弥漫性肺泡出血小鼠注射依托泊苷的效果分析,药理学论文

弥漫性肺泡出血小鼠注射依托泊苷的效果分析,药理学论文摘要：目的讨论依托泊苷对pristane诱导的弥漫性肺泡出血(diffusealveolarhemorrhage,DAH)小鼠肺组织细胞凋亡的影响。方式方法24只小鼠随机分为对照组、模型组和依托泊苷组，每组8只。模型组和依托泊苷组腹腔单次注射0.5mLpristane制备DAH模型，对照组给予等量PBS。造模成功后，依托泊苷组腹腔注射10mg/kg依托泊苷，对照组和模型组腹腔注射等量PBS,均1次/d,连续14d。14d后，取3组小鼠肺组织进行组织病理检查，HE染色观察小鼠肺组织出血情况和炎症细胞浸润情况，采用TUNEL染色试剂盒检测3组小鼠肺组织细胞凋亡率，采用Westernblot法检测3组小鼠肺组织caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相对表示出量。结果对照组小鼠肺组织大体呈正常粉红色，模型组为暗红色，依托泊苷组可见散在出血点。对照组小鼠肺泡构造完好，肺泡腔清楚明晰，肺组织炎症细胞浸润不明显；模型组小鼠肺泡腔出现大量红细胞，伴大量中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润；依托泊苷组肺泡腔无明显红细胞，肺泡壁增厚。模型组小鼠肺组织细胞凋亡率[(7.870.79)%]及Bax、caspase-3蛋白相对表示出量(0.870.01、2.110.17)高于对照组[(0.780.13)%、0.240.02、0.190.01]和依托泊苷组[(1.490.24)%、0.320.01、0.830.06](P0.05),依托泊苷组高于对照组(P0.05);模型组小鼠Bcl-2蛋白相对表示出量(0.750.07)低于对照组(2.860.19)和依托泊苷组(5.620.21)(P0.05),依托泊苷组高于对照组(P0.05)。结论依托泊苷对DAH小鼠有治疗作用，可明显改善小鼠肺组织肺泡出血和炎症细胞浸润，降低肺组织细胞凋亡率，其机制可能与调节Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表示出有关。本文关键词语：弥漫性肺泡出血;依托泊苷;细胞凋亡;小鼠;Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofetoposideonlungtissuecellsapoptosisinmicewithdiffusealveolarhemorrhageinducedbypristane.MethodsTwenty-fourmicewererandomlypidedintocontrolgroup,modelgroupandetoposidegroup,with8miceineachgroup.Themiceinmodelgroupandetoposidegroupweregivenasingleintraperitonealinjectionof0.5mLofpristanetoprepareDAHmodels,andthemiceincontrolgroupweregiventhesameamountofPBSbuffer.Aftersuccessfulmodeling,themiceinetoposidegroupwereintraperitoneallyinjectedwith10mg/kgetoposide,andthemiceincontrolgroupandmodelgroupweregiventhesameamountofPBSbuffer,onceadayfor14consecutivedays.After14days,thelungtissueswereobtainedforhistopathologicalexamination.HEstainingwasusedtoobservethehemorrhageandinflammatorycellinfiltrationinthelungtissues,TUNELstainingkitwasusedtodetecttheapoptosisrate,andWesternblotmethodwasusedtodetecttherelativeexpressionsofcaspase-3,BaxandBcl-2proteinsinthelungtissuesofthreegroups.ResultsThelungtissuesweregenerallyinnormalpinkincontrolgroup,wereindarkredinmodelgroup,andwerefoundscatteredbleedingpointsinetoposidegroup.Themiceincontrolgrouphadintactalveolarstructure,clearalveolarcavity,andunobviousinfiltrationofinflammatorycellsinthelungtissues.Themiceinmodelgrouphadalargenumberofredbloodcellsinthealveolarcavity