银杏黄酮提取

.银杏叶概述银杏（GinkgobilobaL.）又名白果，或鸭脚、公孙树，为银杏科、银杏属落叶乔木，是现存种子植物中最古老的孑遗植物，有植物界“活化石”之称。银杏是我国的特产植物，占世界总量的70%以上，它的叶和果都有较高的药用价值。银杏叶中药成分主要包括：银杏黄酮（Flavonoids）、萜内酯、聚异戊烯醇、有机酸、银杏酸等，其中银杏黄酮和萜内酯含量较大，其效用也被广为认可。另外银杏叶还含有39种营养及功能成分，这其中包括：蛋白质、糖、维生素C、维生素E、胡萝卜素、18种氨基酸、25种矿质营养微量元素，其中钙、磷、硼、硒含量较高，其他如人体所需的铁、氟、铜、锰、锌、铬等含量也较丰富，其中维生素C、维生素E、胡萝卜素、硒、锌、铜等作为营养性抗氧化剂与非营养性抗氧化剂-银杏黄酮、萜内酯、儿茶素、多酚类等对保护机体不受自由基所致的氧化和损伤发挥着重要的作用[1]。表1.1银杏中的主要化学成分[2]组成物质分子式存在部位白果酸（ginkgoicacid）C22H34O3外种皮、果肉氢化白果酸(hydroginkgoicacid)C22H36O3外种皮、果肉氢化白果亚酸(hydroginkolinicacid)C21H34O3外种皮、果肉白果酚(ginkgol)C21H34O外种皮、果肉银杏酚酚(bilobol)外种皮、果肉白果醇(ginnolo)C29H60O外种皮白果二酚C21H31O2外种皮银杏内酯A(ginkgolideA)叶、根皮银杏内酯B(ginkgolideB)叶、根皮银杏内酯C(ginkgolideC)叶、根皮银杏内酯D(ginkgolideD)叶、根皮白果叶素C32H22O10叶莽草酸C7H10O5叶白果内酯(bilobalide)叶黄酮类化合物(flavonoides)叶、种皮原儿茶酸(protocatechuicacid)种皮儿茶酚(pyrocatechol)种皮胡萝卜苷(duacosterol)种皮芝麻素C22H18O6茎白果酮C15H20O2茎现存最早文献《本草品汇精要》(明.刘文泰)记载，5000年前我国用银杏叶作药，用于肺虚咳喘、胸闷心痛等症。随着科学进步，对银杏叶制剂的现代药理学较深入研究，以及临床应用已表明，银杏叶制剂具有扩张冠状动脉、增加脑血流、改善微循环、抗血小板聚集、降血黏度、降血脂、降血压等功效。所以，它能防治冠心病、高血脂症、高血压病、脑出血、脑动脉硬化、脑栓塞、脑中风和老年性痴呆症等心脑血管疾病，还能促进毛发生长、保护皮肤。因此，银杏叶制剂已成为世界许多国家研究开发的热门药物[3]。随着研究工作的深入，提取有效成分的工艺也不断更新，总的趋势是朝着提高有效成分收率，减少有害成分和杂质在药物中的残留，减少环境污染等方向发展。1.1黄酮类化合物及应用1.1.1黄酮类化合物黄酮类化合物属于酚类化合物。在银杏叶中黄酮类化合物含量较高。迄今为止，从银杏叶中已经分离出约30多种黄酮类化合物，已经明确结构的有20多种，根据其化学结构可分为3类：单黄酮类、双黄酮类、儿茶素类。单黄酮苷类的苷元主要有山奈黄素(Keampferrol)、槲皮素(quercetin)、异鼠李黄素(isorhamnetin)、黄色黄素(luteolin)等。山奈黄素和槲皮素相应的苷类即在C3-OH上与1或2个糖形成苷，常见的糖有葡萄糖、鼠李糖或葡萄糖与鼠李糖组成的双糖。槲皮素不溶于水，溶于沸乙醇(1:23ml)，在无水乙醇中卫1：290ml的溶解度。槲皮素的C3-OH与云香糖形成苷称为芦丁(rutin)，由于在分子中引入强亲水基，则溶解度提高。水(1:8L)、沸水(1:200ml)、沸甲醇(1:7ml)、微溶于乙醇。由于山奈黄素、黄色黄素、异鼠李黄素等苷元衍生的各类苷的溶解度变化和槲皮素相似，因此，黄酮苷类的提取以选用热水或热的甲醇、乙醇或其水溶液作为提取剂居多【4】。图1.2黄酮类化合物双黄酮类化合物有六种：银杏黄素(ginkgetin)、异银杏黄素(isoginkgetin)、白果黄素(pliobetin)、阿曼托黄素(amentolflavone)、西阿多黄素和5’-甲氧基白果黄素。