第16章呼肠孤病毒科(Reoviridae)

第十六章呼肠孤病毒科（Reoviridae）概述二、正呼肠孤病毒属（一）哺乳动物呼肠孤病毒（二）禽呼肠孤病毒三、环状病毒属（一）蓝舌病病毒（二）非洲马瘟病毒（三）鹿流行性出血病病毒（四）茨城病病毒（五）马器质性脑病病毒四、轮状病毒属五、COLTI病毒属科罗拉多蜱传热病毒六、水生呼肠孤病毒属草鱼出血病病毒主要参考文献

一、概述同义名：双股核糖核酸病毒科本科的命名是取自3个英文单词的词头组合而成，全称是呼吸道（respiratory）、肠道（enteric）和孤儿（orphan）病毒。于50年代早期，当乳鼠和灵长类的细胞培养开始广泛应用于病毒学实验室时，从人的呼吸道和胃肠道分离出这类病毒，但与任何疾病都不相关，分类鉴定为小RNA病毒。几年以后，发现该病毒的基因组为双股RNA，并分节段。1959年建议命名为呼肠孤病毒，强调了其与疾病的不相关性。但是随后发现，这些病毒也有一定的病原性，一些成员还是某些特定疾病的病原体，因此建议改称呼肠病毒。本书照顾习惯，仍称呼肠孤病毒，也与英文“Reo”相应。在证明呼肠孤病毒的基因组是由若干片段组成的双股RNA后，接着又发现三叶草的伤瘤病毒（Cloverwoundtumourvirus,WTV）也含双股RNA，而且病毒粒子的形态结构极像呼肠孤病毒，从而引起病毒学工作者对双股RNA病毒的极大兴趣。此后，相继在脊椎动物、无脊椎动物、细菌、高等植物和真菌等宿主体内发现了60种以上的双股RNA病毒（虽其形态结构和生物学特性不尽一致）。呼肠孤病毒基因组是双链ＲＮＡ这一重要发现，第一次说明了双链ＲＮＡ可作为稳定的生命形式存在于自然界。1968年，Verwoerd等建议成立一个新的分类学类群，称为“双股核糖核酸病毒”（亦即双股RNA病毒）。1971年，Borden等在原来的呼肠孤病毒群中的某些病毒的负染标本上，发现病毒壳粒呈短粗中空的环状，建议成立环状病毒属。1974年，Flewett等根据犊牛腹泻病毒和婴儿腹泻病毒的形态类似车轮的特点，又提出了“轮状病毒”这一新的病毒名称。1975年，国际病毒命名委员会正式采用这一名称，并于1978年将其列为一个病毒属，而将原来的呼肠孤病毒属提升为科，从而在呼肠孤病毒科下包括呼肠孤病毒属、环状病毒属和轮状病毒属等三个病毒属。1991年，国际病毒分类委员会（ICTＶ）第5次病毒分类报告中新增科州蜱传热（ＣＯＬＴＩ）病毒属及水生呼肠孤病毒属，将呼肠孤病毒科分为呼肠孤病毒亚群（正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、COLTI病毒属、水生动物呼肠孤病毒属)、胞质多角体病毒群（胞质多角体病毒属Cypovirus）、植物呼肠孤病毒亚群1（植物病毒属Phytovirus）、植物呼肠孤病毒亚群2（斐济病毒属Fijivirus）及植物呼肠孤病毒亚群3（建议）。１９９４年ＩＣＴＶ第６次病毒分类报告中，取消了第５次分类报告中的群，统一定位为属，即呼肠孤病毒科下设正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、ＣＯＬＴＩ病毒属、水生呼肠孤病毒属、斐济病毒属Fijivirus、植物呼肠孤病毒属Ｐhytoreovirus及水稻矮缩条叶枯病毒属Oryzavirus。其中正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、COLTI病毒属（科州蜱传热病毒属）及水生呼肠孤病毒属有一些重要的动物病原，本书将分节介绍。本科其它属如胞质多角体病毒属的成员多达150种以上，均是昆虫病毒，代表种为家蚕胞质多角体病毒，是家蚕的重要致病病毒。植物呼肠孤病毒属及斐济病毒属是植物的病毒。此外，还从真菌发现一些结构与呼肠孤病毒类似的病毒，但RNA只有1～3个节段，这些内容不再予以讨论。该科大多数成员的病毒粒子呈廿面体对称，无囊膜，有双层衣壳，内衣壳结构稳定，含32个壳粒，呈廿面体对称，但外衣壳结构差异明显（见正呼肠孤病毒属、环状病毒属和轮状病毒属等）。病毒核酸为线性双股RNA，有10～12个节段，单个节段的分子量02×103～30×103kDa，总分子量为12×103～20×103kDa，大约为病毒粒子总重的14%%～22%。每个RNA节段有一个阅读开放框架，编码一种蛋白质（不需要进一步加工，这区别于双ＲＮＡ病毒科）。病毒粒子有6～10种蛋白质（分子量15×103～155×103Da），包括与核心相关的转录酶和mRNA帽化酶，其中一些蛋白质是糖基化的。完整的病毒粒子的分子量约为120×106Da，在CsCl2中浮密度为136～139g/cm3。病毒在胞浆内复制，有时在感染细胞的胞浆内看到病毒粒子呈类结晶状排列。病毒复制前，胞饮的病毒粒子首先受细胞溶酶体水解酶的作用致使病毒粒子部分脱壳，成为亚病毒颗粒（subviralparticle）。这一过程活化了病毒子携带的转录酶和帽化酶，从而转录出在3'末端没有多聚腺苷酸化而在5'端帽化的mRNA分子，这点是独特的。在病毒粒子转录酶作用下，首先合成正股ＲＮＡ。并不是所有呼肠孤病毒基因组在起始过程中都能转录，只是某些基因（节段）才能起始转录，而其它基因随着病毒早期蛋白的合成而被抑制。每种蛋白的合成分别与每个mRNA分子相联系，并合成反义RNA链，从而产生双股子代RNA分子。这些RNA分子又作为模板转录出更多的mRNA；然而此时的mRNA不被帽化，通过一种未知的机制，这些未帽化的呼肠孤病毒mRNA能优先合成大量的病毒结构蛋白。最后，这些亚病毒颗粒与一些附加蛋白一起完成病毒粒子的成熟。在环状病毒的合成过程中，胞浆内形成规则性的微管样结构。轮状病毒的成熟涉及到单层衣壳进入粗面内质网上囊泡的这一不寻常的出芽过程。因此而形成的伪膜随后移至它处，外衣壳加到囊泡上，由于病毒的主要外衣壳蛋白是糖基化的，它的合成只有当它通过内质网膜时才能完成。由于该科病毒核酸是多节段的，很容易出现基因重组现象，重组频率一般为３%～５%。二、正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）同义名：呼肠孤病毒，呼吸道肠道孤儿病毒，肝脑脊髓膜炎病毒。代表株为呼肠孤病毒3型，成员包括从人、猴、犬、牛分离的呼肠孤病毒１、２、３型以及家禽分离株和纳尔逊海湾病毒（NelsonBayvirus,NBV）。呼肠孤病毒可由许多脊椎动物体内分离到，包括马、牛、猪、绵羊、豚鼠、犬、猫、貂、禽类、蝙蝠以及人、黑猩猩和猴，除了感染啮齿动物和禽外，一般不引起明显的疾病，特别是对成年动物。呼肠孤病毒在动物和人类的某些呼吸道及消化道疾病的发生上，呈现一定的辅助或促进作用。病毒粒子直径约76nm，有92个壳粒，核心直径约52nm，由两层致密的蛋白质衣壳所包裹。在电镜下，核心上具有12个呈5度对称的棘状突起（约5nm），分别从廿面体对称的12个顶上延伸出来，基因节段的转录酶就从该部位释放出来。病毒有三组不同大小的RNA，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分成10个分散的节段，编码10种蛋白质，在翻译过程中再一一裂解。完整病毒的浮密度为1.37g/cm（一）哺乳动物呼肠孤病毒1.形态具有特征的廿面体对称的双层衣壳结构。病毒粒子的核心由核酸基因组及其密切连接的内衣壳构成，其外还有一层外衣壳，无囊膜。完整的病毒粒子直径76nm左右，核心的直径52nm左右，电子显微镜下很容易看到病毒粒子表面的壳粒，外衣壳共92个壳粒，分别由五邻体和六邻体组成，其中80个为六邻体，12个为5邻体，壳粒为长10nm、宽8nm的中空棱状结构。内衣壳呈廿面体5度对称排列。