,accompaniedbyalargenumberofneutrophils,macrophagesandotherinflammatorycellsinfiltration.Themiceinetoposidegrouphadnoobviousredbloodcellsinthealveolarcavity,andthealveolarwallswerethickened.TheapoptosisrateoflungcellsandtherelativeexpressionsofBaxandcaspase-3proteinswerehigherinmodelgroup((7.870.79)%,0.870.01,2.110.17)thanthoseincontrolgroup((0.780.13)%,0.240.02,0.190.01)andetoposidegroup((1.490.24)%,0.320.01,0.830.06)(P0.05),andhigherinetoposidegroupthanthoseincontrolgroup(P0.05).TherelativeexpressionofBcl-2proteinwaslowerinmodelgroup(0.750.07)thanthatincontrolgroup(2.860.19)andetoposidegroup(5.620.21)(P0.05),andlowerinetoposidegroupthanthatincontrolgroup(P0.05).ConclusionEtoposidehasatherapeuticeffectonDAHmice.Itcansignificantlyalliviatealveolarhemorrhageandinflammatorycellinfiltrationinthelungtissuesofmice,andreducetheapoptosisrateofthelungcells.ThemechanismmightbecorrelatedwithregulatingtheexpressionsofBax,Bcl-2andcaspase-3proteins.Keyword：diffusealveolarhemorrhage;etoposide;apoptosis;mice;弥漫性肺泡出血(diffusealveolarhemorrhage,DAH)是一种以咯血、缺铁性贫血和弥漫性肺泡浸润为特征的临床综合征[1],多种本身免疫性疾病均可引起DAH,系统性红斑狼疮引起的占多数[2]。系统性红斑狼疮并发DAH虽较罕见，但病死率较高，为50%～70%[3,4,5]。DAH在临床中常用皮质类固醇缓解，联合采用血浆置换免疫吸附疗法，约50%患者复发，需采用皮质类固醇联合免疫抑制剂维持[6]。依托泊苷临床用于巨噬细胞活化综合征[7]和噬血细胞综合征[8]的治疗，未在本身免疫疾病中应用。采用pristane诱导C57BL/6小鼠发生狼疮DAH模型，肺毛细血管炎症在形态上与人系统性红斑狼疮相关的DAH类似[9]。本研究讨论DAH的可能机制及依托泊苷对DAH小鼠的抗凋亡作用，报道如下。1、材料与方式方法1.1、一般材料清洁的雌性C57BL/6小鼠24只，8～12周龄，体质量18～20g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物实验许可证号：SCXK(京)2020-0004]。将小鼠饲养于郑州大学生命科学院SPF级别的动物房中，室温(23.00.5)℃,昼夜节律12h,小鼠可自由获取清洁的水和食物，适应性喂养1周后进行实验。24只小鼠随机分为对照组、模型组和依托泊苷组，每组8只。本研究经郑州大学人民医院动物实验伦理委员会审核批准(伦理批准号：2022178)。1.2、方式方法1.2.1、主要试剂依托泊苷(索莱宝生物科技有限公司),pristane(美国Sigma公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒、TUNEL试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),兔抗鼠Bax、Bcl-2、caspase-3一抗及二抗(美国Abcam公司)。1.2.2、小鼠DAH模型建立及实验方式方法模型组和依托泊苷组小鼠腹腔单次注射0.5mLpristane建立DAH模型，对照组给予等量PBS。造模成功后，依托泊苷组小鼠腹腔注射10mg/kg依托泊苷，对照组和模型组小鼠腹腔注射等量PBS,均1次/d,连续14d。1.2.3、标本采集与小鼠肺组织病理检查药物干涉14d后，小鼠施行安泰死取肺组织。左肺组织固定于体积分数4%多聚甲醛中固定48h,常规石蜡包埋，切成3.5m切片。将切片依次放入二甲苯和梯度乙醇，冲洗后，苏木精染色5min,体积分数5%乙酸分化1min,伊红染色1min,梯度乙醇中脱水，晾干，滴上中性树胶封片，显微镜下观察肺组织形态，采集图像。1.2.4、TUNEL法检测小鼠肺组织细胞凋亡率石蜡包埋的小鼠肺组织切片在二甲苯、无水乙醇、乙醇中进行脱蜡脱水，滴加蛋白酶K37℃孵育25min,PBS液摇洗3次，破膜液破膜后洗涤，参加TUNEL试剂盒内试剂1(TdT)、试剂2(dUTP)和试剂3(buffer)按1:5:50混合，37℃孵育2h后PBS洗涤3次，滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。