儿茶素根据母核2位碳原子旋光度不同及5’位是否含有羟基分为4种：儿茶素、表儿茶素、没食子酸儿茶素和表没食子酸儿茶素。1.1.2应用银杏叶黄酮类化合物能促进大脑循环代谢，改善记忆功能，增加脑缺血时组织ATP和磷酸肌酸的含量，降低乳酸含量，对脑缺血具有明显保护作用；能促进毛发生长，减少脱发，因此可应用于护发剂中，能存进体表毛细血管的血液循环，清除皮肤表面的过氧化物和自由基，所以提取物添加到护肤化妆品中能滋润皮肤，减少黑色素的形成，延缓皮肤的衰老过程；具有抗菌消炎、抑制致癌启动因子(TPA)及治疗过敏症和老年痴呆病等作用[5]。黄酮类化合物对治疗冠心病、心绞痛、高血压和支气管哮喘等有显著效果，能够调节生理功能，延缓衰老，增强免疫力[6]，防治由于血管老化和脑血管供血不足所致的疾病。银杏黄酮有强烈的清除细胞内自由基的作用，能降低细胞的氧化代谢,对脑和四肢动脉血流失调引起的一系列心脑血管疾病有明显和独特的疗效[7-11]。银杏叶黄酮类化合物除用于医药和化妆品上外，今年来又扩展到食品、饮料和防治农作物病虫害等方面。黄酮类化合物在食品工业上有着广泛的应用，可作为天然着色剂、抗氧化剂和功能性食品的原料。1.2萜内酯及应用1.2.1萜内酯类化合物萜内酯类化合物是银杏叶中独有的具有特殊分子结构和显著药理活性的成分，包括二萜内酯和倍半萜内酯，其中二萜内酯有5种，即银杏内酯(ginkgolide)A、B、C和M，倍半萜内酯一种即白果内酯(bilobalide，BB)。结构式如下：图1.1内酯类化合物的结构式1.2.2应用银杏萜内酯A、B、C、J和M，是血小板活化因子的拮抗剂，能有效地抗血栓形成，对防治血管栓赛疗效显著，已用于临床。在已知血小板活化因子对抗剂中，银杏萜内酯B对新陈代谢有较全面的调理作用，收到当今药学家的关注，导致半合成及这类化合物细胞组织培养的研究。白果内酯对神经疾病(精神病、脑病、脊髓等)具有治疗作用，它能确保神经元和轴突完整无缺[12]。2.银杏叶黄酮提取方法黄酮类化合物多具有游离额酚羟基，一般易溶于极性较大的有机溶剂和碱性溶液中。黄酮类化合物多以黄酮苷的形式存在，少数以黄酮苷元的形式存在。黄酮苷易溶于水、无水乙醇、甲醇和乙酸乙酯等，不溶于非极性有机溶剂。由于结构上具有酚羟基，在稀碱液中能增加其溶解度。但提取此类化合物时，除了考虑溶解度外，还需考虑其结构稳定性、羟基存在部位及后处理工艺、设计合理的提取方法。目前，银杏叶黄酮类化合物的提取方法主要有：有机溶剂法、微波法、超临界流体萃取法、超声波法、吸附树脂法等。2.1溶剂法溶剂法即通过有机溶剂(乙醇、丙酮、甲醇等)浸泡叶子，浓缩水析，离心过滤，得到银杏浸膏，产率为12~15%，黄酮含量为2.10~5.10%；再用液-液萃取法，得率约0.17~1.10%，黄酮含量15~18%。溶剂提取法是目前国内外应用最广泛的银杏黄酮的提取方法之一。常用的溶剂主要有：甲醇、乙醇、丙酮、石油醚等。由于甲醇、丙酮等毒性强、挥发性较高，因此一般采用乙醇作为萃取剂比较适宜。乙醇作为萃取剂具有选择性好、产品得率高等优点，但是采用乙醇生产的较高成本使其应用受到一定的限制。王晓等[13]采用乙醇为溶剂，用正交实验法确定制备银杏叶提取物的最佳工艺条件：乙醇体积浓度60锕，回流温度80℃，提取时间3h。张济龙[14]等对几种银杏叶黄酮提取溶剂研究结果表明，NaOH-水溶液提取效果最好，NaOH-乙醇溶液次之。在0.25%NaOH-乙醇溶液中，银杏叶黄酮的最大提取率比用乙醇提取提高28.4%，提取时间缩短0.5h；在0.1%NaOH-水溶液中，银杏叶黄酮的最大提取率提高46.5%，提取时间缩短1h。2.2微波法微波法利用不同组分吸收微波能力的不同，选择加热一些成分，使之从体系中分离进入萃取剂。近年来，微波因促进反应的高效性和强选择性及其操作简便，副产物少，产率高及产物易提纯等优点，已经被广泛应用于生化蛋白质水解和有机合成、酯化等反应，科研人员已将微波应用于天然产物的浸提过程，有效地提高了效率。