沉淀法教学讲解课件

第四章沉淀法(precipitation)第四章沉淀法1生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(沉淀/超过滤/萃取)纯化(层析、离子交换、吸附)脱盐(凝胶过滤、超滤)浓缩(超滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内2第一节沉淀法概述第二节盐析法第三节有机溶剂沉淀法第四节等电点沉淀法第五节其他沉淀方法第六节沉淀法应用本章主要内容第一节沉淀法概述本章主要内容3一、沉淀法的概念利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。第一节概述一、沉淀法的概念第一节概述4二、沉淀法的目的浓缩；有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步纯化；将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。二、沉淀法的目的浓缩；5三、沉淀法操作步骤①首先加入沉淀剂；②沉淀剂的陈化，促进粒子生长；③离心或过滤，收集沉淀物。三、沉淀法操作步骤6四、沉淀生成动力学溶解度降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：①热运动，Bromnian运动；②对流运动，由机械搅拌产生；③差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。四、沉淀生成动力学7为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过程分成下述６个步骤：(1)初始混合(2)新相生成(3)布朗运动凝集(4)机械碰撞凝集(5)聚集体陈化(6)聚集体沉淀为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过程分成下述６个步骤：8沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。优点：操作简单、经济、浓缩倍数高缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强五、沉淀法的特点沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛9六、沉淀法的分类根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）复合盐沉淀法等（7）亲和沉淀法（8）选择性沉淀法。六、沉淀法的分类根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：10七、蛋白质的溶解特性在水溶液中，疏水残基具有向内部折叠的趋势，部分暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。亲水残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。七、蛋白质的溶解特性在水溶液中，疏水残基具有向内部折叠的趋111、蛋白质周围的水化层（hydrationshell)，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质形成稳定的胶体溶液。1、蛋白质周围的水化层（hydrationshell)，保122、蛋白质分子间静电排斥作用。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。2、蛋白质分子间静电排斥作用。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子13第二节盐析

Saltinducedprecipitation第二节盐析

Saltinducedprecipitat14一、盐析的概念在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。盐析是可逆的，而变性是不可逆的。一、盐析的概念在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分15二、盐析法机理（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。二、盐析法机理（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加16中性盐盐析法机理示意图中性盐盐析法机理示意图17三、盐析过程

当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大。（2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降。三、盐析过程当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两18第四章-沉淀法课件19盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济四、影响盐析的因素1、盐析用盐的选择盐析作用要强四、影响盐析的因素1、盐析用盐的选择20在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱。柠檬酸＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-NH4+＞K+＞Na+＞高价阳离子阴离子的影响大于阳离子。在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一21盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂。（1）价廉；（2）溶解度大；（3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好；（4）不易引起蛋白质变性。

缺点：（1）水解变酸；（2）高pH释氨，腐蚀；（3）残留产品有影响。盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠缺点：22

由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：

几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它231）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；速度不能太快，分批加入。搅拌需适中。2）加入饱和溶液法用于饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3）透析平衡法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；24一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。2、盐浓度对盐析效果的影响

一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。2、盐浓度对盐析25第四章-沉淀法课件26㏒S=β-ＫsＩS—蛋白质的溶解度，g/L;I－离子强度，I=1/2∑mizi2

mi—离子i的摩尔浓度；Zi—所带电荷β—常数，图中截距Ks—盐析常数，图中直线斜率Cohn经验式

蛋白质溶解度与盐浓度的关系㏒S=β-ＫsＩCohn经验式

蛋白质溶解度与盐浓度的关系27β和Ks的物理意义β—β代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；Ks—盐析常数，代表图中直线的斜率；Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不大。β和Ks的物理意义28用盐析法分离蛋白质的二种方法第一类叫Ks分段盐析法，在一定pH和温度下通过改变离子强度实现，（固定pH，温度，改变盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液。第二种叫β分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。用盐析法分离蛋白质的二种方法第一类叫Ks分段盐析法，在一定p29盐析用盐量的确定-饱和度（Saturation）：以硫酸铵为例：25℃时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L定义为100%饱和度。对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于0.1mg/L，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%-60%之间。盐析用盐量的确定-饱和度（Saturation）：以硫酸铵为30原蛋白溶液体积为V，欲使其硫铵饱和度达到S，需加入饱和硫酸铵溶液的体积数？X=V×S/(1-S)

X：应加入的饱和硫铵溶液的体积V：原蛋白质的溶液的体积S：应达到的硫铵饱和度原蛋白溶液体积为V，欲使其硫铵饱和度达到S，需加入饱和硫酸铵31原蛋白溶液饱和度为S1，现饱和度增加为S2，需加入多少饱和硫酸铵溶液?X=V×(S2-S1)/(1-S2)X：应加入的饱和硫铵体积V：原有溶液的体积S1：原溶液硫铵的饱和度S2：要达到的硫铵的饱和度原蛋白溶液饱和度为S1，现饱和度增加为S2，需加入多少饱和硫32加固体硫铵的方法加饱和硫铵溶液会使溶液体积增大或使蛋白质浓度降低，因此加入固体硫铵比较适合。在20℃时使1LM1摩尔浓度时（NH4）2SO4溶液增至M2摩尔浓度，所需加入（NH4）2SO4的克数C：

C=533（M2-M1）/(4.05-0.3M2)

C：需加硫铵的g数 M1：原溶液的浓度摩尔数 M2：需达到的浓度摩尔数加固体硫铵的方法加饱和硫铵溶液会使溶液体积增大或使蛋白质浓度33在20℃时使1LS1饱和度时（NH4）2SO4溶液增至S2饱和度，所需加入（NH4）2SO4的克数：C=533（S2-S1）/(100-0.3S2)