正呼肠孤病毒的外衣壳比较脆弱，易被热和胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）等蛋白水解酶破坏，正是由于这种特性，一般说来，蛋白水解酶能增强病毒在肠道中的感染性，这是由于脱去病毒外衣壳的缘故。内衣壳却很稳定，不仅对热和胰凝乳蛋白酶处理具有较大的抵抗力，而且能耐高浓度的尿素、二甲亚砜（ＤＭＳＯ）和SDS的处理。呼肠孤病毒可在体外培养的敏感细胞内形成胞浆内包涵体，包涵体内具有许多结晶状排列的病毒粒子。将提纯的病毒粒子置于蒸馏水中，可使外衣壳结构疏松，病毒粒子的直径增大。也常见到呼肠孤病毒的空衣壳，这是病毒粒子中缺乏核酸的缘故。2.理化学特性早在1962年，Gomatos等就已证明呼肠孤病毒具有双股RNA，因为感染呼肠孤病毒的L细胞的胞浆内包涵体在DNA酶和RNA酶处理后依然保持感染性，Feulgen染色呈阴性反应，而且这种包涵体在用吖啶橙染色时呈苹果绿色。5氟脱氧尿核苷（FUDR）和5溴脱氧尿核苷（BUDR）等DNA合成抑制剂，不能抑制呼肠孤病毒的增殖。但在病毒增殖的后期，吖啶橙染色可能呈橘红色[ZW(]应用pH4.95的001%吖啶橙液进行染色，双股DNA和双股RNA病毒呈苹果绿色，单股DNA和单股RNA病毒呈橘红色，详见本书第十四章。[ZW)]，从而证明呼肠孤病毒除双股RNA外，同时还有单股RNA的存在。后者是一些低分子量的寡核苷酸，一般认为是病毒不完全转录的产物，约占病毒核酸总量的15%%～20%。这些单股RNA主要分布在病毒粒子核心的外面。正呼肠孤病毒的整个基因组由10个片段的双股RNA组成，节段分子量为05×103～27×103kDa，RNA的总分子量14×103～15×103kDa。在氯化铯中的浮密度为161g/cm3。S20W≈730。RNA含量约占病毒粒子总重的14%，病毒共含3000个寡核苷酸，其长度在2%～20核苷间，核心含44%RNA。G+C含量为44%。双股RNA在78～85℃温度中发生变性，成为对RNA酶敏感的单股RNA，说明其中存在不耐热的结合键。病毒粒子分子量130×106Da，本属病毒的基因组与呼肠孤病毒科其它属成员无同源性序列。正呼肠孤病毒的蛋白质占病毒粒子总重的86%，分布于两层衣壳内，一共有9种蛋白质，分子量33×103～155×103Da，７种主要多肽，即λ1、λ2、μ1、μ2、δ1、δ2、和δ3。外衣壳由μ2、δ1和δ3等三种蛋白质组成。Astell等（1972）由感染细胞中提取“亚病毒单位”，也就是除掉外衣壳的病毒粒子，随后加入δ3蛋白，结果成功地在试管内组装成完整的呼肠孤病毒粒子，从而证明δ3蛋白是外衣壳的主要成分。但在仔细研究胰凝乳蛋白酶降解外衣壳的过程中，发现与衣壳稳定性和病毒粒子感染性有关的主要成分是μ2而不是δ3。胰凝乳蛋白酶可将δ3完全除去，但病毒粒子仍保持高度感染性。但在将μ2降解时，病毒粒子的感染性明显下降。最后除去的是δ1，结果遗留52nm直径的内衣壳，即核心。λ1、λ2、μ1和δ2等几种蛋白质存在于内衣壳内。正呼肠孤病毒不含糖类和脂质，对乙醚有抵抗力。正呼肠孤病毒含有转录酶、复制酶、核苷酸磷酸水解酶、帽化酶。正呼肠孤病毒对去氧胆酸盐、醚和氯仿具有很大抵抗力，能耐56℃2小时或60℃30分钟的加热，在4℃，其传染性至少可维持2个月。在有1～2mol/LMgCl正呼肠孤病毒在pH22～80的广泛酸碱范围内保持稳定。在室温条件下，能耐1%H2O2、3%福尔马林、5%来苏儿和1%石炭酸1小时。但70%乙醇在较长时间作用后使其灭活，过碘酸盐也可迅速杀死呼肠孤病毒。3.抗原性正呼肠孤病毒具有共同的群特异性抗原λ2和δ3，另外还有型特异型抗原δ1。哺乳动物的呼肠孤病毒共有一个补体结合性抗原，应用血清中和试验和血凝抑制试验，则可将其区分为3个不同的血清型。2型呼肠孤病毒更进一步区分为4个亚型。这些血清型与禽呼肠孤病毒没有血清学关系。奇怪的是，哺乳动物的呼肠孤病毒竟与三叶草的伤瘤病毒具有一个共同的抗原成分，而且这种植物病毒与哺乳动物的呼肠孤病毒具有同样的形态结构以及双股RNA构型。呼肠孤病毒的3个哺乳动物血清型都能凝集人的O型红细胞，这种红细胞凝集现象发生于4～37℃温度中。564.培养呼肠孤病毒可在许多种类的培养细胞中增殖，包括原代猴肾细胞、KB细胞、HeLa细胞、人羊膜细胞以及L细胞等，并于7～14天内产生细胞病变，主要是在感染细胞内形成嗜伊红性胞浆内包涵体。这些包涵体特征地形成于胞核附近的胞浆内，并在感染过程增进时散布于整个胞浆内。电子显微镜检查，可在包涵体内看到完全和不完全的病毒粒子。这些病毒粒子经常呈结晶状排列，并常连结于胞浆内的梭形微管上。感染细胞最后崩解，病毒被释于细胞外。不同于禽呼肠孤病毒，哺乳动物呼肠孤病毒虽可在鸡胚内增殖，但不呈现规律性。来源于人的呼肠孤病毒株通常不能在鸡胚卵黄囊内增殖。正呼肠孤病毒在L细胞内的增殖过程已被充分研究。于37℃，接种入的病毒可在30分钟内吸附65%。病毒借细胞吞饮作用侵入细胞。吞饮泡与溶酶体融合而形成吞噬体。电子显微镜观察，常可在这种吞噬体内见到完整的病毒粒子。病毒粒子的外衣壳由溶酶体的水解酶除去，剩下“亚病毒颗粒”，亦即核心。核心中的转录酶和帽化酶原来呈“不活动”正呼肠孤病毒的一个特点，就是在没有脱去内衣壳的病毒核心内，就能进行部分转录过程。每个病毒核心含有许多酶活动点，初期的mRNA分子即由此释出。5.病原性鼠类能发生3型呼肠孤病毒的自然感染，有时称肝脑脊髓炎，其临床表现为黄疸、运动失调、油性被毛、生长发育迟缓等。给乳幼鼠作滴鼻感染，也可使其发生呼吸道疾病而死亡。将1型呼肠孤病毒给小鼠作腹腔内接种，可于5～7天内致死，并可由死亡小鼠的各器官分离到呼肠孤病毒。对新生仓鼠、雪貂、大鼠也会引起同样病变。将3型病毒直接注入乳鼠脑内，可以使其发生坏死性脑炎和死亡。剖检中枢系统，可见病毒主要在神经原细胞内增殖，胶质细胞和室管膜细胞内显然不发生病毒增殖。此外，呼肠孤病毒对大鼠、小鼠还有致畸变作用。1和2型呼肠孤病毒感染小鼠，病毒可通过怀孕鼠的子宫垂直传播，致胎儿或新生儿死亡。其它哺乳动物和人的呼肠孤病毒感染大多呈无症状经过。第1株牛呼肠孤病毒是由健康牛的粪便中分离获得的，至今已分离到50多个牛呼肠孤病毒株，包括1、2、3等三个血清型。1型最为常见。在某些国家的牛群中，阳性抗体率达57%。一般认为，牛在一岁以内普遍发生呼肠孤病毒感染，但不出现症状，牛在发生呼吸道疾病后，呼肠孤病毒抗体的效价经常上升。1型与2型混合感染对牛地方性支气管肺炎的流行起重要作用。给牛作呼吸道感染试验，虽然没有症状，但肺和其它组织中含有高滴度病毒，鼻液中也出现病毒，随后则可测出血清中较高效价的抗体。给不吃初乳的新生犊牛作人工感染，常可产生轻微的肺炎病变，但不象组织培养细胞那样形成胞浆内包涵体。马呼肠孤病毒的3种血清型均有发现，调查表明其抗体阳性率分别为1型29%，2型19%，3型61%。1型与3型可致马上呼吸道疾患，此外还可与马流感病毒一起引起咳嗽综合征。绵羊也存在3个型的呼肠孤病毒，但抗体检测以3型为主。用猪株呼肠孤病毒给6周龄幼猪作经鼻接种，幼猪体温升高，血清中的血凝抑制抗体可增高4倍以上。犬呼肠孤病毒只分离到1型，2型与3型的抗体亦有阳性。用1型实验感染幼犬时发生间质性肺炎，抗体效价上升。猫呼肠孤病毒分离率最高的是3型，人工感染可致温和的呼吸道症状。1型是从猫的肿瘤细胞中分离所得的。人类的呼肠孤病毒感染十分普遍，3种血清型均有发现，血清学调查的阳性率很高，最重要的是1型，但大多呈无症状经过。曾从普通感冒、脑炎、肝炎、脑膜炎、脑脊髓膜炎以及致死性肺炎患者体内分离到不同血清型的呼肠孤病毒。6.诊断和防制应用敏感的组织培养细胞从发病早期的粪便、呼吸道分泌物、滑液或其它组织样品中分离病毒。为消除细菌和其它病毒的干扰，应视情况先将病料作50～55℃加热或用乙醚、丙酮处理。