抽提质粒是实验室最常规的试验了

.@：抽提质粒是实验室最常规的试验了，由于有一套试验操作步骤，于是就按着步骤一步一步操作，不理解实验原理是什么，掌握各试剂的组分对于试验很有帮助。溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成。葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械损伤，防止破坏质粒DNA；EDTA的作用是络合掉镁离子等二价金属离子，防止DNA酶对质粒的降解；Tris-HCl是维持菌液溶菌作用的最适合pH值。溶液Ⅱ：由SDS与氢氧化钠组成。SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性；氢氧化钠的作用是破坏氢键，使DNA变性。配置是应该注意氢氧化钠要用新鲜配置的，若放置时间过长，则有部分氢氧化钠会吸收空气中的二氧化碳形成碳酸钠，影响该溶液的碱性。溶液Ⅲ：由KAc与HAc组成。该溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，质粒DNA复性，染色体DNA复性而发生缠绕与SDS-蛋白形成相互缠绕的大分子物质被离心沉淀，很容易与小分子质粒DNA分离，此外，高盐溶液有利于各种沉淀的形成。酶切反应的条件：1、作用温度：早期的酶切反应都是在37℃2、缓冲体系：一般现在的生物公司在酶的包装中会配有该没的缓冲液，所以用起来还是很方便的；但是要进行双酶切，可以登录Fermentas网站，Double-digest提交可获得该公司提供的最佳方案。3、酶切时间：常规的酶切时间一般控制在60min内进行，但也可以根据酶切对象与所用的酶保温延长至数十小时。对于某些酶来说，延长保温时间能在很大程度上节约用酶。4、DNA的浓度与纯度：除了上述酶反应条件外，有经验的试验人员可以体会到，影响酶切效果的最主要的因素是DNA的纯度。5、终止酶反应的方法：方法1，向酶切反应液中加入终浓度为10mM～12.5mM的EDTA,原理是EDTA能络合掉酶反应所需的镁离子，但是这种方法会影响需要镁离子的后续酶反应；方法2热失活，一般的酶如ClaⅠ,EcoRⅠ等在65℃保温20min就能达到灭火的目的,另一些酶如BanHⅠ,HindⅢ等须在85℃保温30min方能达到灭活的目的，极端的例子是Ttb111Ⅰ甚至不能用加热的方法使之失活。热失活方法的特点是简单方便并且未向反应也中加入任何物质，特别适合连续进行几个酶切反应，并且不用更换体系所以不会造成DNA的损失。方法3酚或氯仿抽提使酶失活，之后加入乙醇沉淀回收DNA片段。这种方法的特点是处理条件剧烈使酶彻底失活，可用于处理热失活不凑效的Ttb1116、酶切失败的原因及处理方法：酶切失败主要表现在两个方面：一是不能完全酶切有时甚至是根本不能酶切底物DNA，DNA不能被酶切的原因可能是缓冲体系不适合或是酶失活，可进行更换缓冲体系或再加新酶等处理；二是底物DNA被降解成无规则片段有时甚至降解的分子连接成片。被降解的原因肯定是被DNA酶所污染，处理的方法可以用氯仿抽提除去DNA酶。7、酶切体系加样次序：酶切计划的实施可以按照以下顺序进行：根据所用DNA量确定用酶量，再根据用酶量确定总体积。勿使DNA过浓而导致酶切不完全或是由于酶过量而导致星号反应（酶的星号反应：酶的星号反应是指改变酶切条件时酶的识别为点专一性下降。）。酶切加样次序一般为：水+缓冲液+DNA+酶。将DNA加到无离子水中可引起DNA的部分解链（因DNA双链上的电荷未被中和）；酶无论是加在去离子水中或是浓缩的缓冲液中都会引起酶的严重失活。所以，只有按照正确的顺序加样才能时酶一进入体系就能在合适的缓冲液中对底物进行酶切，使酶发挥最大效率。另外向管子中加入各组分后都要用手指轻拨管子以混匀，最后加入酶轻轻混匀。基因组DNA的检测由于所用材料不同，得到的核酸产量及质量均不同，有时核酸中含有酚类和多糖物质等其它杂质，会影响下一步酶切、连接及转化、Southern杂交、RFLP及PCR的效果等试验。所以获得的基因组DNA、质粒DNA、RNA必须测定其DNA、RNA的纯度、含量及相对分子量的大小，核酸纯度、含量的检测方法如下：1、核酸含量的紫外吸收测定：用TE或蒸馏水将待测的DNA样品溶液稀释20～100倍或更高倍数的稀释；用TE或蒸馏水作为空白对照，测定OD260/OD280,通过计算确定DNA浓度或纯度。(1)对于双链DNA含量=OD260×50(μg/mL)×稀释倍数；(2)对于单链DNA含量=OD260×33(μg/mL)×稀释倍数；(3)对于单链RNA含量=OD280×40(μg/mL)×稀释倍数。2、核酸的纯度判断一般标准：(1)DNA:1.6<OD260/OD280<1.8表示为纯DNA；OD260/OD280<1.6表示蛋白含量超标；OD260/OD280>1.9表示为样品中RNA含量超标。(2)RNA:1.7<OD260/OD280<2.0表示为纯RNA；OD260/OD280<1.7表示为蛋白或酚污染；OD260/OD280>2.0表示为样品中含有异硫氰酸残留操作步骤如下：开机并运行软件，预热紫外分光光度计10～20min；用ddH2O（或TE）作为空白对照，分别在OD260nm和OD280nm校零；取10μL染色体DNA、质粒DNA或RNA样品，加990μL的ddH2O（或TE）混匀，然后转入分光光度计的石英比色杯中。测定