C：需加硫铵的g数S1：原溶液的饱和度S2：需达到的饱和度在20℃时使1LS1饱和度时（NH4）2SO4溶液增至S34以上数据都可在有关书上查到

以上数据都可在有关书上查到35204060800100总蛋白目标蛋白质上清液蛋白浓度由于不同的蛋白质溶解度不同，沉淀时所需的离子强度也不相同，如果需要先除去些杂蛋白，然后在较高的饱和度下，沉淀目标蛋白质，则可采用分段盐析改变盐的浓度，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开。分段盐析(fractionalsaltingout)204060800100总蛋白目标蛋白质上清液蛋白浓度由于不36在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度达35％时，尿素酶基本上仍留在溶液中；而饱和度达55%时，尿素酶几乎全都沉淀出来。在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度达35％时，尿素酶基373、pH值一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液pH值调到目的蛋白的等电点处。3、pH值一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越38在进行盐析时，必须控制pH图中直线都相互平行在进行盐析时，必须控制pH394、温度的影响在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度随温度增加而增加。但在高浓度下，溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。β随温度升高减小，热促失水膜Ks不随温度而变4、温度的影响在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度随温度增加而405、蛋白质浓度沉淀蛋白质盐的浓度范围并不固定，而和起始浓度有关。高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25mg/mL～30mg/mL。5、蛋白质浓度沉淀蛋白质盐的浓度范围并不固定41起始浓度30g/L的COMb，大部分蛋白质在58-65％饱和度沉淀；稀释10倍的COMb溶液，饱和度达到66%才开始沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。起始浓度30g/L的COMb，大部分蛋白质在58-65％饱和42五、盐析注意事项选择适宜饱和度采用分步盐析盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH用磷酸缓冲液加盐缓慢均匀，搅拌缓慢，以免局部浓度过高，致酶失活。盐析后最好缓慢搅拌1h，再在冰浴中放置一段时间。为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。盐析蛋白尽快脱盐处理，以免变性，透析慢，用超滤。五、盐析注意事项选择适宜饱和度43盐析注意事项——硫酸铵的使用硫酸铵中含有少量的重金属离子，对巯基敏感，H2S处理高浓度的硫酸铵呈酸性（pH=5.0左右），用氨水调pH。硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意。固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；盐析后一般放置0.5-1h后过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。盐析注意事项——硫酸铵的使用硫酸铵中含有少量的重金属离子，对44六、盐析法特点成本低，不需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。

六、盐析法特点成本低，不需要特别昂贵的设备。45第三节等电点沉淀法

Isoelectricpointprecipitation第三节等电点沉淀法

Isoelectricpointp46蛋白质属于两性电解质，溶液pH值高，蛋白质带负电；pH值低，带正电。当溶液的pH值为某一值时，蛋白质几乎不带电，即净电荷为零，这时的pH值为等电点，常用pI表示。两性电解质在溶液中pH处于等电点pI时，分子表面静电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低并沉淀析出。一、等电点沉淀的原理蛋白质属于两性电解质，溶液pH值高，蛋白质带负电；pH值低，47不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。pH=pI不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。pH48第四章-沉淀法课件49①等电点沉淀法操作十分简便，试剂消耗少，给体系引入的外来物(杂质)也少。是一种常用的分离纯化方法。②收率低：等电点附近（处）仍有一定的溶解度，(有时甚至比较大)，沉淀不完全。等电点沉淀法往往不能获得高的回收率。很少单独使用，与盐析，有机溶剂沉淀等结合使用。二、等电点沉淀的特点①等电点沉淀法操作十分简便，试剂消耗少，给体系引入的外来物(50③分辨率较低：许多分子的等电点比较接近，容易共沉淀，分辨率较低。主要用于去杂蛋白。最大缺点：无机酸有引起较大的蛋白质不可逆变性的危险。③分辨率较低：许多分子的等电点比较接近，容易共沉淀，分辨率较51三、等电点沉淀注意事项(1)生物高分子的等电点易受盐离子的影响发生变化。由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”。阳-高，阴-低。三、等电点沉淀注意事项52(2)目的物的稳定性。有些蛋白质或酶在等电点附近不稳定。如α-糜蛋白酶(pI=8.1～8.6)，胰蛋白酶(pI=10.1)，它们在中性或偏碱的环境中由于自身或其他蛋白水解酶的作用而部分降解失活。(3)生物大分子在等电点附近盐溶作用很明显。单独使用或与溶剂沉淀法合用，控制离子强度。(2)目的物的稳定性。53第四节有机溶剂沉淀法

organicsoventprecipitation第四节有机溶剂沉淀法

organicsoventpre54在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。一、有机溶剂沉淀法的概念在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解55许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。pH4.8时人白蛋白在乙醇-水溶液中的溶解度许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙56二、有机溶剂沉淀的特点1、优点1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易。二、有机溶剂沉淀的特点1、优点572、缺点1）对生物活性大分子容易引起变性失活；2）操作要求在低温下进行。3）成本高。总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。2、缺点58三、有机溶剂沉淀法机理