根据特征性细胞病变——核周围包涵体的出现，人工感染乳鼠致病，初步判定病料中是否有呼肠孤病毒存在。应用已知抗体进行鉴定：先以补体结合反应检测群抗原，随后再用中和试验或血凝抑制试验检测型特异性抗原。鉴于症状及病理剖解变化都不具特征性，诊断通常有赖于抗体的检测，现症病例的诊断，则需发病期及康复期的双份血清。ELISA的敏感性远远高于琼脂扩散和间接血凝试验，以纯化病毒为抗原，并且用高岭土处理血清，以排除非特异性反应，其结果与中和试验一致。对某些由呼肠孤病毒参与所致的疾病，可用灭活的呼肠孤病毒与其它抗原混合而成的联合疫苗进行预防。（二）禽呼肠孤病毒1.病毒特征禽呼肠孤病毒具有典型的呼肠孤病毒形态，纯化的禽呼肠孤病毒只含有RNA和蛋白质，平均含量分别为187%和813%。RNA中既有ss又有ds，其中ssRNA约占RNA总量的30%。禽株RNA的含量高于哺乳动物株（14%），这种差别归因于禽株含有ssRNA。根据SDS电泳迁移率的不同，可将禽呼肠孤病毒的10个RNA节段分为三类，依次为L、M和S。其中大节段L（L1、L2和L3）分子量为24×103～27×103kDa；中节段M（M1、M2和M3）分子量为13×103～17×103kDa；小节段S（S1、S2、S3和S4）分子量为0.68×103～1.2×103kDa，与哺乳动物株比较稍有差异，但禽株S1的分子量远远大于哺乳动物株。不同分离株（包括不同血清型和同型不同毒株）的dsRNA核酸电泳迁移有明显多样性，但与致病力无相关性。嗜关节性的S1133株及其无致病力的疫苗株P100，它们的dsRNA节段在SDSPAGE中的迁移型式完全相同，但蛋白质却有差别，推测蛋白质的改变与毒力强弱和生长特性有关。应用更灵敏的核酸杂交试验表明疫苗株P100的dsRNA至少有4个节段发生了变化。不同于哺乳动物呼肠孤病毒，禽呼肠孤病毒不能凝集鸡、火鸡、鸭、鹅、人O型、牛、绵羊、兔、豚鼠、大鼠或小鼠的红细胞。只有两个例外报道。禽呼肠孤病毒对热有抵抗力，能耐受60℃8～10小时，56℃22～24小时，37℃15～16周，22℃48～51周，4℃3年以上，-20℃4年以上，-63℃10年以上。半纯化病毒于60℃5小时条件下尚不能完全灭活，MgCl2能增强病毒对热的稳定性，但浓度太大反而促进其灭活。对乙醚不敏感，对氯仿轻度敏感，对pH3有抵抗力，室温下过氧化氢作用1小时不能使其灭活；2%苯酚部分灭活病毒，2%甲醛在低温（4℃）无效。对2%来苏尔、3%福尔马林、DNA代谢抑制物、放线菌素D、阿糖胞苷、5氟2.抗原性禽呼肠孤病毒各毒株之间具有共同的群特异抗原，而与哺乳动物株和纳尔逊海湾病毒无交叉，这种共同的沉淀抗原可用琼扩或补结试验检测。使用血清学方法可对呼肠孤病毒进行分类，或根据对鸡的相关致病性分群。Kawamura等将日本禽呼肠孤病毒77个株应用蚀斑减数试验分为5个血清型，Wood等（1980）统计了来自美国、英国、德国和日本呼肠孤病毒的相关性，虽然在异源型毒株间有很大程度的交叉中和关系，但仍发现了11个血清型。至目前为止凭借中和试验将禽呼肠孤病毒分为11个血清型。由于交叉反应大量存在，因此有些群只能作为亚型而不作为独立血清型。Hieronymus等（１９８３）将5个吸收不良综合征的分离物分为3个血清型，而Robertson和Wilcox

（１９８4）将10个澳大利亚分离物分为三个有很大程度交叉反应的群。显然，呼肠孤病毒经常以抗原亚型，而不是以独特的血清型存在。3培养禽呼肠孤病毒很容易从禽源细胞培养物中分离。常用的细胞培养是禽原代细胞，包括鸡胚成纤维细胞、肝、肺、肾、巨噬细胞和睾丸细胞。最常用的是雏鸡肾细胞（2～6周龄），分离火鸡株时可用火鸡肾细胞。Barta（1984）等一些学者认为，做蚀斑和分离病毒时，应选择鸡胚肝细胞。用各种方法分离本病毒的比较结果表明，以鸡肝细胞最敏感，其次为鸡肾细胞，而成纤维细胞敏感性最差。感染呼肠孤病毒的鸡源细胞培养物能够形成合胞体（一般在合胞体形成前细胞内产生空泡），细胞浆内有包涵体（初期嗜酸性，后变嗜碱性）。某些毒株亦可适应于许多哺乳动物细胞系，如在绿猴肾（Vero）、乳仓鼠肾（BHK21）、猫肾（CRFK）、Georgia牛肾（GBK），兔肾（RK）和猪肾（PK）细胞内生长，但大多数毒株只有在Vero细胞中产生CPE。经卵黄囊或绒毛尿囊膜接种，呼肠孤病毒容易在鸡胚内生长。初次分离选用卵黄囊接种，一般在接种后3～5天鸡胚死亡，胚体因皮下出血而呈淡紫色。绒毛尿囊膜接种，通常在7～8天后鸡胚死亡，绒毛膜上有隆起的、分散的痘疮样病灶，未死胚胎生长滞缓，肝淡绿色，脾肿大，心脏有病损。4病原性1954年，Fahey和Crawley首次从有慢性呼吸道疾病的鸡呼吸道内分离到禽呼肠孤病毒，后来由Peter（１９６７）进一步证实。当时用这种被称为FaheyCrawley病毒，接种于易感鸡后，表现为温和性呼吸道疾病，病鸡的肝脏坏死并出现腱和滑膜的炎症。禽呼肠孤病毒流行于鸡、火鸡、鸭、鹦鹉和其它禽类，可水平传递亦可经卵垂直传递。已由多种疾病分离出该类病毒，包括病毒性关节炎、腱鞘炎、矮小综合征（Stuntingsyndrome）、呼吸道病、肠病（Entericdisease）、吸收障碍综合征（Malabsorptionsyndrome）和骨质疏松征（Osteoporosis）等。患禽生长受阻，发生心包炎、心肌炎、心包积水、肠炎、肝炎，腔上囊和胸腺萎缩，骨短粗或出现急慢性呼吸道病。某些呼肠孤病毒株的致病作用，由于柔嫩艾美尔球虫或巨型艾美尔球虫的协同感染而加强。鸡感染传染性法氏囊病病毒或在特殊的饲养环境下，能增高由WVV2937株感染所致腱鞘炎的严重性。呼肠孤病毒也能加剧由其它病原引起的疾病，如鸡贫血因子、大肠埃希氏杆菌和新城疫病毒。由于感染了呼肠孤病毒，使机体的免疫功能降低，导致对其它传染性病因的易感性增加。此外，在临床上未感染的鸡也常发现病毒。由禽呼肠孤病毒所致的最重要和常见的疾病是病毒性关节炎、腱鞘炎和吸收障碍综合征。三、环状病毒属（Orbivirus）本属在某些形态、理化和生物学特性上不同于正呼肠孤病毒。正呼肠孤病毒经常含有两层衣壳，对热及酸性环境（pH30）具有强大抵抗力，不发生虫媒传播方式，而环状病毒虽有双层衣壳，外衣壳结构模糊，内衣壳由32个大的环状壳粒组成，故称环状病毒。对热和pH3.0的抵抗力不高，多数成员可在节肢昆虫和脊椎动物体及其细胞内增殖。病毒粒子呈二十面立体对称，直径为65～80nm，核衣壳的直径为54～60nm，但无棘状突起，衣壳由32个大型壳粒组成。病毒粒子的分子量为80×106Da，S20W为550，在pH6～8稳定，感染性在pH30丧失。在蛋白质存在下，病毒非常稳定，如由室温存放的血液中25年后仍能重新分离出蓝舌病病毒。病毒基因组由10个节段的双股RNA组成，节段分子量大小为0.5×103～2.8×103kDa，总分子量约15×103kDa，占病毒粒子重量20%，G+C含量为42%～44%。有七条结构多肽，分子量为35×103～150×103Da，占整个病毒粒子重量的80%。主要核心蛋白是Vp3和Vp7，分子量分别为103Da和38×103Da，其中Vp7是存在于核心表面上壳粒的主要成分，核心也含有Vp1、Vp4和Vp6。外衣壳层含Vp2（MW=111×103Da）和Vp5（MW=59×103Da）。有三种非结构蛋白NS1、NS2和NS3，分子量分别为644×103、41×103和256×103Da，其中NS2是磷蛋白。目前已知的成员根据其血清学的亲缘关系可分为12个群，其中蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒、鹿流行性出血病病毒、茨城病病毒及科罗拉多蜱传热病毒5个群对家畜致病（表19-1）。没有检测到属特异性抗原，但可通过荧光抗体、免疫扩散和补结反应证实群内有共同的抗原。