肿瘤细胞耐药性与Keap1Nrf2P62的研究进展

肿瘤细胞耐药性与Keap1/Nrf2/P62的研究进展【摘要】肿瘤细胞耐药性是导致化疗失败及愈后不良的重要原因。在肿瘤治疗中，化疗药物作用于肿瘤细胞，Keapl/Nrf2通路上调,Nrf2及其介导的下游二相抗毒酶表达增高，是导致肿瘤细胞耐药性升高的重要机制。近年来有报导认为自噬通过促进肿瘤细胞产生凋亡抵抗从而产生耐药性。P62参与调节Keapl-Nrf2通路，影响了Keapl的基础水平和Nrf2的基本活性，对肿瘤细胞耐药都具有重要意义。本文对肿瘤细胞耐药性与P62/Keapl/Nrf2通路的相互作用和分子机制进行综述。【关键词】Keap1；Nrf2；P62；自噬；肿瘤细胞耐药性肿瘤严重影响着人类健康，目前人类已知的癌症种类已经超过200多种。通常情况下，化疗对于大多数癌症患者能取得较好疗效，但少数患者会走向难以治愈的耐药阶段，肿瘤细胞产生耐药性仍是目前肿瘤治疗中面临的一大难题。在反复多次使用化疗药物后，少数肿瘤细胞能抵抗化疗药物的杀伤作用而存活下来并不断增殖，导致患者肿瘤复发，这严重影响了癌症患者的生存质量。肿瘤细胞为了适应高氧化应激(ROS)的内环境，抗氧化能力会得以提升并可导致其耐药性增强。因此，研究肿瘤细胞适应这种氧化应激的相关机制，有助于寻找克服肿瘤耐药的途径。肿瘤细胞产生耐药性是肿瘤化疗失败的关键因素。肿瘤细胞对于化疗药物的耐受性分为先天性耐药和获得性耐药。先天性耐药是指肿瘤细胞在未接触药物时，耐受相关因子就已存在肿瘤细胞内；获得性耐药则是接触药物后，肿瘤细胞内相关信号通路代偿性反应，某些基因或其表达发生改变，使得化疗效果降低。肿瘤产生耐药性的机制多而复杂，包括凋亡抵抗、细胞内药物泵出增强、核酸损伤修复能力增强、P糖蛋白（P-gp）表达增加、多药耐药相关基因（Mdr）的表达增多以及活性氧(ROS)水平升高等。肿瘤耐药性与ROSROS是有氧代谢产生的一类活性含氧化合物的总称，主要包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢和单线态氧等，ROS能作为信号分子参与对肿瘤细胞增殖、分化和凋亡等多种信号转导途径的调控ADDINNE.Ref.{473DC308-5EA0-4EC2-8650-A474CCE888BE}[1]。在肿瘤的发生发展和恶化过程中，许多内源和外源性机制参与其中：肿瘤基因的激活、线粒体功能失常以及代谢异常等肿瘤细胞内部因素均可导致肿瘤细胞内ROS水平的升高。最近，有学者指出细胞内ROS水平轻度增高，能降低细胞内P-gp的水平；而大量ROS能引起细胞内的氧化应激，从而增加Mdr的表达，进一步增加P-gP的产生，肿瘤细胞获得耐药性状。在肿瘤细胞中，致癌基因一方面增加ROS的产生，当处于持续高水平的ROS诱导状态下，肿瘤细胞提高自身氧化应激水平从而获得ROS抵抗性，促肿瘤细胞存活，产生耐药性，以此来促进肿瘤细胞的增殖；另一方面刺激一些ROS清除酶的表达发挥抗氧化机制，来最大程度上降低氧化损伤。通过激活ROS清除的酶系统来抵抗ROS的生成是肿瘤细胞抵抗氧化还原稳态的主要机制ADDINNE.Ref.{86DB2EB8-21FE-4F47-9D5A-EC4F0257777C}[2]。肿瘤细胞抵抗氧化应激的平衡机制会诱导细胞内多种转录因子和信号通路发挥促细胞存活作用，并进一步导致肿瘤细胞耐药性的产生ADDINNE.Ref.{B18613EC-83E7-4E55-91B5-F2149ED05B05}[3]，包括自噬、Keap1/Nrf2通路、Hif-1、硫氧还蛋白和GSH抗氧化系统等。例如，肿瘤细胞可以通过激活转录因子HIF-1来应对ROS应激，增加糖酵解，促进细胞的存活ADDINNE.Ref.{7539F780-3148-4C8F-B81A-BFD1C315C43C}[4]。化疗药物作用，肿瘤细胞ROS升高导致错折叠蛋白堆积引起内质网压力应激，肿瘤细胞通过诱导自噬降解错折叠蛋白，使得肿瘤细胞存活并产生耐药性ADDINNE.Ref.{3544AF1B-5804-4840-969F-BBFAD2865FF4}[5]。