陈金娥等[15]，利用单因素试验和正交实验确定了微波法提取银杏叶黄酮的最佳条件：温度55℃，功率800W，液固质量比70：1，时间6min，提取率可达3.578%。实验表明，提取率比传统的溶剂法提高，提取速度也显著提高，所需时间大幅度缩短，且溶剂较后者损耗少得多。因此，微波法较传统索氏提取等优势显著。微波能快速促进银杏叶细胞中有效活性成分的溶出，可能是交频磁场、电场作用下，极性分子取向随电场方向改变而变化，从而导致分子旋转、振动或摆动，加剧反应物分子运动及相线间碰撞频繁率，使分子在极短时间内达到活化状态，比传统加热方式均匀、高效；且分子的剧烈运动导致细胞内部结构的破坏，使黄酮分子从细胞里扩散到细胞外的溶剂中，阻滞扩散过程不存在了，只有黄酮分子的自由扩散过程，扩散阻力减少很多，所以微波提取的效率比传统提取高得多，有效强化扩散过程[16]。微波应用于提取，特点是：快速升温，省时，提高效率；加热过程不需对介质加热而直接加热物料，能耗低[17]。与超临界CO2萃取相比，微波萃取设备简单价廉，操作简便，适用面大更利于普及。微波法的局限在于不适合热不稳定成分的提取，而银杏黄酮是热稳定的，理论上适用。2.3超声波法植物药材的有效成分多存在于细胞内，结构致密的细胞壁无疑是阻碍提取的重要屏障。超声波提取利用超声产生的强烈振动，形成空化效应，破坏植物药材的细胞壁，从而促进溶媒进入细胞内，加速有效成分溶解到溶媒中，超声波提取可缩短提取时间，提高有效成分的提取率，减少溶剂用量，不需高温条件，避免了对热不稳定成分的破坏，可与其他提取技术联合应用。王延峰等[18]研究了银杏叶黄酮的超声提取法，并于连续热回流中的索氏提取作了比较研究，得出了超声提取法优于索氏提取法的提取的结论。2.4酶解法药材的有效成分多存在于细胞内，结构致密的细胞壁有纤维素等物质构成，则提取过程中需克服细胞壁产生的阻力。因此可采用酶解法破坏细胞壁结构，减少传质阻力，酶解法即是在提取中利用酶催化的专一、高效且较温和地分解植物组织的一种新方法，利用酶解加强提取的传质过程是酶解法的实质。王敏等[19]利用纤维素酶辅助提取银杏叶黄酮类化合物的提取，实验表明，此方法提出的黄酮含量高于EGB761的质量标准，提取率在传统的醇提法的基础上提高近三分之一。2.5吸附树脂法以上几种提取方法得到的一般是银杏黄酮的粗提物，黄酮含量不高，还需进一步精制以提高银杏黄酮、萜内酯的含量，降低银杏酚酸类物质的量。吸附树脂法是最常用的提纯方法之一，用树脂吸附时，效果主要取决于树脂的吸附性能，吸附作用的本质是吸附剂与吸附物质分子间的范德华力，采用的树脂主要有聚酰胺吸附树脂、聚苯乙烯树脂、硅胶、大孔树脂以及硅藻土等。钦富华等[20]探讨大孔吸附树脂同时纯化银杏叶黄酮苷和萜类内酯的工艺，实验表明，采用D101型大孔树脂分离纯化效果最佳，工艺条件为：上样液生药质量与树脂比为1：1，20%(体积分数)乙醇浓度作为除杂溶剂，洗脱体积为5BV，60%(体积分数)乙醇溶液作为洗脱液，洗脱体积为4BV.纯化物中黄酮苷和萜类内酯平均质量分数为24.93%和7.36%。Zhang等[21]使用聚酰胺吸附树脂，优化分离操作工艺，将银杏提取物中总黄酮含量从24.0%提纯至55.0%。2.6超临界流体萃取技术超临界流体萃取技术是一种环境友好的新兴技术，应用最普遍的萃取剂是CO2.超临界流体是温度及压力均处于临界点以上的流体(如图2.1)，具有很强的溶解低挥发性物质的能力。在超临界条件下，流体的很多性质都处于气体和液体之间(黏度和扩散系数与气体相近，密度与液体相近)，此时溶解性能和传质能力良好。图2.1纯物质经典相图超临界萃取过程分萃取和分离两个过程。萃取阶段即改变条件(温度和压力)来改变溶解度，溶出目标成分，进行萃取；分离阶段即改变条件使CO2以气态形式挥发与组分分离，萃取剂无残留，且可循环使用，节约而环保。张玉祥等利用超临界CO2萃取技术提取银杏叶有效成分，所得GEB高于银杏叶标准提取物的国际质量标准，黄酮含量可高达27%。