个别毒株呈现低水平交叉反应，通常被报道为血清群中的独特成员。表19-1环状病毒病的分群群的名称血清型生物媒介非洲马瘟病毒1～9库蠓蓝舌病病毒1～24库蠓鹿流行性出血症病毒1～7蚊马脑器质性脑病病毒1～5库蠓Eubenangee病毒1～3白蛉Palyam病毒1～6蚊Changuinola病毒1～7蜱Corriparta病毒1～3库蠓Kemerovo病毒1～20Warrego病毒1～2Wallal病毒1～2环状病毒在宿主细胞的胞浆内合成和增殖，进入宿主细胞脱去外壳需要依赖RNA的RNA聚合酶活化。感染细胞内质网肿大，出现颗粒性近核包涵体，线粒体变形，同时常在胞浆内形成微管样构造。这种微管样构造可在蔗糖密度梯度上提纯；电子显微镜下观察，直径约50nm，表面还有线状周圈性的微细结构，使整个微管样构造呈楼梯样外观。据生化学和抗原性分析，这种微管样构造由病毒特异的非衣壳性多肽组成，至少有一种以上。成熟的病毒粒子也常与之粘附。敏感细胞感染病毒后，胞浆内形成包涵体。病毒粒子释出是挤出式而不是芽生。本属代表种为蓝舌病病毒，其它成员包括１１个血清群见表19-1。还有一些未分群的毒株，包括Ife，Japanant，Lebombo，LLanoSeco，Orunga，ParooRiver，Vmatillam，T50616（分离自臭鼬）。蓝舌病病毒（Bluetonguevirus）同义名：绵羊卡他热病毒，嘴疼病病毒，草原强直症病毒蓝舌病是绵羊的一种急性传染病，其特征是颊粘膜和胃肠道粘膜严重的卡他性炎症。病羊发热，大量流涎，并由鼻孔流出多量浆液性或粘液性鼻涕，干涸后结痂于鼻孔周围。舌、齿板、齿龈和颊粘膜充血肿胀，并出现瘀点，此后变为青紫色，蓝舌病的名称即由此而来。乳房和蹄冠等部位也常出现病变——上皮脱落，但不发生水疱。死亡率5%～30%不等。除绵羊外，牛及其它反刍兽也罹患本病，但症状较轻，死亡率也低。蓝舌病最早于1876年发现于南非的绵羊，1940年前本病仅限于撒哈拉以南的非洲大陆。到40年代已蔓延至中东一些国家和地区，例如塞浦路斯、叙利亚、伊拉克、土耳其、以色列和巴勒斯坦。其它国家亦已相继发现本病的存在。1948年美国报道此病。1952年西半球首次在美国加州从绵羊体内分离到病毒，1959年在俄勒冈首次从牛中分离到病毒，70年代后期广泛分布于热带、亚热带国家。1956～1957年欧洲尤其是西班牙和葡萄牙流行。1978年，Davies报道在澳大利亚的库蠓体内分离到蓝舌病病毒。目前在热带和亚热带地区的绝大多数国家的易感动物中都可能感染蓝舌病病毒或与之密切相关病毒。我国的蓝舌病于1980年在云南首先发现，并相应分离出蓝舌病病毒，从而确定了本病在国内的存在。1.形态特征核衣壳的直径为53～60nm，但因衣壳外面还有一个细绒毛状外层，使病毒粒子的总直径提高到70～80nm。病毒粒子在氯化铯中离心沉淀以后，绒毛层消失，原因不明。于电子显微镜下仔细观察，可见绒毛层中的绒毛似乎是由衣壳壳粒上延伸出来的。成熟的病毒粒子经常包围于一个外层囊膜样结构中。这种囊膜样结构可被醚或吐温80除去，但病毒活性不受影响。因此人们认为，它们并非蓝舌病病毒必要的组成成分，而是由细胞膜“抢来”的细胞性物质，故又称为“假囊膜”。图16-2蓝舌病病毒（横杠=100nm）自Smale等蓝舌病病毒的衣壳由32个大型壳粒组成。壳粒直径为8～11nm，呈中空的短圆柱状。2.理化学特性蓝舌病病毒含有20%的RNA，由10个片段的双股RNA组成。RNA的分子量为118×103kDa。在吖啶橙着染感染细胞时，特别是在感染后期，常可发现橘红色的包涵体，说明除双股RNA外，还有部分单股RNA的存在。G+C含量为43%。蓝舌病病毒含有7种结构多肽，包括4种主要多肽和3种次要多肽，组成外壳的Vp2和Vp5由RNA第2及第5节段编码，内壳Vp1、Vp3、Vp4及Vp6由RNA第1、3、4、9节段编码，核衣壳内Vp7由RNA第7节段编码。[FQ(11。20,Y-WZ]3.抗原性应用细胞培养或敏感实验动物进行中和试验和RNA杂交试验，已经证明蓝舌病病毒至少有24个血清型。Vp7是群特异性抗原，可用补结、琼扩或荧光抗体检测，Vp2是型特异性抗原。蓝舌病病毒血清型在世界不同地区的分布见表19-2。5.病原性蓝舌病病毒主要感染绵羊，特别是羔羊。潜伏期约一周。病羊发热，高达42℃，精神沉郁，食欲丧失，随后出现口鼻部典型的“蓝舌”病变。在发热后5～7天检查口腔，可见粘膜上有多数糜烂，并常因胃肠道发生病变而出现血样下痢。头、耳和颔间组织和喉部经常发生水肿，并常因蹄部知觉层发生病变而出现跛行。病羊被毛断裂，甚至全部被毛脱落。急性期的死亡率为20%～30%，该病的严重性依据病毒毒株、绵羊品种和局部生态学条件而不同。在非洲和欧洲的某些严重暴发中，死亡率有时高达99%。但在美国，死亡率一般不超过1%～7%。美利奴品种的绵羊，特别是其羔羊，似乎对本病最为敏感，病死率在70%以上。蓝舌病病毒可经胎盘感染胎儿，引起流产、死胎或胎儿先天性异常，严重时甚至可使整个羊群丧失一个产羔期的全部羔羊。Bwangamoi给57头母羊接种强毒力的蓝舌病病毒均在其妊娠第35～42天之间发现病毒于接种后6～7天侵入胎儿，10～12天后胎儿死亡。病理组织学检查证明蓝舌病病毒在肝上皮细胞和血管上皮细胞复制，成年绵羊毒血症有时超过28天。病毒在牛体存在的时间还要长，但仅当公牛发生病毒血症时，能从公牛精液中分离到病毒，并经交配传播给母牛和犊牛。用含病毒的血液、血清或磨碎组织给绵羊接种，很易引起人工感染。Pini用10型蓝舌病病毒给绵羊作耳部皮下接种，随后每天扑杀1头，检查组织中的病毒量，共11天。平均潜伏期为66.生态学蓝舌病多呈地方性流行，病的发生、流行与媒介昆虫的分布、习性和生活史密切相关，有明显的季节性，即以晚夏与早秋发病率最高。库蠓是蓝舌病病毒的主要传播媒介。当雌库蠓吸吮患畜的带毒血液后，其生活史长达70天，每3～4天吸血一次。病毒在感染的库蠓唾液腺和血腔细胞内增殖。在外环境中孵化7～10天，病毒就能在唾液腺中排泌，通过叮咬感染易感动物。库蠓多喜温湿泥区或牛粪，湿度对其生活史非常重要，但也发现一些种的库蠓存在于干燥区域，另外一些蠓在高浓度盐水中繁殖。南非淡翅库蠓（CPallidepennis）、美国变翅库蠓（C.Varripennis）为主要传播媒介。应用膜饲法或胸内接种，很易使库蠓发生蓝舌病病毒感染。Jennings等（1980）应用胸内接种法使库蠓感染蓝舌病病毒，应用荧光抗体法可在头、胸和腹部检出病毒。病毒效价在9天内逐渐增高，在接种后第5天就能可靠检出。有谓蓝舌病病毒可在库蠓体内增殖10000倍。Luedke等（1976）应用库蠓作为媒介昆虫，在绵羊与绵羊之间连续传了15代，共13个月。库蠓的感染率为37%，而且由库蠓叮咬引起的感染，其临床症状甚至比用人工接种的绵羊更为严重。尚未证实库蠓经卵垂直传播。已有羊蜱蝇（Melophagusovinus）可以携带并传播蓝舌病病毒的报道，但尚未证实蓝舌病病毒能在羊蜱蝇体内增殖。牛、山羊和鹿以及羚羊等野生反刍兽可能长期携带病毒，并在疾病流行的间歇期内扮演病毒储主的角色。Luedke等（1977）通过库蠓叮咬的方法使妊娠60天和120天的小母牛发生蓝舌病，随后采血进行病毒分离。结果在感染50天和100～102天后可由1/3～2/3的感染母牛血液中发现病毒（此时已出现中和抗体！）。10头母牛中，2头流产，1头产出死胎，其它7头正常分娩，但7头犊牛均有不同程度的结构或功能上的异常。4头犊牛（包括1头死胎）在出生时血液中含有病毒（此时尚无中和抗体和沉淀抗体）。某些犊牛在6个月内发生病毒血症。Luedke等还曾用库蠓传播方法由1头隐性带毒牛将蓝舌病病毒传给绵羊，使其临床发病。7.免疫病后康复动物对同型病毒具有很强免疫力，且持续几年。