A降低溶剂介电常数（介电常数D有机<D水）

，减小溶剂极性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加带电粒子间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。B破坏水化膜：使用的有机溶剂与水互溶，从蛋白质分子周围的水化层中夺走水分子，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。C相反力：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。三、有机溶剂沉淀法机理A降低溶剂介电常数59有机溶剂沉淀法机理降低介电常数破坏水化膜有机溶剂沉淀法机理降低介电常数60四、常用的有机溶剂沉析剂1、选择依据水溶性要好，一般与水无限混溶。沉淀作用要强，介电常数要小。致变性作用要小。毒性要小、挥发性适中。沸点过低有利于除去和回收，但挥发损失较大，且不安全。给劳动保护及安全生产带来麻烦。容易获取。四、常用的有机溶剂沉析剂612、常用的有机溶剂沉淀剂沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂。2、常用的有机溶剂沉淀剂623、有机溶剂沉淀剂的特点乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析。丙酮：沉析作用大于乙醇，用量小。代替乙醇可减少用量1/4-1/3，但沸点低、挥发大、着火点低、对肝脏有一定毒性。应用范围不广。甲醇：沉析作用与乙醇相当，对蛋白质的变性作用比乙醇和丙酮都小，但口服有强毒，限制了使用。3、有机溶剂沉淀剂的特点乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，63不同溶质的介电常数水8020％乙醇7040％乙醇6060％乙醇48100％乙醇242.5mol/L甘氨酸1375mol/L尿素91丙酮22甲醇332.5mol/L甘氨酸的介电常数很大，可以用作蛋白质等生物高分子溶液的稳定剂。不同溶质的介电常数水802.5mol/L甘氨酸的介电常64五、溶剂浓度的计算

V=V0(S2-S1)/(100-S2)

V--需加入的有机溶剂的体积；Vo--原溶液体积；S1--原溶液中有机溶剂的浓度；S2--需达到的有机溶剂的浓度；该公式未考虑混合后体积的变化，实际上等体积的乙醇和水相混后体积会缩小5％，如此的体积变化对大多数工作影响不大，在有精确要求的场合可按摩尔比计算，这样可将体积变化因素抵消。五、溶剂浓度的计算V=V0(S2-S1)/(651、温度低温有利于防止溶质变性；有机溶剂与水混合产热，体系温度升高，蛋白质变性。因此，务必要控制在低温下。低温提高收率（温度越低，溶解度越小）。有的情况下，把沉淀后清液的温度降低可沉淀出另一种产品，这就是温差分级沉淀。六、有机溶剂沉淀法的影响因素1、温度六、有机溶剂沉淀法的影响因素66A、预冷：将溶液和有机溶剂分别预冷。后者最好预冷至-10～-20℃，操作时应不断搅拌。搅拌一方面是散热，另一方面防止溶剂局部过浓引起的变性和分辨率下降。溶剂的加入速度也须控制，不宜太快。B、短时间的老化处理：为减少溶剂的变性作用，通常使沉淀在低温下作短时间的老化处理（0.5-2h）即离心分离，减少有机溶剂与目的产物的接触。

控制温度的具体做法：控制温度的具体做法：672、pH适宜的pH提高产品的收率和分辨率。许多蛋白质在等电点附近有较好的沉淀效果，但不是所有的蛋白质，少数蛋白质等电点附近不稳定。注意：使溶液中大多数蛋白质带相同电荷，不要让目的物与主要杂质分子带相反电荷，以致出现较严重的共沉作用。2、pH683、离子强度

较低离子强度有利于沉淀，保护蛋白质，防止变性，减少水和溶剂相互溶解及稳定介质pH。离子强度0.01-0.05mol/L，不超过5%。离子强度过高溶剂用量大，沉淀物还夹带盐多。3、离子强度694、样品浓度样品稀增加溶剂投入量和损耗，降低溶质收率，易产生稀释变性，但共沉作用小，分离效果好。浓的样品增强共沉作用，降低分辨率，减少溶剂用量，但回收率提高，变性的危险性小。蛋白质的初浓度0.5%～2%，粘多糖则1%～2%。4、样品浓度705、金属离子助沉作用一些金属离子如Zn2+，Ca2+等可与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物。复合物的溶解度降低不影响活性，有利于沉淀，降低溶剂耗量。0.005-0.02mol/L的Zn2+可减少溶剂用量l/3-1/2，要避免与金属离子形成难溶盐的阴离子的存在(如磷酸根)。5、金属离子助沉作用71第五节其他沉淀法在生化制备中经常使用的沉淀方法还有成盐沉淀法、变性沉淀法和共沉淀法。所使用的沉淀剂有金属盐、有机酸类、表面活性剂、离子型或非离子型的多聚物、变性剂或其他一些化合物。第五节其他沉淀法在生化制备中经常使用的沉淀方法还有成盐沉淀721、概述非离子多聚物20世纪60年代发展，最早用于提纯免疫球蛋白(IgG)和沉淀一些细菌与病毒，近年用于核酸和酶的分离纯化。聚乙二醇（PEG）、壬苯乙烯化氧（NPEO）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯。一、非离子型聚合物1、概述一、非离子型聚合物732、常用的非离子型聚合物——聚乙二醇结构式：HO-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH相对分子质量从200D到20KDa的的产品都有效。通常使用PEG-6000或PEG-4000。2、常用的非离子型聚合物——聚乙二醇743、PEG沉淀蛋白质的特点优点：1、室温；2、沉淀的颗粒大，产物容易收集；3、非但不使蛋白质变性，而且提高稳定性。缺点：1、难去除，需用超滤和液－液萃取。2、价格较昂贵。3、PEG沉淀蛋白质的特点75（1）两种水溶性非离子多聚物组成液-液两相系统。生物大分子或微粒在两相系统不等量分配而分离。主要基于不同生物分子和微粒表面结构不同，有不同分配系数。并外加离子强度，pH值和温度等因素的影响，增强分离效果。4、非离子多聚物沉淀生物大分子和微粒的方法（1）两种水溶性非离子多聚物组成液-液两相系统。4、非离子多76（2）选用一种水溶性非离子多聚物。生物大分子或微粒在同一液相，由于被排斥相互凝集而沉淀析出。先离心除去粗大悬浮颗粒，调整溶液pH值和温度，加入中性盐和多聚物至一定浓度，冷贮一段时间，即形成沉淀。（2）选用一种水溶性非离子多聚物。77蛋白质浓度对用PEG6000沉淀酵母醇脱氢酶时的影响蛋白质浓度对用PEG6000沉淀酵母醇脱氢酶时的影响78吸附法乙醇沉淀法盐析法5、沉淀中杂质的去除吸附法5、沉淀中杂质的去除79吸附法沉淀物溶于磷酸缓冲液用DEAE-纤维素离子交换剂吸附蛋白质蛋白质再用KCl洗脱透析脱盐PEG不被吸附而除去乙醇沉淀法沉淀物溶于磷酸缓冲液用20%乙醇沉淀蛋白质离心（PEG留在上清液）

