊二酸α-丙酮酸＋L-谷氨酸α-丙酮酸＋NADH乳酸＋NAD+ALTLDH此时反应的方向由NADH转变为NAD，随反应进行，A应随之而下降，通过检测反应产物A在340nm处A的变化速率，可以检测指示酶反应。+酶偶联反应时相酶偶联反应一开始不能反映酶活性，在反应中存在27反应一开始加入的试剂1中只有丙氨酸，不存在α-酮戊二酸，在此时相中，存在于样品中的干扰物质（内源性α-酮酸）消耗完。加入试剂2（即α-酮戊二酸）启动反应，在初始阶段，产物α-丙酮酸开始出现，并逐渐增多，但处于较低水平，指示酶反应速度也较低，不能代表待测酶的Vx。随着产物α-丙酮酸增加到一定程度，Ex和Ei反应V相同，达到稳态期。此阶段340nm处A出现明显的线性变化。反应一开始加入的试剂1中只有丙氨酸，不存在α-酮戊二酸，在此282.酶偶联反应注意事项(1)延滞期应越短越好，测定时间要避开此期。(2)不是所有的酶都适合用酶偶联法进行测定，酶偶联反应V应超过或等于Vx，Ei反应必须是一级反应，即指示酶反应速率和测定酶的产物B浓度成正比。只有使用大量的Ei及其Km值很小时才能做到。(3)从经济方面考虑应选用一些来源容易且价格便宜的酶（指示酶）制剂。(4)适当的指示酶的用量，反复实验法确定，即做到酶偶联速率不随酶量的增加而升高，并在所选的最适条件下，指示酶偶联反应速率和酶活性浓度成正比。2.酶偶联反应注意事项29检测方法设计连续监测法色素原底物NAD(P)H系统过氧化物酶系统其它ALP、GGT、AMS、AFULDH、HBDH、ALTAST、CK、ADALPS、ADACHE、ACP根据连续监测法偶联体系和检测信号的不同，可以设计多种检测方法检测方法设计连色素原底物NAD(P)H系统过氧化物酶系统其它30定时法和连续监测法的区别定时法连续监测法测总变化量，平均速率测速率含延滞期或非线性期只计算线性期速率终止酶促反应酶促反应一直进行多用酶偶联反应多用化学方法检测定时法和连续监测法的区别定时法连续监测法测总变化量，平均速率31第二十三章临床酶学检验的原理和方法第二十三章临床酶学检验的原理和方法32临床酶学检验基本特点基本方法1、项目多，应用广2、含量少，难度大3、高灵敏度4、高特异度1、活性测定法2、质量测定法临床酶学检验基本特点基本方法1、项目多，应用广1、活性测定法33第一节酶活性测定的理论基础一、酶促反应进程二、定时法三、连续检测法第一节酶活性测定的理论基础一、酶促反应进程34米-曼方程最大反应速率底物浓度米氏常数反应速度一、酶促反应进程K1K2E+SESE+PK-1酶底物酶-底物复合物酶产物

Vmax［S］V0=Km+［S］米-曼方程最大反应速率底物浓度米氏常数反应速度一、酶促反应进35（一）Km

Km是酶的特征性常数之一。若v=0.5Vmax，则Km=[S]，可见Km值等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度。Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。1．1／Km可近似地表示酶对底物的亲和力的大小，Km值越小，表示酶与底物的亲和力越大，反之亦然。2．如果一个酶有几种底物，则对每一种底物各有一个特定的Km值，其中Km值最小的底物大都是该酶的最适底物或天然底物。（一）Km36

3．如已知酶的Km，可计算某一底物浓度时反应速率v和最大速率Vmax的比值，并可推知酶的活性中心被底物饱和的分数。同样，如要求v和Vmax有一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其Km的多少倍4．利用工具酶来测定体液中某一成分的浓度或某一酶的催化活性浓度时，可根据米-曼方程或其衍变方程式来计算工具酶的用量。5．测定Km值可鉴别不同来源但催化相同反应的酶是同一种酶或是同工酶。