接种疫苗是防治本病的有效方法，目前普遍应用冻干的鸡胚化弱毒疫苗。这类疫苗分单价和多价两种，可根据各地流行的病毒血清型选用相应的疫苗。在非洲地区，由于几乎存在所有的血清型，因此必须应用多价疫苗。疫苗引起的免疫期可达1年左右。多价疫苗中各毒株之间的相互干扰，在一定程度上影响疫苗的免疫效力。而疫苗株在免疫原性上的差异和动物个体反应性的不同，可能也是疫苗接种效果不一致的原因。绵羊在接种弱毒疫苗后，经常发生病毒血症，例如Sawyer等（1977）应用组织培养细胞从疫苗接种羊的组织和胎儿中分离到疫苗株病毒。疫苗接种羊的病毒血症的滴度，有时高达足以感染媒介昆虫的程度。鸡胚化弱毒疫苗不能用于妊娠母羊，因其可能导致死胎、胎儿脑及其它组织产生病变。这种疫苗还可能影响母羊发情，所以通常是在母羊发情前几周接种。每年注射1次。于接种后10天左右出现免疫性。由于羔羊可经初乳获得母源抗体，故羔羊需在出生后3个月以上才能进行疫苗接种，以免母源抗体影响自动免疫的效果。因为蓝舌病病毒是一种抗原多变的虫媒病毒，多价弱毒疫苗的广泛使用，可能导致基因型重组和毒力变异增强，所以灭活疫苗列为首选。Parker等（1975）应用BHK21细胞培养蓝舌病病毒，并用β丙内酯灭活，制成灭活细胞培养疫苗。试用于羊，据云可以引起良好的抗体反应。Shipham等（1976）应用亚硝酸、5氟尿嘧啶、硝酸胍和原黄素诱变，于28℃非洲马瘟病毒（Africanhorsesicknessvirus）同义名：马瘟病毒。1.形态特征马瘟病毒的形态结构极象蓝舌病病毒。超薄切片中的病毒粒子直径为75nm，内有一个致密的核心，直径约50nm。于负染标本内，病毒粒子的总直径为60～80nm，衣壳的直径约55nm，由32个壳粒组成。有时看到带有细胞性囊膜的病毒粒子。所谓细胞性囊膜，是指囊膜全部来自细胞，不含病毒成分。甚至可在一个细胞源性膜样结构中看到大量病毒粒子的堆集。2.理化学特性马瘟病毒含有双股RNA。病毒粒子在氯化铯中的浮密度为125～133g/cm3。马瘟病毒对乙醚、氯仿和去氧胆酸盐有一定抵抗力，抗胰蛋白酶。在pH6～10之间稳定，但在pH30迅速灭活。血液或血清中的病毒可以长期存活，在4℃甚至室温条件下存活多年。将其混入等量的草酸盐石炭酸甘油保存液中，保存时间更长。血液或血清即使腐败，也不明显影响马瘟病毒的存活。60℃于30分钟内使其灭活。保存病毒的适宜温度是4℃或-70℃，马瘟病毒在-20%～-50℃温度中较易灭活。加入5%蔗糖、5%乳白蛋白或蛋白胨以及健康血清，均有利于马瘟病毒的活存。01%福尔马林能在22℃条件下在48小时内杀死马瘟病毒。在制备马瘟病毒的灭活抗原时，经常应用01%～04%3.抗原性应用中和试验和血凝抑制试验可将马瘟病毒分为9个血清型，推测在非洲其它地方还存在其它血清型。但是这些血清型并不彼此泾渭分明，经常在血清学反应或免疫保护力上呈现某种程度的交叉反应，因此有人认为，各型马瘟病毒可能具有同样的抗原成分，仅其含量明显不同而已。已在非洲发现所有的9个血清型，但在某一地区，则常以1个或2个血清型为主，例如阿尔及利亚的马瘟流行暴发，主要是由第9型引起的。补体结合试验呈群特异性，可以测出各型马瘟病毒共有的特异性抗原。琼脂扩散试验也是群特异的，通常出现2条或2条以上的沉淀线，因此必须应用同样制备的对照阴性抗原进行对比观察。4.病原性马、骡、驴是马瘟的主要自然感染者，能使感染的动物９５％死亡。马最敏感，骡次之，发病率高，致死率低。驴有一定抵抗力，仅出现温和的发热反应。斑马则完全不易感，可能系隐性带毒者。皮下注射０01%毫升的含毒血液，即可引起感染。静脉、脑内、腹腔和乳房内注射的结果相同。实验感染的潜伏期通常为5～7天，自然感染的潜伏期为3～10天，但也可能稍为缩短或延长至半个月以上。马瘟在临床上习惯地分为四个类型，即发热型、肺型、心型和混合型。[ZZ(]发热型[ZZ)]为轻症感染，体温升高，最高可达41℃，持续5～8天，随即恢复正常。最常见于驴和未完全免疫马群受到同种病毒的感染时。只有部分病马呈现轻度症状，如食欲不振，结膜潮红，呼吸困难和脉搏增快。[ZZ(]肺型[ZZ)]为最严重的病型，体温急骤上升，高达41℃或以上，呼吸加快，每分钟70次左右，并出现急性肺水肿的症状：前腿分开、头颈伸长、鼻孔扩大、大汗淋漓、阵咳后排出淡黄色和泡沫状鼻涕。病畜可在数小时内死亡。主要病变是肺水肿和胸腔积水6.生态学马瘟不直接由病马传染给健康马，必须通过媒介昆虫叮咬病马、骡等动物才能传播。库蠓是马瘟病毒的主要传播者，曾多次从库蠓体内分离到病毒。Mellor等（1975）应用胸内接种和喂饲含毒血液的方法使库蠓发生人工感染，并能传播病毒，证明库蠓是生物学带毒者。在土耳其，虻和螯蝇被认为是马瘟病毒的传播者。Ozawa等（1965）应用按蚊和库蚊成功地传播了马瘟病毒。虽然病后恢复马可能带毒90天，但在没有蚊、蠓等媒介昆虫存在的季节，马瘟病毒是怎样持续存在和越冬的?这是至今没有阐明的问题。有人推测可能存在一种或几种可以作为病毒储主的野生脊椎动物。于春夏季节，新羽化的库蠓或其它媒介昆虫在叮吸这些储主的血液时遭受感染。经库蠓等媒介昆虫越冬的可能性，尚未获得实验证据。传染媒介的控制，可用杀虫剂在马匹安定而吸血昆虫最活跃的夜间进行。7.免疫四、轮状病毒属（Rotavirus）同义名：双层病毒（Duoviruses）轮状病毒是各种幼龄动物非菌性腹泻的主要病原之一。最早于1968年由Mebus等在美国内布拉斯加州一农场犊牛腹泻病例中发现，欧、美洲各国以及澳大利亚、新西兰和日本等都发现了牛轮状病毒引起的犊牛腹泻，澳大利亚和英、美等国均报道有轮状病毒引起的仔猪腹泻。此外，在绵羊、山羊、幼驹、鹿以及兔和小鼠等也有发生轮状病毒性腹泻的报道。小鼠的流行性腹泻就是轮状病毒引起的。鸡和火鸡等多种禽类中亦有轮状病毒感染的存在。我国亦有猪、牛、羊、犬和多种禽类等轮状病毒感染的报道，并已发现或分离鉴定了病毒。轮状病毒感染引起严重的经济损失。以英国为例，犊牛轮状病毒性腹泻的发病率为60%～80%，死亡率为0%～50%，1%～4周龄仔猪群的发病率超过80%，死亡率7%～20%。轮状病毒感染引起的腹泻是一种世界性传染病。据初步统计，全世界幼儿发生的肠炎至少有50%是由轮状病毒引起的。该属代表种为人轮状病毒，其它成员包括从人、牛、小鼠（EDIM）、豚鼠、绵羊、山羊、猪、猴（SA11）、马、羚羊、北美野牛（Bison）、鹿、家兔、犬、禽的分离株。1.形态特征病毒粒子略呈圆形，具有双层衣壳。直径为65～75nm。中央为一个电子致密的六角形核心，直径37～40nm。周围绕有一个电子透明层。轮状病毒曾被描述为类呼肠孤病毒，但可根据它们清晰明确的光滑外缘与呼肠孤病毒相区别。壳粒由此向外呈辐射状排列，构成内衣壳。外周为一层由光滑薄膜构成的外衣壳，厚约20nm，外衣壳可能是在内质网膜上芽生时获得的。以核心为毂，以呈辐射状排列的内衣壳为轮辐，以外衣壳为辋，构成了特征性的轮状结构。轮状病毒这一名称，就由此而来。有关轮状病毒的超微结构，学者们的意见尚不一致。曾提出过内衣壳有３２个、１３２个、１６２个、１８０个、３２０个壳粒构成呈２０面体排列的多种模型。Martin等（1975）认为轮状病毒与环状病毒一样，也有32个大的环形壳粒，且其180个三联亚单位按T=9方式组成20个三角面体。每个三联亚单位包含3个结构单位，所以一共有540个结构单位。但据Esparza（1978）报道，轮状病毒表面有162个孔，由320个三联亚单位按T=9方式组成20个三角面体。因每个三联亚单位包含三个结构单位，所以一共有960个结构单位。图69-3轮状病毒（横杠=100nm）-自杨盛华出现上述不同的观察结果，也许是标本制作方法不同的缘故。现公认轮状病毒为二十面体，三角剖分数T=13。Stannard等（1977）对乳鼠流行性腹泻轮状病毒和猴轮状病毒SA11株进行了细致的电子显微镜观察，发现其内衣壳有180个形态亚单位，排列成晶格状。