在顺铂耐药的卵巢癌SKOV3DDP细胞中,Keap1/Nrf2/自噬通过诱导下游相关的转录因子表达，从而避免了ROS刺激引起的细胞凋亡，细胞存活，获得耐药性ADDINNE.Ref.{B7A54469-6C1B-4651-AD09-3774CBA1A19B}[6]。因此，保持ROS的相对平衡对正常细胞的生长和生存十分关键,同时也表明破坏这种平衡机制可以成为治疗肿瘤的一个好方法。2.肿瘤耐药性与Keap1/Nrf2通路Keap1/Nrf2通路是细胞内防御氧化清除ROS的一个重要机制ADDINNE.Ref.{C3453263-09F4-48AA-8E81-687B717AEB58}[7]。人体通常会暴露在各种ROS刺激的氧化应激环境中，持续的氧化应激会造成细胞结构：脂质、蛋白质、核酸的损伤等，这些氧化损伤会诱发人体产生炎症、心血管疾病、神经变性性疾病甚至癌变ADDINNE.Ref.{CD2DD1A5-EC45-4567-AAF8-8F55539EC9B3}[8]。细胞内参与抗氧化反应调节有三个主要细胞成分:Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1),核因子NF-F2相关因子2(Nrf2),抗氧化反应原件(ARE)ADDINNE.Ref.{FAC1D4A7-A56E-4162-8D02-4FA63FA25B78}[9]。Keap1的N’末端BTB区是E3泛素连接酶的作用底物，可致使Nrf2泛素化并最终被E3泛素连接酶降解。Keap1的C’末端是DGR区，连接肌动蛋白，对Nrf2起锚定作用。Nrf2包含Neh1-Neh7七个功能区，位于Nrf2C‘末端是七个亮氨酸拉链组成的亮氨酸拉链（bZIP），有助于其与ARE的连接；N‘末端的Neh2区包含七个赖氨酸残基，负责和Keap1上C‘末端的Kelch区结合并锚定在肌动蛋白骨架上ADDINNE.Ref.{6F4A01B4-46FA-44F0-A8A3-D5D1588EACD5}[10]。Keap1/Nrf2/ARE通路调节细胞抵抗氧化应激，保持细胞维持在相对平衡状态，Nrf2为ARE介导基因表达的主要调控者，Keap1也被称为INrf2,对Nrf2发挥负调节作用ADDINNE.Ref.{635CAD43-7437-4C7E-B6F0-10EC050E09FD}[11]。Keap1/Nrf2/ARE通过上调下游各种细胞保护性二项抗毒酶来发挥最终的抗氧化作用，因为这些二项抗毒酶有相对较长的半衰期，如GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、醌氧化还原酶-1（NQO1），超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽S-转移酶（GST），谷胱甘肽过氧化物酶（GPx），血红素加氧酶-1（HO-1），谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCL）等ADDINNE.Ref.{480198BB-146F-4FE8-9D21-973526145032}[12]。Nrf2和它的胞质接头蛋白Keap1则是细胞抗氧化反应的重要调节者。在面对外界应激压力时，细胞自我解毒以维持自身内环境的能力就显得尤其重要ADDINNE.Ref.{91AD8888-A407-45DE-AD54-3DD2B1041954}[13]。在正常情况下，Keap1将Nrf2固定在胞质的肌丝上，联合泛素化连接酶将Nrf2水解；一旦细胞受到亲电子或氧化物攻击，Keap1就会释放Nrf2入核，稳定的Nrf2进入核内与ARE原件结合，从而激活下游GAPDH、GCLC、NQO1、HO-1等一系列二项解毒酶的表达ADDINNE.Ref.{F829CC68-7419-47ED-9D42-30E48CC599E4}[14]。Keap1是如何释放Nrf2的具体机制还没有定论：1）Keap1与蛋白酶体泛素化连接酶连接，通过调节泛素化连接酶决定是否释放Nrf2ADDINNE.Ref.{C7C299B5-D73D-40FB-BB73-93DE74AD41A6}[15]。2）亲电子物质作用，Keap1与泛素化连接酶分离，使Nrf2不能被泛素化水解，Nrf2增多ADDINNE.Ref.