6．如一个酶催化正逆两个方向，测定正逆两个方向底物的Km及底物浓度，可大体推测该酶在体内催化反应的方向及其催化效率。7．在代谢酶系中，当一组酶催化连续的代谢反应时，如已知各酶的Km及其相应底物的浓度，有助于寻找代谢的限速步骤。一般Km值最大的酶所催化的反应为该酶系的限速步骤。3．如已知酶的Km，可计算某一底物浓度时反应速率v和最大速37（二）VmaxVmax表示在一定酶量下的最大反应速率，即酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比。在酶的浓度不变时，对于特定底物而言，Vmax也是一个常数。（二）Vmax38零级一级[P][S]V＝dpdt时间延滞期线性期非线性期酶促反应时间进程曲线零级一级[P][S]V＝dpdt时间延滞期线性期非线性期酶39（一）延滞期延滞期（lagphase）是指反应初开始的一段时间，可以是几秒至几分钟。此时[S]不断下降，随之有相应[P]产生。由于多种因素的影响，该其酶促反应速率比较慢。1、单一酶促反应的延滞期：是指酶促反应开始到达最大反应速率所需要的时间。2、酶偶联反应的延滞期（一）延滞期延滞期（lagphase）是指反应初开始的40（二）线性期延滞期后，在过量底物存在的条件下，酶促反应速率达到最大反应速率并保持相对恒定的一段时期，该期在时间进程曲线中呈直线或接近直线状态，称为线性期(linearphase)。因底物量足够，在线性期酶促反应速率不受底物浓度的影响，产物[P]和底物[S]变化与时间t成直线关系，因此该期的酶促反应速率能反映酶活性的大小。（二）线性期41（三）非线性期非线性期又称底物耗尽期，是指线性期后反应速度明显下降，酶促反应进程曲线偏离直线的一段时期。根据酶促反应进程曲线中线性期的反应速度才能准确计算出酶活性浓度，因此，不论哪种酶活性浓度测定方法，都应该尽量保证在酶促反应进程的线性期进行检测，否则将导致误差。在延滞期、非线性反应期所测得的结果往往不准确。（三）非线性期根据酶促反应进程曲线中线性期的反应速度才能准确42酶促反应进程定时法三课件43 二、定时法为了计算酶活性浓度，必须根据线性反应期（零级反应期）的反应速率才能准确计算出酶活性浓度，否则将导致误差。酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度达到Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的V，此时V与[E]之间有线性关系。 二、定时法为了计算酶活性浓度，必须根据线性反应期（44酶活性浓度测定方法①量气法其原理是通过测量一封闭反应系统中气体变化后的气体体积或压力，从而计算出气体的变化量适用于测定在反应中产生或消耗气体的酶②分光光度法酶促反应的底物与产物结构不同，光吸收谱也有差异，不仅能在可见光范围测定有色溶液的浓度，还能在紫外光波长范围测定特异的带有双键或环状结构的无色物质③荧光法和放射性核素法通过荧光光度计测定酶促反应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比④其它方法

1.按监测方法分类2.按反应时间分类(1)定时法（取样法、终点法、两点法）(2)连续监测法（动力学法、速率法）酶活性浓度测定方法①量气法其原理是通过测量一封闭反应系统中气45定时法（取样法、终点法、两点法）定时法:早期测定酶活性浓度的方法，大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。优点：设备简单，操作方便，测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择不考虑对酶活性的影响。（一）定时法的特点定时法（取样法、终点法、两点法）定时法:早期测定酶活性浓度的46缺点：难以确定选定的反应时间是否处于线性期反应1反应3反应2定时法中可能引起的误差缺点：难以确定选定的反应时间是否处于线性期反应1反应3反应247注意事项①用定时法测定酶活性浓度，必须了解不同酶促反应速率和时间的关系，②应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间，然后在这段时间进行测定，③避开延滞期和一级反应。