12个顶各为一个空隙，由5个壳粒围绕，另外80个空隙各由6个壳粒围绕。外衣壳由蜂窝样的晶格组成，且与内衣壳的晶格排列相符。Stannard还绘制了一幅有关轮状病毒衣壳结构的模式图，见图1９-4。除完整的病毒粒子（称为光滑型，即S颗粒）外，还常可以见到没有外衣壳的病毒粒子，称为粗糙型，即R颗粒。形成无感染性的或感染性差的单层衣壳壳粒，这种颗粒，比完整病毒粒子小，其出现的相对频率甚低，但已发生在鸡、仔猪、犊牛和人类的感染中，约占仔猪轮状病毒感染的５％，而在牛则低至１％。此外还有空衣壳。在已感染的小肠上皮细胞的胞浆内，常有无定形的毒浆（viroplasm）和微管样结构（其表面形态与病毒粒子相同），可能是病毒衣壳异常合成的产物。图16-4轮状病毒衣壳结构模式(自Stannard)2.理化学特性轮状病毒粒子和核心在氯化铯密度梯度中的浮密度分别为136～138g/cm3和144g/cm3。S20w=525。病毒由11个节段的双链RNA组成，大小为06×103～33×103kDa。以Nebraska株轮状病毒为例，各节段的分子量分别为221、185、170、155、100、082、051、051、026、020和020×103kDa。RNA占病毒粒子重量的12%～15%。短的保守序列全在5′末端。轮状病毒ＲＮＡ的１１个节段，在聚丙烯酰胺凝胶电泳后，易于分开，形成特定的电泳带组合模式，即电泳图型模式，简称电泳型。这１１条带分为４个区段。常见的动物和人的轮状病毒的４个区段中，各带的排列位置为４∶2∶3∶2，统称Ａ群。根据第１０和第１１节段之间距离的长短，又分长型和短型。后来又发现了一些新的轮状病毒，其电泳型与Ａ群不同，称为Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ和Ｆ群，见表19-3和图19-5。表19-3轮状病毒分群特征群群特异性抗原电泳型宿主ABCDEF[]ABCDEF[]4∶2∶3∶24∶2∶2∶34∶3∶2∶25∶2∶2∶24∶2∶2∶33∶3∶3∶2[]多种动物和人猪、牛、大鼠、中国成人、小儿小儿、猪禽猪禽尽管不同的血清型可能呈现相似的电泳型，而同一血清型又可能显示不同的电泳型，但国内外迄今还常应用电泳分型法作为鉴定轮状病毒的主要手段。图19-5轮状病毒RNA的电泳型A.常见轮状病毒，长型，4∶2∶3∶2B.常见轮状病毒，短型，4∶2∶3∶2C.非典型轮状病毒，5∶2∶2∶2应用聚丙烯酰胺凝胶电泳，可在不同毒株间发现RNA节段的电泳迁移图谱有一定程度的差异，不同种动物的轮状病毒之间的差异更明显。其中最重要的是根据第10和11节段之间距离的长短划分的所谓长型与短型。一些A群轮状病毒具有血凝性，例如牛NCDV株能凝集人O型以及豚鼠、马、绵羊等红细胞。绵羊和人株能凝集鸡、绵羊、兔、豚鼠及人的红细胞。我国江苏省的分离株能凝集豚鼠、马、人O型、绵羊及犊牛红细胞。最适pH72～74，温度为37℃，血细胞浓度为05%。血凝和血凝抑制试验亦可提供一种毒株分类方法。轮状病毒对环境因子和许多常见消毒剂如碘附和次氯酸盐有较强的抵抗力，能耐受乙醚、氯仿和去氧胆酸钠处理而不影响其感染性。对酸（pH30）和胰酶稳定，56℃30分钟使其感染力降低2个对数。1mol/LMgCl2不能增高其对56℃60分钟的稳定性。粪便中的病毒在18～203.抗原性病毒粒子表面有３种抗原，即群抗原、中和抗原及血凝素抗原。群抗原与多种结构蛋白有关，主要是由第6节段编码的内壳蛋白Vp6；中和抗原主要是由第9节段编码的外壳糖蛋白Vp7；血凝素抗原是由第4节段编码的外壳蛋白Vp4，可被蛋白水解酶水解。不是所有的轮状病毒都有血凝素。根据群抗原的差异及病毒RNA末端指纹图的分析将轮状病毒分为A～F6个群。绝大多数哺乳动物轮状病毒，具有一种相同的群抗原。这些轮状病毒被命名为A群或典型轮状病毒，包括大多数哺乳动物和禽A群轮状病毒，是研究的主要对象。B～F群只在原代宿主上生长，为非典型轮状病毒或副轮状病毒(pararotavirus），缺乏共同抗原，其基因片段只有第5、7、9节段RNA；其中B群出现在人、猪、牛、绵羊和大鼠，在我国发现的成人轮状病毒是重要代表；C群在猪，很少见于人，D群和F群在禽，E群在猪。禽轮状病毒与哺乳动物无抗原相关性。尽管用免疫荧光、ELISA、补结试验、琼扩等方法检测群抗原，但同群轮状病毒仍有不同的抗原。此种抗原可用血清中和试验或蚀斑减数中和试验鉴别。根据中和抗原Vp7的差异可将A群轮状病毒分为14个血清型，分别用阿拉伯数字G1～11标记；依据Vp4差异大约有８个血清型，标记为p1～8，它们间有部分抗原交叉。5.病原性小日龄的幼畜最为易感，症状也较严重。成年人、畜血清中的抗体检出率高达40%～100%，大多呈隐性感染。畜、禽群一旦发生本病，随后将每年连续发生，这是因为轮状病毒在体外具有较强的抵抗力，而且隐性感染的成年动物不断排出病毒的缘故。腹泻是本病的主要症状，严重者带有粘液和血液，部分病例因严重脱水和酸碱平衡失调而死亡。病毒感染主要局限于小肠，特别是其下2/3处，即空肠和回肠部。病毒对小肠上皮细胞有极强的偏嗜性，幼畜在感染数小时后小肠绒毛萎缩、柱状上皮细胞脱落，从而使肠道分泌和吸收机能失调。利用轮状病毒实验感染鸡和火鸡进行的免疫荧光研究表明，病毒增殖的主要部位是小肠成熟绒毛吸收上皮细胞的胞浆。绒毛的上1/3感染细胞较多。少量感染的细胞也见于结肠上皮、盲肠和某些绒毛的固有层。腺胃、肌胃、脾、肝或肾中未见到免疫荧光。轮状病毒宿主范围甚广，已知的有人、小鼠、牛、牦牛、猪、绵羊、山羊、马、犬、猫、猴、羚羊、鹿、兔、鸡、火鸡、雉鸡、鸭、珍珠鸡、鹌鹑、鸽和情侣鹦鹉等。各种动物的轮状病毒都对各自的幼龄动物呈现明显的病原性。成年动物大多呈隐性感染经过。人的轮状病毒能够实验感染犊牛、猴、仔猪、羔羊，并可能引起临床发病；但不能使小鼠和家兔感染发病。牛轮状病毒和鹿轮状病毒也能感染仔猪。猪轮状病毒似乎只能使仔猪感染发病。分离自火鸡和雉的轮状病毒可感染鸡。没有迹象表明，禽类轮状病毒可感染哺乳动物，反过来也是一样。Woode等（1978）用无菌猪作试验，猪轮状病毒引起的新生仔猪死亡率为100%，5～7日龄仔猪的死亡率为5%～30%。犊牛最早在出生后12小时发病，迟的数周，一般以1～7日龄犊牛发病最多。有趣的是，尽管发生于火鸡、鸡、雉鸡和鸭的绝大多数自然感染者是6周龄以下的禽类，但较大的鸡（56～119日龄）和火鸡（112日龄）对实验感染的敏感性却较初生几周的雏禽高。感染动物可产生血液循环抗体及肠道分泌抗体，血清中的抗体水平和对感染的抵抗力并不相关。而在感染中起保护作用的是肠道局部的SIgA，能中和轮状病毒。在大多情况下，肠道感染后的回忆应答时间短。如人工感染猪１４～２１天后用同样的猪轮状病毒攻毒，可获得完全保护，但２８天后不能抵抗重复感染。人轮状病毒感染后很快出现特异性抗体，IgM在感染后5～10天效价最高，IgG则在感染后15～20天时达高峰。犊牛在感染后第3天即可检出肠道的分泌抗体，能维持约40～50天，再次感染时可再分泌30～40天。猪感染后５～１０天就能检测到轮状病毒粪抗体（Coproantibody）。鸡和火鸡口服接种轮状病毒时，早在感染后4～6天即出现血清抗体的应答。母乳中的抗体滴度及持续时间因动物的种类及免疫状况而异。6.免疫人用口服轮状病毒活疫苗可使儿童获得保护。美国已有用于犊牛的冻干弱毒疫苗。弱毒毒株是牛轮状病毒经牛胎肾细胞传200代以上（最后60代培养于29℃～30℃）减毒培育而成的。对刚出生而尚未吮吸初乳的新生犊牛，经口给予融化后的疫苗4ml，可使发病率明显降低，即或发病，症状也较轻微。可能是因疫苗株病毒首先感染了小肠粘膜上皮细胞，从而能够阻止随后的强毒感染，而在疫苗接种后5～7天，又将产生局部抗体。