盐析法沉淀物溶于磷酸缓冲液用35%硫酸铵沉淀蛋白质PEG留在上清液吸附法沉淀物溶于磷酸缓冲液用DEAE-纤维素离子交换剂吸附蛋80二、聚电解质沉淀聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物。可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成多分子络合物发生沉淀。二、聚电解质沉淀聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物。81高分子量聚电解质沉淀——架桥机理低分子量聚电解质沉淀——电荷中和作用。聚电解质过量，导致蛋白质重新溶剂化。

高分子量聚电解质沉淀——架桥机理82三、成盐类复合物沉淀此类沉析剂有以下三种：（1）高价金属盐：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+ 与酸性基团结合；（2）苦味酸盐、单宁酸盐、苦酮酸盐等，与碱性基团结合（3）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性，需采用较温和的条件，有时还需加一定的稳定剂。三、成盐类复合物沉淀此类沉析剂有以下三种：83１、金属离子沉淀金属离子与蛋白质分子中的特殊部位反应。例如锌易与组氨酸残基中咪唑基结合，从而降低蛋白质的溶解度。Zn2+用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。Ca2+（CaCO3）分离乳酸，血清蛋白和柠檬酸。硫酸钡在柠檬酸生产中去除重金属。MgSO4用以去除DNA和其他核酸。１、金属离子沉淀金属离子与蛋白质分子中的特殊部位反应。例如锌84金属离子沉淀蛋白质①能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Ｃo2+、Ni2+、Ｃu2+、Zn2+、Cd2+;②能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如：Ca2+

、Ba2+、Mg2+、Pb2+;③能巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：Ｈg2+、Ag+、Pb2+。金属离子的浓度常为0.02mol/L。去除可用离子交换法或EDTA。金属离子沉淀蛋白质①能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化85例：

调pH4.2上清液胰岛素粗品溶液30%丙酮沉淀（杂蛋白）调pH6.0上清液Zn2+胰岛素锌盐↓例：862、有机酸复合盐法含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能够与生物分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。但常常发生不可逆的沉淀反应。应用此法应采取温和的条件，有时加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。2、有机酸复合盐法87（1）丹宁酸（鞣酸）广泛存在于植物界，其分子结构为5-双没食子酸酰基葡萄糖，为多元酚类化合物。分子上有多个羧基和羟基。由于蛋白质分子中有许多氨基、亚氨基和羧基等，这样就在蛋白质分子与丹宁分子间形成为数众多的氢键而结合在一起，从而生成巨大的复合颗粒沉淀下来。（1）丹宁酸（鞣酸）88第四章-沉淀法课件89丹宁与蛋白质的结合相对比较牢固。多采用竞争结合法。即选用比蛋白质更强的结合剂与丹宁结合，使蛋白质游离释放出来。竞争性结合剂有乙烯氮戊环酮(PVP)、聚乙二醇、聚氧化乙烯及山梨糖醇甘油酸酯等。丹宁与蛋白质的结合相对比较牢固。90（2）雷凡诺(2-乙氧基-6,9-氨基吖啶乳酸盐)，一种吖啶染料

与蛋白质作用主要通过形成盐的复合物而沉淀的。此种染料对提纯血浆中γ-球蛋白有较好效果。（2）雷凡诺(2-乙氧基-6,9-氨基吖啶乳酸盐)，一种吖啶91(3)三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质迅速而完全，一般会引起变性。低温短时间可使有些较稳定的蛋白质或酶保持活力。此法多用于目的物比较稳定且分离杂蛋白相对困难的场合，如分离细胞色素C工艺。(3)三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质迅速而完全，一般会引起变性92第四章-沉淀法课件933、无机复合盐法如磷钨酸盐、磷钼酸盐等，复合物溶解度很低。常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用时必须谨慎。若沉淀为金属复合盐，可通以H2S；若为有机酸盐、磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃取或用离子交换法除去。3、无机复合盐法94四、亲和沉淀

affinityprecipitation

亲和沉淀沉淀原理与通常的沉淀有很大的不同。利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。四、亲和沉淀

affinityprecipitatio95第四章-沉淀法课件96蛋白质配体载体胰蛋白酶对-氨基苯脒苯甲基聚丙烯酰胺小麦胚芽凝集素N-乙酰半乳糖胺亚单位壳聚糖乳酸脱氢酶汽巴克弄蓝葡聚糖亲和沉淀纯化蛋白质的实例蛋白质配体载体胰蛋白酶对-氨基苯脒苯甲基聚丙烯酰胺小麦胚芽凝97五、选择性变性沉淀法1、选择性变性沉淀法的概念选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。五、选择性变性沉淀法1、选择性变性沉淀法的概念982、选择性变性沉淀法的原理利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。2、选择性变性沉淀法的原理993、选择性变性沉淀法的方法1）利用表面活性剂或有机溶剂引起变性；2）利用对热的不稳定性，加热破坏某些组分，而保存另一些组分；3）酸碱变性。3、选择性变性沉淀法的方法1004、选择性分离核酸酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等，目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，用苯酚-水溶液提取核酸，DNA、RNA在水溶液中，而蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去；4、选择性分离核酸酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等，目的是使核酸和101在DNA、RNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA，而RNA留在溶液中。硫酸链霉素和鱼精蛋白沉淀核酸：硫酸链霉素和鱼精蛋白为多价阳离子，带有大量正电荷，可使带大量负电荷的核酸发生直接沉淀。由于成本偏高，加之沉淀后分离较困难，使用不多。在DNA、RNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA，而R102从氨基酸混合液中提取特指氨基酸，除采用等电点沉淀、柱层析外还可使用一些特殊的沉淀剂。从猪血纤维水解液中制取组氨酸时，用氯化汞使其形成汞盐析出。沉淀通入H2S，组氨酸游离。从酵母酸性提取液分离谷胱甘肽，先生成亚铜盐沉淀，然后以H2S解析，再用丙酮沉淀。5、氨基酸类沉淀剂从氨基酸混合液中提取特指氨基酸，除采用等电点沉淀、柱层析外还103苯甲醛沉淀精氨酸邻二甲基苯磺酸沉淀亮氨酸苯偶氮苯磺酸沉淀丙氨酸和丝氨酸2,4-二硝基萘酚-7-磺酸沉淀精氨酸二氨合硫氰化铬氨沉淀脯氨酸和羟脯氨酸苯甲醛沉淀精氨酸1046、分离粘多糖的沉淀剂