{A49ADEDD-D1E4-4635-82B8-562CF57CB7DC}[16]。3）在人体受到亲电子或氧化物攻击时，Keap1中第27个半胱氨酸中的两个或更多个半胱氨酸残基可能作为次反应的关键感应部位调节Nrf2的表达，Nrf2会上调二项抗毒酶的表达。氧化物质通过与Keap1半胱氨酸残基反应，从而激活Nrf2通路ADDINNE.Ref.{C568D68B-0C3C-40F1-96B7-13661A87CFDE}[17]。Nrf2水平的上调促进癌症细胞的存活，从而有助于肿瘤细胞产生耐药性ADDINNE.Ref.{B1D5A12A-45C2-40DD-8B01-A1730B5B5D89}[18]。AdamLister等认为，可以通过药理学水平控制Nrf2的水平和活性，以此来控制胰腺癌细胞的生长以及化疗敏感性ADDINNE.Ref.{08B6FAEE-5AD2-4EE7-97C1-2E740339F070}[19]。简而言之，肿瘤细胞为了抵抗化疗药物的攻击，其Keapl-Nrf2通路多处于过度激活状态，高表达的Nrf2被认为是肿瘤耐药的标志。3.肿瘤细胞耐药性与自噬3.1自噬自噬是细胞在营养缺乏或能量代谢障碍的情况下，一种通过降解代谢细胞内错折叠或错聚集的蛋白质和细胞器来维持自身内环境稳定的过程ADDINNE.Ref.{66FC317F-6FDE-4A0B-A6E9-27BAD408EE2E}[20]。P62/SQSTEM1偶联于微管相关蛋白轻链3（LC3-II），作为一种调节因子参与自噬体的构成，在自噬的中、晚期被降解ADDINNE.Ref.{B88D5D0A-46BE-49D5-AA45-9277CAA17A99}[21]，细胞内整体p62水平的表达与自噬活性存在负相关。在自噬开始阶段，细胞将自身的蛋白质，细胞器和细胞质包裹进自噬小体内，这些自噬体通过与溶酶体结合，发育成成熟的自噬溶酶体将锚定的蛋白质、细胞器等结合溶酶体水解酶水解，来维持细胞自身代谢平衡。自噬被认为是II型细胞死亡，也叫细胞非程序性死亡来区别于细胞凋亡。与细胞凋亡不同，在大多数情况下，细胞自噬是通过适应外部环境变化从而发挥促进细胞存活作用ADDINNE.Ref.{E15EF10A-26A0-4E52-809E-542281C6847B}[22]。当外界环境施加压力，例如：化疗、放疗等情况引起的代谢性DNA损伤，自噬被激活，导致细胞的生存或死亡ADDINNE.Ref.{2F2FC829-85A4-4662-8131-29AC9259E4CA}[23]。近来有大量研究数据表明自噬在肿瘤发生过程中存在双面性：一方面，细胞被诱导的自噬可减轻细胞代谢压力，来保护细胞基因组的完整，从而产生耐药性，也就是促肿瘤细胞生存作用ADDINNE.Ref.{E3D39B47-AB93-4D64-8F7A-9295849C2492}[24,25]；另一方面，自噬性死亡也可能是凋亡耐受的肿瘤细胞的一种死亡方式ADDINNE.Ref.{5B00D379-590C-41EF-B993-969C2CE00BCD}[26]ADDINNE.Ref.{3DFDEF11-CDE7-4B2E-AA53-BAD52EAEBE1B}[27]。未来，自噬在逆转肿瘤脑药性研究中可能成为重要靶点。3.2自噬促进肿瘤细胞产生耐药性自噬在化疗过程中促进肿瘤细胞产生耐药性，这也是化疗失败以及肿瘤复发的重要原因ADDINNE.Ref.{0EA212C0-7F19-463C-B270-90844251A1F7}[28]。抗癌治疗、细菌感染以及ROS引起氧化损伤均与蛋白质错折叠有关，错折叠蛋白质在内质网内膜聚集，诱发内质网压力应激，若这些错折叠蛋白被蛋白酶体或自噬降解，则细胞存活产生耐药性。但如果持续的内质网应激得不到缓解，则诱发内质网应激压力，发挥抗癌作用，细胞凋亡ADDINNE.Ref.{8B7D8AFE-806A-42BC-A3B6-7525F9669249}[29]ADDINNE.Ref.{D3498481-70FD-4549-BF8B-EBC534EB11EC}[30]。