三七种子超低温保存技术规程

T/CSMAXXXX－2018三七种子超低温保存技术规程范围本标准规定了三七[Panaxnotoginseng（Burkill）F.H.Chen]种子超低温保存过程中的术语和定义、保存种子的选择、种子前处理、种子保存的量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于三七种子的超低温长期贮藏。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.6农作物种子检验规程水分测定GB/T3543.7农作物种子检验规程其他项目检验术语和定义下列术语和定义适用于本文件。三七Panaxnotoginseng（Burkill）F.H.Chen为五加科（Araliaceae）人参属（PanaxLinn.）多年生草本，别称田七。叶、果以及根状茎可入药，其纺锤根是著名跌打损伤特效药，具有很好的止血散瘀、定痛消肿功效，是《中国药典（2015）》收载的常用药材。三七果实Panaxnotoginseng（Burkill）F.H.Chenfruits球状果球，核果熟时红色，内有种子1~3颗。三七种子Panaxnotoginseng（Burkill）F.H.Chenseeds三七的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子黄白色，扁球状。质较软，易切开。种子超低温保存seedofcryopreservation指将经过前处理的三七种子置于液氮（-196℃）中保存。保存种子的选择果实采收8月至10月间，当果皮颜色由绿转为红时，即可采收，采收后去掉外层红色果皮、表面粘连物，取出种子。种子选择挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于4℃冰箱中保存备用（存放时间不超过1个月）。种子前处理生活力检测参照GB/T3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法检测种子生活力。随机抽取30粒种子，水浸20h，剥去外层种皮，沿种脊小心将种子分成2爿后放培养皿内，内侧面向下，滴入TTC溶液浸没种子，室温（25℃）避光放置4h后观察染色结果。生活力计算直接用肉眼对染色结果进行观察鉴定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鲜红色，且组织状态正常的，为有活力的种子；否则为无生活力的种子。计算：生活力=有活力的种子数/总的种子数×100%待保存的三七种子生活力应≥90%。含水量范围用尼龙网袋包裹三七种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为9000:1，室温条件下干燥处理4~18h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由53%~58%降至38%~48%。参照GB/T3543.6中的高恒温烘干法（130℃烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重×100%。种子保存量三七种子保存量不少于200粒，以便后期的活力检测使用。种子冷冻方式三七种子超低温保存的冷冻方式为分步冷冻法，即将装有种子和玻璃化保护溶液（PVS2）的5mL冻存管（每管40粒种子）置于4℃冰箱中0.5h，取出立即放入-20℃冰柜中1h，之后迅速投入液氮中保存。恢复培养种子解冻处理液氮中至少冻存24h后，取出1个冻存管，立即放入40℃水浴中快速解冻3min，而后用洗涤液（DS）浸泡3次，每次5min，并用纯净水冲洗干净。冻后种子生活力检测取出20粒解冻后的种子，参照5.1~5.2生活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力≥85%时视为保存成功。恢复培养将剩下20粒解冻后的三七种子，播种到带有无菌滤纸的发芽盒中，温度25℃～30℃，湿度70%～85%条件下培养。附录[1]TTC的配制和保存方法精密称取TTC1.00g，溶于100mL磷酸盐缓冲液中，制成浓度为1%的TTC溶液，调pH至6.5~7.5，置棕色瓶内4℃冰箱备用。磷酸缓冲液配置方法：溶液I：9.08g磷酸二氢钾溶于1L无菌水中；溶液II：35.81g磷酸二氢钠溶于1L无菌水中；I：II=2：3的比例混合制成磷酸盐缓冲液）[2]玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8mL、乙二醇13.6mL、二甲亚砜13.6mL，称取蔗糖13.7g，溶于MS溶液中，调pH至5.8后定容至100mL，高温高压灭菌，4℃冷藏。注意：配置时需戴手套，并在通风厨内操作。[3]洗涤液（DS）的配制及保存方法精密称取蔗糖41.1g溶于MS溶液中，，调pH至5.8后定容至100mL高温高压灭菌，4℃冷藏。参考文献[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].XX，中国医药科技出版社，2015：11-12[2]中国科学院中国植物志委员会.中国植物志.第54卷[M].科学出版社，2004（1978）：183[3]ShangChih-bei.PorterP.LowryII.Araliaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2007.13:489-491.[4