超临界CO2萃取技术省时、节能，同时适用于对于热不稳定和易氧化物质的提取。但该技术的局限性在于设备投资费用高，且为高压设备存在安全等问题，在工业上难于广泛推广。3.黄酮类化合物的测定3.1含量测定方法目前，国内外没有有关银杏叶黄酮类化合物的测定公开普遍的控制质量标准，常用的方法有：分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)和超临界流体色谱法(SFC)等。3.1.1分光光度法国内使用较多的是分光光度法，黄酮类化合物与Al(NO3)3在碱性条件下络合产生有色反应，其机制是黄酮类物质在碱性条件下骨架的1，2号碳氧键打开成查耳酮而显色，芦丁溶液为标准溶液，于510nm处测其吸光度。该方法简单易学，但若样品未纯化，含有杂质，测定值略高于实际黄酮含量。在测定提取液中黄酮含量时可将显色后的溶液先离心或过滤，除去絮凝物，再测定吸光值，这样可改善分析结果。3.1.2高效液相色谱法(HPLC)HPLC是测定银杏叶及制剂中黄酮类化合物的有效方法，黄酮类化合物是重要的天然产物，是HPLC最早分析的样品之一，Hasler[C3-4]在1990年用HPLC方法定量地测定了银杏叶中的黄酮含量并建立了模糊表征银杏中33种黄酮的指纹图谱。HPLC既可以直接分析黄酮苷的含量，也可以水解分析苷元的含量，再通过转化系数求得黄酮总含量。3.1.3毛细管电泳法(CE)毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道、高压电流电场为驱动力的新型液相分离技术，其原理是在缓冲体系中引入表面活性剂，利用溶质在水相和胶束相中的分配差异进行分离，具有高效、快速、用样量少、重现性好、不易污染等优点。YuhuaCao等[22]建立了快速、高效、高灵敏度、相对简单的毛细管电泳-电极法测定银杏黄酮的方法，通过记录图形完成电色层分析,在最佳条件下分离并鉴定了表儿茶素、儿茶素、芦丁、芹黄素、木犀草素、棚皮黄酮6种银杏叶黄酮类化合物。3.2抗氧化性能测定方法3.1.1黄酮类化合物的抗氧化性黄酮类化合物是天然的强抗氧化剂[23],主要表现在以下3个方面：一是清除自由基和活性氧[24]。黄酮具有很强的供氢能力，在体外具有清除自由基如羟基、超氧阴离子和过氧化氢自由基等功能；二是螯合金属离子[25]。黄酮可以和金属离子如铜离子等结合，催化脂质过氧化物的分解反应，引起自由基的减少。三是保护和还原体内的抗氧化剂[26]。银杏黄酮是使体内的抗氧化剂如VE、VC重新恢复活性，起到抗氧化的作用。3.1.2抗氧化性的测定方法抗氧化剂的活性的测定方法有很多，苏俊锋等指出测定抗氧化剂活性有三要素：基质体系、方式添加和测定方法种类，改变其中任一要素都会引起结果的不同。因此，用一种测定方法准确测定抗氧化剂活性是不可能的，需要多种体系多种方法的考察才能全面客观的反映抗氧化剂的活性。黄酮类化合物主要通过清除自由基来实现抗氧化作用的，不仅能清除自由基，而且可以直接捕获自由基反应链中的自由基，阻断自由基链反应，起到预防和断链的双重作用。黄酮类化合物的抗氧化性测定方法主要有：DPPH自由基清除实验、羟自由基清除能力实验、还原力测定实验、H2O2清除能力测定实验、对抑制鼠脑组织匀浆中脂质氧化的效果实验、对大豆油脂过氧化值的影响实验。4.本论文的意义及思路4.1意义银杏是我国的特产植物，占世界总量的70%以上，它的叶和果都有较高的药用价值。黄酮类化合物为银杏叶的主要有效成分，具有抗氧化、抗癌、降血糖、防治心脑血管疾病及抗炎、镇痛等作用，可以应用于医药、食品、化妆品及农林病虫害防治上。我国虽是世界银杏的最大产地，但国内黄酮类化合物开发利用技术较国外落后，且黄酮类化合物在植物中的含量不高，提纯工艺复杂得率不高，纯度低，投资大，限制了其在实际中的应用。综上所述，研究银杏黄酮的提取分离技术，研发出快速、有效、低耗的提取提取分离方法，朝着提高有效成分收率，减少有害成分和杂质在药物中的残留，减少环境污染等方向发展，明确银杏黄酮的有效活性形式，制备高质量的银杏黄酮提取物对提高我国银杏产品的国际竞争力，加快开发利用银杏资源具有重要的意义。