采用抗荧光淬灭封片剂封片，于荧光显微镜下观察并采集图像，应用Halov3.0.311.314软件分析各组细胞凋亡图像。计算细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数100%。1.2.5、Westernblot法检测凋亡相关蛋白相对表示出量取右肺组织20mg剪碎，参加200LRIPA匀浆，冰上裂解30min,4℃,12000g离心20min,取上清，采用BCA法检测蛋白浓度，取30g蛋白样品SDS电泳，电转至PVDF膜，质量分数5%脱脂牛奶封闭1h,分别参加一抗-actin(1:1000)、Bax(1:1000)、Bcl-2(1:1000)、caspase-3(1:1000),4℃过夜，TBST洗3次，参加二抗抗兔IgG-HRP(1:1000),常温孵育1h,TBST洗3次，使用ECL显色试剂盒显示蛋白条带并应用ImageJ软件处理并拍照，采用Gel-ProApplication进行分析，以-actin为内参，计算Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白相对表示出量。实验重复3次。1.3、统计学处理应用SPSS24.0软件进行统计分析，计量资料以均数标准差(x?s)表示，多组比拟采用单因素方差分析，组间两两比拟采用LSD检验；检验水准=0.05。2、结果2.1、3组小鼠组织病理检查结果(1)大体：对照组小鼠肺组织无出血点，呈正常粉红色；模型组小鼠肺组织呈暗红色；依托泊苷组小鼠肺组织可见出血情况较模型组明显改善，呈少量出血点。见图1。(2)镜下：对照组小鼠肺组织肺泡构造清楚明晰，肺泡壁光滑，肺组织炎症细胞浸润不明显；模型组小鼠肺组织构造异常，肺泡腔有大量红细胞浸润，间质可见大量中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润；与模型组比拟，依托泊苷组小鼠肺组织出血明显减少，间质中炎症细胞浸润减少，肺泡壁增厚。见图2。图13组小鼠肺组织大体观察图注:a为对照组，可见正常肺组织，呈淡粉色；b为模型组，可见严重出血肺组织；c为依托泊苷组，可见肺组织散在出血点。图23组小鼠肺组织病理图〔HE染色，400)注:a为对照组，可见肺泡构造清楚明晰；b为模型组，可见肺泡中大量红细胞，间质中大量炎症细胞浸润；c为依托泊苷组，可见肺泡壁增厚，间质中炎症细胞浸润较少。2.2、3组小鼠肺组织细胞凋亡率比拟3组小鼠肺组织细胞凋亡率比拟差异有统计学意义(F=184.6,P=0.001)。模型组小鼠肺组织细胞凋亡率[(7.870.79)%]高于对照组[(0.780.13)%]和依托泊苷组[(1.490.24)%](P0.05),依托泊苷组高于对照组(P0.05)。见图3。图33组小鼠肺组织细胞TUNEL染色图〔TUNEL染色，100)注:a为对照组，无凋亡细胞；b为模型组，可见大量凋亡细胞；c为依托泊苷组，可见少量凋亡细胞。绿色荧光为凋亡细胞。2.3、3组小鼠肺组织Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白相对表示出量比拟3组小鼠肺组织Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白相对表示出量比拟差异有统计学意义(P0.05)。模型组小鼠肺组织Bax、caspase-3蛋白相对表示出量高于对照组和依托泊苷组(P0.05),Bcl-2蛋白相对表示出量低于对照组和依托泊苷组(P0.05)。依托泊苷组小鼠肺组织Bax、caspase-3和Bcl-2蛋白相对表示出量高于对照组(P0.05)。见表1及图4。表13组小鼠肺组织Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白相对表示出量比拟注:a与对照组比拟，P0.05;b与模型组比拟，P0.05。图43组小鼠肺组织Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表示出Westernblot图注:1为对照组；2为模型组；3为依托泊苷组。3、讨论DAH是系统性红斑狼疮罕见但致命的并发症，主要表现为咯血，伴不同程度的呼吸困难，广泛肺内出血及炎症细胞浸润[10],其发病机制当前尚未说明。pristane可在啮齿动物中诱发狼疮，与人类疾病中系统性红斑狼疮具有共同的临床和病理特征，在C57BL/6小鼠中给予pristane可诱导DAH的动物模型[4]。本研究结果显示，模型组小鼠肺组织大面积出血，肺泡腔中大量红细胞渗出，伴有大量炎症细胞渗出，而对照组无红细胞，炎症细胞浸润不明显；提示DAH模型建造成功。凋亡可能是DAH的始动环节[11]。由pristane诱导的凋亡细胞最初可产生本身免疫性底物，引起免疫耐受毁坏，巨噬细胞去除缺乏，导致本身免疫疾病的发展，巨噬细胞浸润和细胞凋亡可能是引发DAH的关键因素[12]。