p62蛋白作为泛素化蛋白自噬性降解的接收器或适配器，可以在顺铂刺激人卵巢癌HOCCs细胞的过程中，和泛素化蛋白或蛋白聚合物结合，再将它们定位到自噬小体中，通过自噬降解错折叠蛋白从而避免内质网压力应激引起的细胞凋亡ADDINNE.Ref.{EAB7FB7D-B495-45AD-A0F8-197B443D8D1D}[30]。大量研究表明，抑制自噬，会使耐药肿瘤细胞恢复对化疗药物的敏感性ADDINNE.Ref.{A6EF69DE-E95E-4D1A-AAB1-97572497C3FF}[22]，例如：敲除LC3会使耐药细胞恢复其对曲妥珠单抗的敏感性ADDINNE.Ref.{C2A0684F-F96E-4924-9FF9-03CD5519E7F2}[31]；在食管癌和结肠癌细胞中，抑制自噬会提高细胞对顺铂和5-氟尿嘧啶等化疗药物的化疗敏感性ADDINNE.Ref.{F81A5D23-420D-4D35-9480-32FEC4590904}[32,33]；在慢性髓细胞性白血病细胞中，甲磺酸伊马替尼通过抑制自噬而发挥杀伤肿瘤细胞作用ADDINNE.Ref.{1F581EE0-FD0E-495E-BA15-71BD422AE0BF}[34]；敲除p62后，可恢复耐药肿瘤细胞对顺铂的敏感性；自噬抑制剂3-MA作用于耐药肿瘤细胞后，顺铂诱导的泛素化蛋白在耐药肿瘤细胞中聚集，并且凋亡细胞数目增加ADDINNE.Ref.{9A96BCED-6DC3-43CC-88EA-22DCB6BE48AB}[30]。4.Keap1/Nrf2/P62与肿瘤耐药的相关性P62作为自噬中的标记蛋白，它绑定泛素化蛋白聚合物并将它们运送到自噬体进行自噬降解。研究发现，顺铂耐药的人卵巢癌SKOV3DDP细胞中p62含量多于SKOV3细胞。并且，用H2O2作用于耐顺铂的SKOV3DDP细胞后p62会被自噬降解；敲除p62后，顺铂耐药的SKOV3细胞耐药性被逆转ADDINNE.Ref.{266CC5F3-218F-44D2-9C4A-72AA4B17FD02}[6]，这提示p62对于耐药性的形成有很重要的作用。顺铂耐药细胞避免了氧化应激诱导的细胞凋亡，是因为p62有效地调节Keap1/Nrf2通路使得SKOV3细胞获得顺铂耐药性。P62作为一种多功能蛋白，直接与Keap1的相互作用，介导Keap1与泛素化合物以及自噬体连接从而自噬性降解，使Nrf2稳定地在细胞核内积累，从而激活下游一系列细胞保护性基因ADDINNE.Ref.{5F2AEF64-1509-42B3-B634-963C7629B130}[35]ADDINNE.Ref.{43DF7E83-9DA5-4FBD-8325-2C385B525F09}[36]。Fan,W.等认为，在氧化应激条件下，keap1-nrf2-p62复合物的形成对于清除泛素化聚合物很有必要ADDINNE.Ref.{21DF3CD7-015D-4154-A79D-B9B5401CBC3D}[37]。有报道认为，两分子的Keap1是通过与一分子的nrf2上neh2区的DLG和ETGE两个位点连接，且ETGE区的连接力强于DLG区。p62会竞争keap1与nrf2连接弱的DLG位点，导致nrf2与keap1的解离ADDINNE.Ref.{9981187E-EC18-4460-B8BE-17BCD9F83F9B}[38]（如图1所示）。但目前关于keap1-nrf2-p62这一连接复合物仍然存在争议，Jain,A.等则认为keap1-p62连接的KIR位点与p62-LC3的LIR位点相似，这便造成keap1、LC3竞争p62ADDINNE.Ref.{F449C6AC-C554-4284-8A04-A90C54A4A853}[39]。卵巢癌细胞中，Nrf2通过诱导自噬从而导致卵巢癌细胞耐药、Nrf2高表达；并且下调Nrf2的表达后，自噬相关基因的表达也会下降ADDINNE.Ref.{0E4E3740-BEF6-4DB1-A326-D46DE638F28F}[40]。过表达的p62会引起Keap1自噬降解，然而过表达突变型的p62并不会出现这种现象ADDINNE.Ref.{0D28EC71-5EF0-4CFC-9A3C-22EA67FB242E}[41]，这表明p62介导的Nrf2上调是依赖Keap1的。更进一步的研究认为p62的磷酸化，