4.2思路本论文主要内容有两大部分，一是银杏黄酮的提取分离方法研究，二是银杏黄酮的表征。关于银杏黄酮类化合物的提取分离方法研究，目前国内大多采用醇提法，但醇提法的局限在于用时长、溶剂耗损大且杂质难以控制，所以应该对此改善，结合其他方法。近年来，研究出了很多银杏叶黄酮的提取新技术，比如：超临界流体萃取技术、超声法、微波法、酶解法等。超临界流体萃取技术是环境友好的新兴技术，萃取剂无残留，且可循环使用，但其设备要求高，费用高，难以在工业中推广，所以本论文不采用该方法。本论文拟采用纤维素酶辅助微波提取工艺，采用单因素实验方法确定最佳工艺条件，考虑影响因素主要有纤维素酶的浓度、酶解时间、酶解温度及酶解酸碱度、微波时间、料液比、乙醇浓度等，用石油醚萃取除去叶绿素及脂质，再旋蒸浓缩干燥，采用分光光度法测定其浓度，得出得率及含量，确定其最佳工艺条件。黄酮类化合物的表征：对实验产品进行红外、紫外-可见、高效液相色谱法进行表征，且对实验产品进行抗氧化性能测定。参考文献[1]张迪清，何照范.银杏叶资源化学研究[M].北京:中国轻工业出版社，2000.191.[2]董雯雯.银杏叶黄酮类化合物的提取与分离技术的研究[D].山东科技大学，2008.[3]安鑫南.林产化学工艺学[M]北京：中国林业出版社，2002.355.[4]吴忠萌.林产精细化学品工艺学[M]北京：中国林业出版社，2002.303.[5]卢元芳，宫霞.银杏叶黄酮类化合物的提取和药理作用[J].曲阜师范大学学报，1999,25(3):95-96.[6]高晗，孙俊良，孔瑾等.银杏叶中黄酮类化合物的最佳提取工艺研究[J].食品研究与开发，2005，2(1)：82-84.[7]周维书，黄振安，郑爱云编著.银杏叶及其制剂[M].北京:化学工业出版社，1995.22～45，73～75.[8]OyamaY,HayashiA,UehaT.Ca2+-inducedincreaseinoxidativemetabolismofdissociatedmammalianbrainneurosis:EffectofextractofGinkgobilobaleaves.JapanJPharmacol,1993,61(2):367～370.[9]OyamaY,FuchsPA,KatayamaN,etal.Myricetinandquercetin,theflavonoidconstituentsofGinkgobilobaextract,greatlyreduceoxidativemetabolisminbothrestingandCa2+--loadedbrainneurons.BrainResearch,1994,635(1):125～129.[10]RapinJR,YoaRG,BouvierC,etal.EffectsofrepeatedtreatmentswithanextractofGinkgobiloba(EGb761)andbilobalideonliverandmuscleglucogencontentsinthenon2insulin2dependantrat.DrugDevelopmentResearch,1997,40(1):68～74.[11]ImdronaiM,MarcocciL.PeroxylradicascavengingactivityofGinkgobilobaextractEGb761.BiochemicalPharmology,1995,49(11):1649～1655.[12]安鑫南.林产化学工艺学[M]北京：中国林业出版社，2002.357.[13]王晓，廖克俭，戴跃玲.银杏叶有效成分提取工艺研究.东华理工学院学报.2007,30(2):181-184.[14]张济龙，张光先，张凤秀等.银杏叶黄酮提取溶剂研究.西南农业大学学报.1999，21(2):68-70.[15]陈金娥，匡强民，张海容.正交优化-微波辅助提取提取银杏叶黄