乙醇十六烷基三甲基季胺溴化物(简称为CTAB)，十六烷基氯化吡啶（阳离子表面活性剂）6、分离粘多糖的沉淀剂（阳离子表面活性剂）105季胺基与粘多糖形成季胺络合物。低离子强度水溶液不溶解，溶液离子强度增加至一定范围，络合物则逐渐解离，最后溶解。此外，CTAB对各种粘多糖的分级沉淀效果与各种粘多糖硫酸化程度和溶液pH值有关。CTAB的沉淀效力极强，能从很稀的溶液中(如万分之一浓度)通过选择性沉淀回收粘多糖。季胺基与粘多糖形成季胺络合物。低离子强度水溶液不溶解，溶液离106各种沉淀方法应用范围盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。多与其它方法结合使用。非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。生成盐复合物沉淀：用于多种物质(特别是小分子)选择性沉淀（热/酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。各种沉淀方法应用范围盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。107第六节沉淀法应用第六节沉淀法应用108沉淀法应用酵母醇脱氢酶的分段盐析尿激酶的沉淀分离沉淀法大规模提纯血浆蛋白胰蛋白酶的提取柠檬酸的提取四环素的提取生活例子：咸鸭蛋沉淀法应用酵母醇脱氢酶的分段盐析1091、分段盐析法分离酵母醇脱氢酶过滤液经过30%丙酮沉淀杂蛋白后，然后进行分段盐析1、分段盐析法分离酵母醇脱氢酶过滤液经过30%丙酮沉淀杂蛋白110分段盐析法分离酵母醇脱氢酶丙酮沉淀杂蛋白后粗酶的比活上升4.94倍．分段盐析中饱和度在50％～55％区段中析出的组分与粗酶相比其比活上升9.62倍，工艺优点：丙酮沉淀杂蛋白后，再加大丙酮浓度使粗酶沉淀的过程,如果不在低温下逐滴加入冷丙酮，酶活力极易丢失。而盐析中，硫酸铵的加入会稳定蛋白质的构象，使之难于变性,所以在分段盐析中酶的总活力很少丢失。分段盐析可以多次重复进行，以便纯化倍数提高。但有机溶剂沉淀法易使蛋白质变性，不易反复使用。分段盐析法分离酵母醇脱氢酶丙酮沉淀杂蛋白后粗酶的比活上升4.1112．尿激酶的沉淀分离尿激酶：分离方法包括沉淀法、吸附法、层析法沉淀法：金属离子形成复合盐脱盐盐析2．尿激酶的沉淀分离尿激酶：分离方法包括沉淀法、吸附法、层析112Zn离子沉淀尿激酶低浓度时，zn能选择沉淀尿激酶。在3mM可得85-92回收率，而沉淀物的量并不多；加大Zn浓度虽然能提高有限回收率，但沉淀物量大，纯度降低。沉淀量酶活Zn离子沉淀尿激酶低浓度时，zn能选择沉淀尿激酶。在3m113EDTA溶出效应EDTA溶出效应114硫酸铵替代EDTA将20g／L硫酸铵(氨水调pH)按1:4溶出UK尿激酶等电点9.5硫酸铵替代EDTA将20g／L硫酸铵(氨水调pH)按1:4115硫酸铵溶解尿激酶锌络合物硫酸铵的选用1)它在低浓度时可能有盐溶作用，促进沉淀蛋白溶解；2)因为本身有NH4+，与Zn2+有络合作用，有利于沉淀物溶解；3)硫酸铵为盐析所用，在最终盐析中，只需补加规定量即可，而不引入其他成分。硫酸铵溶解尿激酶锌络合物硫酸铵的选用116尿激酶盐析沉淀沉淀量回收率纯度尿激酶盐析沉淀沉淀量回收率117目前国际上通用的血浆蛋白分离方法是采用传统的低温乙醇工艺，此工艺经多方验证和几十年的临床实践证明是安全、有效的。利用乙醇的低介电常数性质以及不同蛋白质在一定温度、pH、离子强度及浓度下在不同浓度乙醇中溶解度不同来分离血浆蛋白，生产出多种血浆医用蛋白，成为著名的Cohn乙醇沉淀法可将血浆蛋白分离为Ⅰ～Ⅴ个组分。常利用Ⅰ(纤维蛋白原)、Ⅱ(免疫球蛋白)、Ⅴ(白蛋白)3个组分。3、利用沉淀法大规模提纯血浆蛋白目前国际上通用的血浆蛋白分离方法是采用传统的低温乙醇工艺，此118利用沉淀法提纯白蛋白与免疫球蛋白血浆PH6/Pr5%I0.14/T-4/E20%过滤过滤液IV沉淀I+II+III滤液IV沉淀(I+II+III)PH6/Pr2.4%I0.09/T-5/E40%过滤沉淀滤液VPH4.8/Pr1.2%/I0.09T-7/E40%沉淀V(白蛋白)滤液过滤PH5.2/Pr1.0%I0.01/T-4/E14%过滤沉淀滤液PH7.1/Pr0.4%/I0.05T-6/E25%沉淀II(球蛋白)滤液过滤利用沉淀法提纯白蛋白与免疫球蛋白血浆PH6/Pr5%I0.1194、胰蛋白酶的提取从动物胰脏中提取胰蛋白酶工艺胰蛋白酶原的溶解：酸性条件下稳定溶解液中含有大量的酸性杂蛋白（pI10.8)浓缩分离胰蛋白酶原（盐析）溶解激活（酶原-酶）胰蛋白酶的进一步分离：酶溶液中糜蛋白弹性蛋白等与胰蛋白酶在不同的盐浓度下溶解度不同4、胰蛋白酶的提取从动物胰脏中提取胰蛋白酶工艺120胰蛋白酶的提取（二）胰蛋白酶原激活滤饼溶解,加入无水CaCl2,边加边搅拌,最终含有0.1MCaCl2；5MNaOH调pH至8.0,加极少量胰酶搅拌，于室温下活化8～10小时；活化完成，用2.5MH2SO4调pH至2.5-3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。（一）猪胰蛋白酶原的提取胰脏绞碎加入2倍体积冷乙酸(pH2.5)低温搅拌24小时，过滤；滤液用2.5MH2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后，用滤纸过滤；滤液加入硫酸铵,达0.75饱和度放置过夜抽滤，得酶原粗制品。（三）胰蛋白酶的分离将激活溶液加入固体硫酸铵,达0.4饱和度,数小时后抽滤弃滤饼。滤液加入硫酸铵，饱度达到0.75，放置数小时，抽滤弃滤液，即得胰蛋白酶粗品。胰蛋白酶的提取（二）胰蛋白酶原激活（一）猪胰蛋白酶原的提取（1215、柠檬酸的生产柠檬酸是一种重要的有机酸，它在食品、医药、化工、皮革、环保等工业部门都有广泛的用途。目前柠檬酸极大多数是通过微生物发酵法（黑曲霉）生产，提取工艺中，目前大多通过沉淀法制备（碳酸钙沉淀及硫酸酸解）