但学者们对于轮状病毒弱毒疫苗对其它血清型的感染是否有保护作用？是否会转变成强毒株？颇为关注。但据轮状病毒免疫的现有知识表明，口服活的致弱疫苗或许会比经非肠给予灭活疫苗更为有效。另一种免疫方法是用灭活疫苗给母畜作免疫注射，通过乳汁免疫，保护新生仔畜。已经明确，初乳抗体能够防止腹泻或降低其剧烈程度。据测定，牛羊在产后第1天，初乳中抗体含量最高，产后3天迅速下降至不可测出的水平。用甲醛灭活的牛轮状病毒疫苗5ml给分娩前60～90天的母牛作皮下注射，分娩前30天再作第2次注射，也可降低新生犊牛的发病率。Gastrucci等（1989）采用油包水佐剂疫苗免疫注射妊娠最后一月的母牛，测得母牛初乳中的中和抗体效价为1∶2560，直至产犊后5天牛奶抗体水平仍未明显下降，而未免疫母牛在初乳中含有极低效价的抗体（1∶40以下）。与牛、羊乳中抗体持续时间很短的情况相反，Bohl（1978）发现，猪的初乳和常乳中具有相当高的抗体效价，即使是在泌乳后期采集的乳标本中，中和抗体效价也常超过1∶1000。测定67个农场的268头母猪，除1头外，抗轮状病毒的中和抗体效价均高于1∶64。由此证明，多数母猪的初乳和常乳能给未断乳仔猪提供不同程度的被动保护。仔猪的轮状病毒性腹泻大多发生于10～23日龄幼猪，更小的猪可能因有充分的乳源性免疫力而较少发病。许多学者建议给母猪作免疫注射，通过提高初乳免疫的途径，预防仔猪的轮状病毒性腹泻。就单胃动物来说，乳中的IgA抗体可能比IgG更为有效。因为乳中IgA的浓度较高，且对酶的降解作用具有较大以G6号玻璃滤器或孔径为02２μ（１０）病毒核酸电泳法〓用于直接检测轮状病毒感染，并同时能鉴定出病毒基因组的电泳型，是研究轮状病毒分类学和流行病学的最常见方法。通常将病料或感染的培养物冻融处理后，经差速离心、蔗糖密度梯度离心制备病毒样品后，从轮状病毒中提取ＲＮＡ进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ），银染，根据病毒ＲＮＡ节段的数目及图式即可作出判断。血清学分析一般检查不出同一型轮状病毒的微小差异，但ＰＡＧＥ法可以检出。如果粪样中病毒含量高，应用下述简单的核酸提取方法，也可获得满意的电泳鉴定结果。取粪液025ml，加入Eppendorf管中，再加等量２％ＳＤＳ溶液，振荡混合３０秒钟，立即加入苯酚氯仿混合液05ml，如上振荡混合。１００００r/min离心沉淀５分钟，吸取上层水相，即为核酸样品，立即进行电泳。加样时，取核酸样品２０～４０μl，加样品稀释液３０～６０μl，混匀后即将Eppendorf管放入９０℃水浴加热２分钟，随后滴加凝胶板。电泳电压为３００～５００Ｖ或用７０～１００ＭＡ电流量，电泳１小时后用１０％乙醇、０五、COLTI病毒属(Coltivirus)科罗拉多蜱传热病毒（Coloradotickfevervirus)科罗拉多蜱传热病毒为COLTI病毒属的代表种，原属于环状病毒属。由于其对人有致病性，病毒核心的衣壳表面结构不同于典型的环状病毒，尤其是病毒基因组由１２个双链ＲＮＡ节段而不是环状病毒的１０个节段组成，核酸总分子量２７kDa，远比环状病毒（１８kDa）大，故单列为一属。该属成员除科罗拉多蜱传热病毒外，还包括Eyach和Eyach血清型的变异株Ar５７７和Ar５７８。可能的成员有印度尼西亚的JKT6433、JKT6969、JKT7041、JKT7075分离株以及中国分离株M14、HN59、HN131、HN199、HN295。本病毒能致山区和高原地区人类的轻型热病，表现为体温升高、颤抖、头痛及背部肌肉疼痛，恶心和呕吐，患者能完全康复。急性期有病毒血症。潜伏期一般为４～６天，病程５～６天。近年来从我国云南西双版纳无名热及病毒性脑炎病人中分离的ＢＡＮＮＡ病毒（１９９０）以及从海南省三带喙库蚊中分离的ＨＮ１３１株和麻翅库蚊中分离的ＨＮ２９５株（１９９０）等分离株，经核酸电泳，其ＲＮＡ分１２节段。此外，从当地猪、牛血清中也分离到病毒，且在我国热带、亚热带分布广泛，初步鉴定这些分离株很可能是ＣＯＬＴＩ病毒属成员。本病毒见于美国和欧洲，但也可能存在于印尼和中国。1.形态和理化学特性科罗拉多蜱传热病毒为球形颗粒，由致密的核心和包围着核心的双层衣壳组成，直径为８０nm。病毒对酸（pH３０）和热（５６℃，３０秒种）均敏感，pH30能使病毒感染性丧失，乙醚等脂溶剂能降低其感染性。病毒核酸由１２个节段的双股ＲＮＡ组成，0分子量分别在024×103～25×103kDa，总分子量为18×102.抗原性在迄今分离到的所有病毒株中，已知有两个血清型，分别代表美国北部的分离株和欧洲分离株（Eyach）。１９８５年从美国科罗拉多、洛基山等地蜱和病人血液分离到多株不同基因型变异株，在１９８６年分离的３株病毒有两株的基因带型不同于１９８５年分离株。由于本病毒具有多节段双链ＲＮＡ基因组，易于发生不同基因型病毒ＲＮＡ的重组，从而产生不同的变异株。3.培养和生态学本病毒可在多种脊椎动物和昆虫细胞中复制。已报道的有人、鹿、仓鼠、吮乳或成年小鼠、硬蜱、蚊子以及多种人类细胞系。从牛、猪体内也分离到中国株。安德逊革蜱是主要生物传播媒介，蚊子也可能有传播病毒的作用（印度尼西亚分离株）。松鼠和金花鼠是病毒贮主。六、水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus）同义名：水生动物呼肠孤病毒（Aquaticanimalreovirus）1979年Meyers从美国牡蛎中分离出呼肠孤病毒（1３p２），１９８１年Winto等从大马哈鱼分离出呼肠孤病毒（CSV），１９８３年Nagabayashi等从日本牡蛎中分离出JOV1病毒，１９８７年Winton等再次从３种鱼类（NotemigonusCrysoleueas，Oncorhynchusketa和Ictaluruspunctatus）以及美国牡蛎中分离出４种呼肠孤病毒。我国学者（１９８3）从草鱼出血病中分离出一株草鱼出血病病毒，并鉴定为呼肠孤病毒科中的新成员。这些从鱼类及贝类发现的呼肠孤病毒，它们有一些共性，即病毒外观相似于正呼肠孤病毒，粒子直径７５nm左右，核心约５０nm。在氯化铯中浮密度１３６g／cm3，能抵抗乙醚和蛋白酶处理而感染性不受影响。双股ＲＮＡ基因组有１１个节段，分子量为03×103～25×103kDa，总分子量15×103kDa。分３类，即３个L，３个Ｍ，５个Ｓ。有５种主要结构蛋白，分子量３４×103～１３５×103Da。至少还有２种次要的病毒蛋白存在。病毒在胞浆内复制，可能类似于正呼肠孤病毒复制方式。病毒宿主范围包括变温脊椎动物和无脊椎动物（贝壳类）。能在鱼类细胞系中有效增殖，在某些鱼类细胞上能形成蚀斑或合胞体。病毒呈水平传播，尚未发现任何生物传播媒介。鉴于上述特点，它们不同于已知呼肠孤病毒科中任何一属，曾建议提名为水生动物呼肠孤病毒属（Aquaticanimalreovirus），现正式归为一属。该属代表种金体美鳊鱼病毒（Goldenshinervirus）。此外，还包括１３p２呼肠孤病毒、大马哈鱼呼肠孤病毒（Chumsalmonvirus）、鲇鱼呼肠孤病毒（Channelcatfishreovirus）。还可能包括有鲤属鱼呼肠孤病毒（Tenchreovirus）、圆鳍雅罗鱼呼肠孤病毒（Chubreovirus）、银大马哈鱼呼肠孤病毒（Cohosalmonreovirus）、文蛤呼肠孤病毒（Hardclamreovirus）、草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus）即草鱼出血病病毒、大菱鱼呼肠孤病毒（Turbotreovirus）。属中除草鱼呼肠孤病毒（草鱼出血病病毒）外，其它均无重要的致病意义。