本研究结果显示，模型组小鼠肺组织细胞凋亡率高于对照组和依托泊苷组，依托泊苷组高于对照组；讲明模型组小鼠肺组织凋亡细胞明显增加，伴有严重肺组织损伤和肺部出血，而依托泊苷组凋亡细胞减少，肺部损伤和出血明显改善；提示抑制细胞凋亡可从始动环节抑制DAH进展，改善肺部损伤，为从抑制凋亡途径治疗本身免疫病提供新途径。pristane可通过激活caspase途径抑制细胞生长，诱导细胞凋亡[13],可通过线粒体途径诱导细胞凋亡，Fas介入华而不实。Bcl-2是主要的凋亡抑制因子，通过维持线粒体外膜的完好性，抑制线粒体凋亡途径的启动[14]。Bax是Bcl-2的同源基因，其高表示出可促进细胞凋亡，加速DAH中肺组织损伤。Bcl-2可与Bax竞争性结合，抑制Bax活化，进而有效抑制细胞凋亡[15]。凋亡因子caspase-3介入细胞的生长、分化和凋亡，其表示出上调可促进肺组织病变的发生和发展[16]。caspase-3是内源性凋亡途径和外源性凋亡途径的共同执行蛋白，caspase-3表示出加强可作为启动凋亡的重要标志[17]。本研究结果显示，模型组肺组织Bax、caspase-3蛋白相对表示出量高于对照组和依托泊苷组，Bcl-2蛋白相对表示出量低于对照组和依托泊苷组；依托泊苷组小鼠肺组织Bax、caspase-3、Bcl-2蛋白相对表示出量高于对照组；讲明采用依托泊苷治疗的DAH小鼠肺组织Bax、caspase-3蛋白表示出降低，Bcl-2表示出增高；提示依托泊苷可通过促进线粒体诱导的凋亡途径中抑制凋亡因子Bcl-2表示出减轻细胞凋亡，通过降低caspase-3表示出抑制凋亡的启动，进而减轻肺损伤。本研究结果显示，依托泊苷对DAH有明显治疗效果，其机制可能是调节Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表示出，进而减轻肺组织细胞凋亡。DAH属本身免疫性疾病，在临床中多采用激素和免疫抑制剂进行治疗，仅部分有效，停药后易复发，无特效治疗方式方法。依托泊苷在DAH小鼠模型中的疗效可为临床DAH治疗提供新的方向，可以能扩宽依托泊苷在临床中的应用。以下为参考文献[1]MITTOOS,FELLCD.Pulmonarymanifestationsofsystemiclupuserythematosus[J].SeminRespirCritCareMed,2020,35(2):249-254.[2]PROSTND,PARROTA,CUQUEMELLEE,etal.Diffusealveolarhemorrhageinimmunocompetentpatients:etiologiesandprognosisrevisited[J].RespirMed,2020,106(7):1021-1032.[3]SANTOS-OCAMPOAS,MANDELLBF,FESSLERBJ.Alveolarhemorrhageinsystemiclupuserythematosus:presentationandmanagement[J].Chest,2000,118(4):1083-1090.[4]BARKERTT,LEEPY,KELLY-SCUMPIAKM,etal.PathogenicroleofBcellsinthedevelopmentofdiffusealveolarhemorrhageinducedbypristane[J].LabInvest,2018,91(10):1540-1550.[5]SMITHS,WUPW,SEOJJ,etal.IL-16/miR-125aaxiscontrolsneutrophilrecruitmentinpristane-inducedlunginflammation[J].JCIInsight,2021,3(15):e120798.[6]STOOTSSA,LIEFL,ERKAND.Clinicalinsightsintodiffusealveolarhemorrhageinantiphospholipidsyndrome[J].CurrRheumatolRep,2022,21(10):56.[7]SEFSAFIZ,HASBAOUIBE,KILIA,etal.Macrophageactivationsyndromeassociatedwithgriscellisyndrometype2:casereportandreviewofliterature[J].PanAfrMedJ,2021,29:75.[8]KOBAYASHIR,TANAKAJ,HASHINOS,etal.Etoposide-containingconditioningregimenreducestheoccurrenceofhemophagocyticlymphohistiocytosisafterSCT[J].BoneMarrowTransplant,2020,49(2):254-257.[9]CHOWDHARYVR,GRANDEJP,LUTHRAHS,etal.Characterizationofhaemorrhagicpulmonarycapillaritis:anothermanifestationofpristane-inducedlupus[J].Rheumatology(Oxford),2007,46(9):1405-1410.[10]张伟，包慎，马燕萍，等.急性早幼粒细胞白血病并发弥漫性出血性