CH2—COOHHO—CH2—COOHCH2—COOH5、柠檬酸的生产柠檬酸是一种重要的有机酸，它在食品、医药、化122标准沉淀法回收柠檬酸流程图加热到70度pH1.8~2.0

过滤标准沉淀法回收柠檬酸流程图加热到70度pH1.8~2.0过123柠檬酸提取新工艺的主要种类

钙盐法因工艺成熟、设备简单、原材料易得和产品质量稳定等特点而在国内外被广泛使用。缺陷：单元操作多，总收率低；消耗化工原料多，固液分离能耗高；环境污染严重。我国近几年在非钙盐法的提取工艺，取得了实质性突破。已进行过中试或生产规模的技术有三类：（1）中科院和阜阳柠檬酸厂合作的“工业离子色谱法”（2）江南大学的“连续变温逆流色谱分离法”；（3）天津科技大学的“吸附交换分离法”。

柠檬酸提取新工艺的主要种类钙盐法因工艺成熟、设备简单、原材1246、四环素的沉淀提取四环素由链丝菌发酵获得四环素等电点pI=5。当溶液的pH等于等电点时，四环素易从水溶液中沉淀出来（游离碱），因此可用于四环素的提取。四环素又能与尿素形成1：1的复盐，从水溶液中沉淀出来，该复盐溶于有机溶剂时，即分解成四环素和尿素。四环素与尿素的这一反应具有特异性：金霉素，土霉素都不能与尿素形成复合物沉淀。利用这一性质，可精制四环素。6、四环素的沉淀提取四环素由链丝菌发酵获得125四环素发酵液预处理加草酸酸化至PH1.7-1.8，分别加0.2％(w/v)黄血盐、硫酸锌过滤滤洗液发酵液滤渣0.5%草酸水顶洗洗液滤液四环素发酵液预处理加草酸酸化至PH1.7-1.8，分别加过滤126第一步沉淀提取沉淀粗碱滤液7000-9000u/ml搅拌下慢慢加入浓氨水调pH4.810-15℃，搅拌30min，过滤第一步沉淀提取沉淀粗碱滤液搅拌下慢慢加入浓氨水调pH4.8127第二步沉淀提取

溶于尿素盐酸溶液中（粗碱干重:尿素:水:浓HCl1:2:2:0.25）

粗碱粗碱尿素溶液沉淀四环素尿素复盐丁醇清液丁醇悬浮溶液溶于酸性丁醇中复盐干重:丁醇:浓HCl＝1:10:0.3(丁醇先，搅拌下滴加HCl)滤去不溶物

浓氨水调pH4.6～4.8搅拌20min，过滤结晶第二步沉淀提取

溶于尿素盐酸溶液中粗碱粗碱尿素溶液沉淀丁醇1287、讨论题：

咸蛋煮熟了，蛋黄里会有油，

这是什么缘故？熟鸭蛋蛋黄中脂肪的含量高达31％，为什么看不到一点油？可是在熟咸蛋的蛋黄中，却经常可以看到黄色的油滴往外流？7、讨论题：

咸蛋煮熟了，蛋黄里会有油，

这是什么缘故？熟鸭129第四章-沉淀法课件130讨论题：

咸蛋煮熟了，蛋黄里会有油，

这是什么缘故？蛋黄中除了脂肪以外，还含有丰富的蛋白质，蛋白质就是一种高明的乳化剂，它能够把蛋黄中的脂肪分散成很小的油滴，这样就骗过了我们的眼睛和舌头。在盐渍过程中，作为乳化剂的蛋白质被盐析出来，乳浊液被破坏了，那些原来分散成极小的油滴，彼此就互相聚集起来，变成大油液，使得整个蛋黄变成油滋滋的，甚至流出油来了。讨论题：