(一)草鱼出血病病毒（Grasscarphemorrhagevirus）同义名：草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus），鱼呼肠孤病毒。草鱼出血病主要危害10cm左右的当年草鱼（４～５月龄），死亡率可达７０％，二龄草鱼也易感，成年草鱼则为无症状感染。感染鱼游泳异常，继而离群独处，或漂游水面，或沉卧池底，或剧转打圈，多在出现上述症状后一天内死亡。病死鱼体色深暗，眼球突出，全身出血、充血。临床表现通常可分三型：即以肌肉充血为主的“红肌肉型”；以鳍基及鳃瓣充血为主的“红鳍红鳃型”；以肠道严重出血为主要特征的“肠炎型”。以上三型往往混合出现。本病是我国最主要的鱼病之一，遍及我国南方各省，当水温超过２０℃1.形态和理化学特性草鱼出血病病毒直径６５～７０nm，双层衣壳，外衣壳厚约９nm,内衣壳52nm。超薄切片可见病毒粒子在胞浆中呈晶格状排状。基因组为双股ＲＮＡ，分11个节段，总分子量约15×103kDa；聚丙烯酰胺凝胶电泳图型为3∶3∶3∶2，可因毒株不同有所差异，分子量在03×103～31×103kDa。有５种主要结构多肽，分子量32×103～137×103Da。蔗糖浮密度130g/cm3，氯化铯浮密度137g/cm3。病毒对酸（pH3）、碱（pH10）及热（56℃，３０min）均稳定，对氯仿和乙醚不敏感。组织中的病毒在-２０2.抗原性草鱼出血病病毒与其它已知国外分离的鱼类呼肠孤病毒，如大马哈鱼呼肠孤病毒、金体美鳊鱼病毒等无抗原性交叉。至于毒株间是否存在着抗原性差异尚待研究，用特定毒株制备的疫苗对不同地区的免疫效果可有差异，提示可能存在着不同的血清型。毒株血清型与电泳型之间的关系及其在流行病学上的意义同样有待阐明。呼肠孤病毒科（Reoviridae）导源于呼肠孤儿病毒（Respiratoryentericorphanvirus），意即既能感染呼吸道，也能感染胃肠道的一类病毒，它们的致病性尚不清楚。这类病毒原先归于ECHO病毒，为ECHO10。但是，进一步研究表明它的毒粒不仅比ECHO病毒要大，而且能形成特征性的胞浆内包含体。这种含有病毒特异性抗原的包含体用丫啶橙染色时，与细胞DNA一样呈绿黄色，而不是象通常的单链RNA呈红色。由于这一现象导致了呼肠孤病毒基因组是双链RNA这一重要发现，第一次说明双链RNA可作为稳定的生命形态存在于自然界。迄今，已知呼肠孤病毒科是一个庞大的病毒科，它有150个以上成员，在自然界广泛存在于脊椎动物、非脊椎动物和植物。一、呼肠孤病毒科的分类呼肠孤病毒科包括6个属以及1个未定名的属。（一）呼肠孤病毒属（Reovirus），或正呼肠孤病毒（Orthoreovirus）代表株为呼肠孤病毒I型。其它成员包括从人、猴、狗和牛分离的呼肠孤病毒1、2、3型，以及从禽分离的Crawley、NelsonBay等。（二）环状病毒属（Orbirirus）代表株为兰舌病毒（Bluetonguevirus）。其它成员包括11个血清型：1.兰舌病毒亚属（Bluetonguesubgroup）（库蠓属）。兰舌病毒有21个血清型。2.Eubenangee亚属。包括Eubenangee（蚊）；Pata（蚊）；Tilligerry（NB7080）蚊。3.Corriparta亚属。包括Acado（蚊）；Bambari；Corriparta（蚊）；Jacareacanga。4.Changuinola亚属。包括BeAr35646（白蛉）；BeAr41067（白蛉）；BeAr54342（白蛉）；Changguinola（白蛉）；Irituia。5.Kemerovo亚属。包括Baku（壁虱）；Bauline（壁虱）；CapeWrath（壁虱）；Chenuda（壁虱）；Fin,GreatIsland（壁虱）；Huacho（壁虱）；Kemerovo（壁虱）；Kena;Lipovnik（壁虱）；MonoLake（壁虱）;Mykenes（壁虱）；Nugget（壁虱）；Okhotskiy（壁虱）；Poovoot;Seletar（壁虱）；Sixguncity（壁虱）；Tindholmur（壁虱）；Tribec（壁虱）；WadMedani（壁虱）；aquinaHead（壁虱）。6.Palyan亚属。包括Abadina（库蠓）；D’Aguilar（库蠓）；Kasba（蚊）；Nyabira;Palyam（蚊）；Vellore（蚊）。7.流行性鹿病亚属（Epizooticdiseaseofdeersubgroup）。包括EHD,NewJersey;EHD,CanAlberta;IbAr22619;IbAr33853;Ibaraki。8.Warrego亚属。包括MitchellRiver（MRM10343）（库蠓）；WarregoCh9935（库蠓）。9.Wallal亚属。包括Mudginbarry；Wallal（CH12048）。10.非洲马病亚属（Africanhorsesickness）。包括9个血清型。11.马退行性脑病（Equineencephalosis）。包括5个血清型。12.未分属的。包括Ife,Japanant,Lebombo,LlanoSeco,Orunga,ParooRiver,T—50616（臭鼬分离），Umatilla。可能成员还有家兔融合细胞病毒（Rabbitsyncytiumvirus）。（三）轮状病毒属（Rotavirus）代表株为人轮状病毒（Humanrotavirus）。其它成员包括从人，牛，小鼠（EDIM），豚鼠，绵羊，山羊，猪，猴（SA11），马，羚牛，北美野牛（Bison），鹿，家兔，狗和鸭的分离物。按抗原性大约可分为A~G等7个组（洪涛1988）。（四）植物呼肠孤病毒属（PhytoreovirusPlantreovirussubgroup1）代表株为伤瘤病毒（Woundtumorvirus,WTV）。其它成员有水稻矮缩病毒（Ricedwarfvirus,RDV）。可能成员有水稻瘿矮病毒（Ricegalldwarfvirus）。（五）斐济病毒属（FijiPlantreovirussubgroup2）代表株为斐济病病毒（FDV）。其它成员根据形态、抗原性可分为以下3组：1组：谷类植物分蘖病病毒（Cerealtilleringdiseasevirus）；玉米组缩病毒（Maizeroughdwarfvirus）：马唐矮化病毒（Pangolastuntvirus）；水稻黑条矮缩病毒（Riceblackstreakeddwarfvirus）。2组：斐济病病毒（Fijidiseasevirus）。3组：Arrhenatherum兰矮病毒（Arrhenatherumbluedwarfvirus）；Lolium耳突病毒（Loliumenationvirus）；燕麦不孕矮缩病毒（Oatsteriledwarfvirus）。（六）胞浆多角体病毒属（CypovirusCytoplasmicpolyhedrosisviruses）代表株为家蚕胞浆多角体病毒（Bombymoricytoplasmicpolyhedrosisvirus）。其它成员根据RNA基因组节段的电泳图相可以分为12个型别：1型：从Bombymori分离2型：从Inachisio分离3型：从Spodopteraexempta分离4型：从Actiasselene分离5型：从Trichoplusiani分离6型：从Bistonbetularia分离7型：从Triphenapronuba分离8型：从Abraxasgrossulariata分离9型：从Agrotissegetum分离10型：从Aporophyllalutulenta分离11型：从Spodopteraexigua分离12型：从Spodopteraexempta分离可能成员还包括从大约150种