在实际工作中，延滞期很难确定，而且一般很短，对酶活性测定产生的影响不大。但非线性期的影响不容忽视，随着保温时间的延续，酶变性失活加速，逆反应加强，对活性测定产生的影响非常明显。注意事项在实际工作中，延滞期很难确定，而且一般很短，对酶活性48（二）酶活性的计算根据测定方法的不同，可以利用标准比较法、标准曲线法或吸光系数法计算出酶活性浓度单位。酶活性国际单位定义为每升样品中每分钟生成1μmol为1U/L（二）酶活性的计算根据测定方法的不同，可以利用标49三、连续监测法（动力学法、速率法）

即指连续测定酶促反应过程中某一产物或底物浓度随时间变化的多点数据，求出酶促反应初速度，间接计算出酶活性浓度的方法。其是临床测定酶活性浓度最常用方法。三、连续监测法（动力学法、速率法）即指连续测定酶促反应50（一）连续监测法的特点优点：连续观测反应进程，容易找到直线区域，选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在短时间内完成测定。缺点：连续监测法在特定条件下进行，要求足够的底物浓度和精确控制温度、PH等反应条件，对仪器要求较高，需要具有恒温装置和连续记录吸光度装置。①自动生化分析仪能自动获取规定时间内的信号，自动判断非线性度，所以连续监测法更适合于自动化仪器。②目前已取代固定时间法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法。（一）连续监测法的特点优点：连续观测反应进程，容易找到直线区51（二）酶活性的计算用连续监测法进行酶活性测定时，根据摩尔吸收系数可以进行酶活性浓度的计算。（二）酶活性的计算用连续监测法进行酶活性测定时，根据摩尔吸收52连续监测法检测酶活性浓度时，使用摩尔消光系数（ε）。其定义为：特定条件下，一定波长的光，光径为1.0cm时，通过所含吸光物质的浓度为1.00mol/L时的吸光度。目前实验室常用的计算方式连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化（ΔA/min）U/L＝ΔAmin×V×106ε×v×LΔA—吸光度变化106—把mol换算成μmolv—样品量（ml）L—比色杯光径（cm）V—反应体系体积（ml）ε—摩尔消光系数（cm2·mol-1）连续监测法检测酶活性浓度时，使用摩尔消光系数（ε）。其定义为53自动生物化学分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上讲V，v和L均为固定值，ε为常数，则可将公式简写为：

U/L＝ΔAmin×KV×106ε×v×LK=

K为酶活性浓度定量系数

主要用于临床酶活性测定的计算与校正

K值设置应考虑酶的参考值上限及测定时间两方面。

自动生物化学分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上讲V，v和54（三）连续监测法的方法类型1.直接连续监测法是在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物某些理化性质的变化（如：A、荧光、旋光性，pH、电导率、粘度等），从而计算出酶活性浓度。评价：方法简单，但只有底物与产物之间，在理化性质方面有显著性差异时，才能使用直接法，只有很少一部分酶能用直接法测定。根据检测物质是否为待测酶的底物或产物，可将连续监测法分为：直接连续监测法和间接连续监测法。（三）连续监测法的方法类型1.直接连续监测法是在不终止酶促反552.间接连续监测法（1）一步间接连续监测法在原反应体系中加入一些试剂，其只和反应产物迅速作用，产生可被检出的物质，但该试剂不和酶反应，也不影响酶的活性。SPE+试剂可被检出的物质（2）酶偶联法目前应用最多，即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶的酶促反应偶联起来，最后的反应产物可直接监测，进而推测出第一个酶的活性浓度。2.间接连续监测法（1）一步间接连续监测法在原反应体系56反应模式ABPExEi被测酶被测酶始发反应始发反应指示反应指示酶指示反应指示酶AB