咸蛋煮熟了，蛋黄里会有油，

这是什么缘故？蛋黄中除131思考题：什么是沉淀法，具体包括哪些方法？理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶，盐析盐析的机理是什么？影响盐析的因素有哪些？有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？沉淀蛋白质时应注意哪些事项？何为选择性变性沉淀法？思考题：什么是沉淀法，具体包括哪些方法？132第四章沉淀法(precipitation)第四章沉淀法133生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(沉淀/超过滤/萃取)纯化(层析、离子交换、吸附)脱盐(凝胶过滤、超滤)浓缩(超滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内134第一节沉淀法概述第二节盐析法第三节有机溶剂沉淀法第四节等电点沉淀法第五节其他沉淀方法第六节沉淀法应用本章主要内容第一节沉淀法概述本章主要内容135一、沉淀法的概念利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。第一节概述一、沉淀法的概念第一节概述136二、沉淀法的目的浓缩；有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步纯化；将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。二、沉淀法的目的浓缩；137三、沉淀法操作步骤①首先加入沉淀剂；②沉淀剂的陈化，促进粒子生长；③离心或过滤，收集沉淀物。三、沉淀法操作步骤138四、沉淀生成动力学溶解度降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：①热运动，Bromnian运动；②对流运动，由机械搅拌产生；③差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。四、沉淀生成动力学139为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过程分成下述６个步骤：(1)初始混合(2)新相生成(3)布朗运动凝集(4)机械碰撞凝集(5)聚集体陈化(6)聚集体沉淀为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过程分成下述６个步骤：140沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。优点：操作简单、经济、浓缩倍数高缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强五、沉淀法的特点沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛141六、沉淀法的分类根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）复合盐沉淀法等（7）亲和沉淀法（8）选择性沉淀法。六、沉淀法的分类根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：142七、蛋白质的溶解特性在水溶液中，疏水残基具有向内部折叠的趋势，部分暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。亲水残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。七、蛋白质的溶解特性在水溶液中，疏水残基具有向内部折叠的趋1431、蛋白质周围的水化层（hydrationshell)，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质形成稳定的胶体溶液。1、蛋白质周围的水化层（hydrationshell)，保1442、蛋白质分子间静电排斥作用。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。2、蛋白质分子间静电排斥作用。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子145第二节盐析

Saltinducedprecipitation第二节盐析

Saltinducedprecipitat146一、盐析的概念在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。盐析是可逆的，而变性是不可逆的。一、盐析的概念在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分147二、盐析法机理（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。二、盐析法机理（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加148中性盐盐析法机理示意图中性盐盐析法机理示意图149三、盐析过程

当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大。（2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降。三、盐析过程当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两150第四章-沉淀法课件151盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济四、影响盐析的因素1、盐析用盐的选择盐析作用要强四、影响盐析的因素1、盐析用盐的选择152在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱。柠檬酸＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-NH4+＞K+＞Na+＞高价阳离子阴离子的影响大于阳离子。在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一153盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂。（1）价廉；（2）溶解度大；（3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好；（4）不易引起蛋白质变性。

缺点：（1）水解变酸；（2）高pH释氨，腐蚀；（3）残留产品有影响。盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠缺点：154

由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：

几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它1551）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；速度不能太快，分批加入。搅拌需适中。2）加入饱和溶液法用于饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3）透析平衡法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；156一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。2、盐浓度对盐析效果的影响

一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。2、盐浓度对盐析157第四章-沉淀法课件158㏒S=β-ＫsＩS—蛋白质的溶解度，g/L;I－离子强度，I=1/2∑mizi2

mi—离子i的摩尔浓度；Zi—所带电荷β—常数，图中截距Ks—盐析常数，图中直线斜率Cohn经验式

蛋白质溶解度与盐浓度的关系㏒S=β-ＫsＩCohn经验式

蛋白质溶解度与盐浓度的关系159β和Ks的物理意义β—β代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；Ks—盐析常数，代表图中直线的斜率；Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不大。β和Ks的物理意义160用盐析法分离蛋白质的二种方法第一类叫Ks分段盐析法，在一定pH和温度下通过改变离子强度实现，（固定pH，温度，改变盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液。第二种叫β分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。用盐析法分离蛋白质的二种方法第一类叫Ks分段盐析法，在一定p161盐析用盐量的确定-饱和度（Saturation）：以硫酸铵为例：25℃时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L定义为100%饱和度。对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于0.1mg/L，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%-60%之间。盐析用盐量的确定-饱和度（Saturation）：以硫酸铵为162原蛋白溶液体积为V，欲使其硫铵饱和度达到S，需加入饱和硫酸铵溶液的体积数？X=V×S/(1-S)

X：应加入的饱和硫铵溶液的体积V：原蛋白质的溶液的体积S：应达到的硫铵饱和度原蛋白溶液体积为V，欲使其硫铵饱和度达到S，需加入饱和硫酸铵163原蛋白溶液饱和度为S1，现饱和度增加为S2，需加入多少饱和硫酸铵溶液?X=V×(S2-S1)/(1-S2)X：应加入的饱和硫铵体积V：原有溶液的体积S1：原溶液硫铵的饱和度S2：要达到的硫铵的饱和度原蛋白溶液饱和度为S1，现饱和度增加为S2，需加入多少饱和硫164加固体硫铵的方法加饱和硫铵溶液会使溶液体积增大或使蛋白质浓度降低，因此加入固体硫铵比较适合。在20℃时使1LM1摩尔浓度时（NH4）2SO4溶液增至M2摩尔浓度，所需加入（NH4）2SO4的克数C：

C=533（M2-M1）/(4.05-0.3M2)

C：需加硫铵的g数 M1：原溶液的浓度摩尔数 M2：需达到的浓度摩尔数加固体硫铵的方法加饱和硫铵溶液会使溶液体积增大或使蛋白质浓度165在20℃时使1LS1饱和度时（NH4）2SO4溶液增至S2饱和度，所需加入（NH4）2SO4的克数：C=533（S2-S1）/(100-0.3S2)

C：需加硫铵的g数S1：原溶液的饱和度S2：需达到的饱和度在20℃时使1LS1饱和度时（NH4）2SO4溶液增至S166以上数据都可在有关书上查到

以上数据都可在有关书上查到167204060800100总蛋白目标蛋白质上清液蛋白浓度由于不同的蛋白质溶解度不同，沉淀时所需的离子强度也不相同，如果需要先除去些杂蛋白，然后在较高的饱和度下，沉淀目标蛋白质，则可采用分段盐析改变盐的浓度，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开。分段盐析(fractionalsaltingout)204060800100总蛋白目标蛋白质上清液蛋白浓度由于不168在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度达35％时，尿素酶基本上仍留在溶液中；而饱和度达55%时，尿素酶几乎全都沉淀出来。在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度达35％时，尿素酶基1693、pH值一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液pH值调到目的蛋白的等电点处。3、pH值一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越170在进行盐析时，必须控制pH图中直线都相互平行在进行盐析时，必须控制pH1714、温度的影响在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度随温度增加而增加。但在高浓度下，溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。β随温度升高减小，热促失水膜Ks不随温度而变4、温度的影响在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度随温度增加而1725、蛋白质浓度沉淀蛋白质盐的浓度范围并不固定，而和起始浓度有关。高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25mg/mL～30mg/mL。5、蛋白质浓度沉淀蛋白质盐的浓度范围并不固定173起始浓度30g/L的COMb，大部分蛋白质在58-65％饱和度沉淀；稀释10倍的COMb溶液，饱和度达到66%才开始沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。起始浓度30g/L的COMb，大部分蛋白质在58-65％饱和174五、盐析注意事项选择适宜饱和度采用分步盐析盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH用磷酸缓冲液加盐缓慢均匀，搅拌缓慢，以免局部浓度过高，致酶失活。盐析后最好缓慢搅拌1h，再在冰浴中放置一段时间。为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。盐析蛋白尽快脱盐处理，以免变性，透析慢，用超滤。五、盐析注意事项选择适宜饱和度175盐析注意事项——硫酸铵的使用硫酸铵中含有少量的重金属离子，对巯基敏感，H2S处理高浓度的硫酸铵呈酸性（pH=5.0左右），用氨水调pH。硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意。固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；盐析后一般放置0.5-1h后过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。盐析注意事项——硫酸铵的使用硫酸铵中含有少量的重金属离子，对176六、盐析法特点成本低，不需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。

六、盐析法特点成本低，不需要特别昂贵的设备。177第三节等电点沉淀法

Isoelectricpointprecipitation第三节等电点沉淀法

Isoelectricpointp178蛋白质属于两性电解质，溶液pH值高，蛋白质带负电；pH值低，带正电。当溶液的pH值为某一值时，蛋白质几乎不带电，即净电荷为零，这时的pH值为等电点，常用pI表示。两性电解质在溶液中pH处于等电点pI时，分子表面静电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低并沉淀析出。一、等电点沉淀的原理蛋白质属于两性电解质，溶液pH值高，蛋白质带负电；pH值低，179不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。pH=pI不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。pH180第四章-沉淀法课件181①等电点沉淀法操作十分简便，试剂消耗少，给体系引入的外来物(杂质)也少。是一种常用的分离纯化方法。②收率低：等电点附近（处）仍有一定的溶解度，(有时甚至比较大)，沉淀不完全。等电点沉淀法往往不能获得高的回收率。很少单独使用，与盐析，有机溶剂沉淀等结合使用。二、等电点沉淀的特点①等电点沉淀法操作十分简便，试剂消耗少，给体系引入的外来物(182③分辨率较低：许多分子的等电点比较接近，容易共沉淀，分辨率较低。主要用于去杂蛋白。最大缺点：无机酸有引起较大的蛋白质不可逆变性的危险。③分辨率较低：许多分子的等电点比较接近，容易共沉淀，分辨率较183三、等电点沉淀注意事项(1)生物高分子的等电点易受盐离子的影响发生变化。由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”。阳-高，阴-低。三、等电点沉淀注意事项184(2)目的物的稳定性。有些蛋白质或酶在等电点附近不稳定。如α-糜蛋白酶(pI=8.1～8.6)，胰蛋白酶(pI=10.1)，它们在中性或偏碱的环境中由于自身或其他蛋白水解酶的作用而部分降解失活。(3)生物大分子在等电点附近盐溶作用很明显。单独使用或与溶剂沉淀法合用，控制离子强度。(2)目的物的稳定性。185第四节有机溶剂沉淀法

organicsoventprecipitation第四节有机溶剂沉淀法

organicsoventpre186在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。一、有机溶剂沉淀法的概念在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解187许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。pH4.8时人白蛋白在乙醇-水溶液中的溶解度许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙188二、有机溶剂沉淀的特点1、优点1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易。二、有机溶剂沉淀的特点1、优点1892、缺点1）对生物活性大分子容易引起变性失活；2）操作要求在低温下进行。3）成本高。总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。2、缺点190三、有机溶剂沉淀法机理

A降低溶剂介电常数（介电常数D有机<D水）

，减小溶剂极性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加带电粒子间的