分子诊断学5-核酸扩增技术

核酸扩增技术

中山大学附属第一医院黄彬PCR=核酸扩增技术核酸扩增技术=PCR核酸扩增技术NucleicAcidAmplificationTechniques,NAAT扩增检测DNA或RNA的技术

核酸扩增技术

一、靶基因扩增聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

KaryMullis，1985年发明PCR技术，1993年获诺贝尔化学奖试管中进行的DNA复制反应每一次复制包括三个基本步骤：变性（denaturation）：93~98℃退火（annealing）：37~65℃延伸（extension）：70~75℃PCR循环–

第一步–

加热变性靶序列PCR循环-第二步–

引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase第1个PCR循环完成后–

得到两个拷贝的靶序列靶序列

靶序列BiotinBiotin30次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824拷贝数理论值=2nPCR扩增体系模板（template）：要被复制的核酸片段引物（primer）：化学合成的寡核苷酸链脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）耐热DNA聚合酶缓冲液

引物决定扩增产物的特异性和长度，0.1~1.0μmol/L。与模板DNA互补。引物设计的原则长度：18~30bp为宜。引物过长，模板结合不充分，产物少；引物过短（小于15），非特异性扩增。末端：3’端的第一、二个碱基影响Taq酶的延伸效率，影响PCR的扩增效率和特异性，应严格配对。5’端可加修饰成分，如酶切位点、引入突变位点、启动子序列、蛋白质结合DNA序列、生物素、荧光素、地高辛标记等，便于产物分析和克隆等。位置：基因组DNA的高度保守区，最好跨越两个外显子序列不能互补，否则形成引物二聚体。避免引物二聚体的方法：50%G+C和无4个连续相同的碱基GC含量：40%~60%。两引物有匹配的GC含量和相似的退火温度，否则影响扩增效率和特异性。两引物Tm值差异应小于2~3℃。退火温度低于Tm5℃。解链温度/熔解温度Tm=4(G+C)+2(A+T)，55~60℃。引物设计软件PrimerPremier5引物设计与多序列组合整合在一起可自动或手动设计引物可用于多重/巢式引物设计PrimerDesigner4.1设计PCR引物设计测序引物设计寡核苷酸探针耐热DNA聚合酶TaqDNA聚合酶从水栖嗜热菌中提取，有很高的耐热稳定性5’

→3’DNA聚合酶活性5’

→3’核酸外切酶活性逆转录酶活性较弱的非模板依赖性无3’→5’核酸外切酶活性，无校正功能TthDNA聚合酶：具有DNA聚合酶和反转录酶活性，具有5’

→3’核酸外切酶活性VentDNA聚合酶：具有3’→5’核酸外切酶活性，有校正功能。可扩增大于12kb的模板DNA。PfuDNA聚合酶：具有3’→5’核酸外切酶活性，有校正功能高保真DNA聚合酶50μlPCR反应体系的用量：0.5~2.5U扩增条件温度变性温度：95~97℃退火温度：Tm-5℃，常为55℃。

过低：非特异性扩增

过高：降低扩增效率延伸温度：72℃时间：取决于扩增片段长度，30~60s循环次数：20~40次，取决于靶序列的初始浓度等。产物分析凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：判断扩增产物大小聚丙烯酰胺凝胶电泳：片段较小或片段之间的相差较小变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：PCR产物长度多态性和DNA序列测定非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：DNA片段的构象多态性限制性内切酶酶切分析：检测基因突变

单链构象多态性分析注意：并不是所有核苷酸序列的改变都引起单链构象改变，PCR-SSCP的鉴别能力为80%左右。荧光检测：核酸定量分析化学发光分析：核酸定量分析核酸杂交：点阵杂交、微孔板杂交、斑点杂交点阵杂交微孔板杂交反向点杂交膜条显色生物素链霉亲和素-过氧化物酶复合物TMBH2O2

固定在膜上的探针-地中海贫血点突变基因诊断结果判读未发生QS、CS、

WS点突变发生

WS点突变杂合子发生

CS点突变杂合子发生

QS点突变杂合子注：纯合子、杂合子，需结合-地中海贫血缺失型的结果来判断核酸测序PCR衍生技术PCR衍生技术逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR

) TTTTTTTTTTTT逆转录引物：PCR下游引物

oligo(dT)

随机序列六核苷酸混合物用于cDNA克隆合成cDNA探针检测RNA病毒分析基因表达等巢式PCR（nestedPCR）灵敏度大大提高特异性也较高适于模板含量较低的标本多重PCR(multiplexPCR)在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。扩增同一靶基因的多个不同序列或多个不同的靶基因各对引物间的扩增效率应基本一致高效、经济、简便单细胞PCR获得单个细胞（激光显微切割、显微吸管吸取、膜片钳技术、流式细胞仪分选等）细胞裂解、cDNA合成、PCR应用于产前诊断、胚胎发育、干细胞生物学、肿瘤等领域原位PCR（insituPCR）石蜡包埋组织切片细胞涂片辨别带靶序列的细胞标出靶序列在细胞中的位置无需提取核酸扩增效率低于普通PCR随机扩增多态性DNA（randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）随机序列引物混合物200~2000bp靶基因多态性指纹图谱种群生物学研究遗传鉴定病原菌流行病学检测、分型DNA指纹鉴定等等温扩增RNA扩增技术NASBA生物梅里埃公司TMAGen-probeSAT上海仁度转录依赖的扩增系统（Transcription-basedamplificationsystem，TAS）（1989，Kwoh）cDNA靶RNA

反转录

转录RNA用杂交保护实验检测扩增产物吖啶翁酯(AE)标记的DNA探针与RNA产物杂交若探针不能与产物杂交，AE被水解，光度计检测结果为阴性若探针与产物杂交，AE被形成的双链保护，不被水解，光度计检测结果为阳性杂交探针的化学发光强度与靶核酸的量成正比，可定量检测实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneousamplificationandtesting,SAT)定性/定量实时，闭管快（15~40分钟）1012RNA到RNA污染几率低将核酸恒温扩增和实时荧光检测结合的核酸检测技术唯一获CFDA注册证的恒温扩增检测试剂核酸序列依赖扩增(nuclearacidsequence-basedamplification,NASBA)DNA(+)DNA(-)DNA(+)DNA呼吸作用以单链DNA为模板的SAT检测技术灵敏度高：rRNA在细胞中拷贝数多，模板量大

一个或几个拷贝DNA/细胞104核糖体RNA(rRNA)/细胞16SrRNA23SrRNARNA扩增用于临床检验的优势如用rRNA为靶标，将显著提高

取样效率和检测灵敏度

可用于细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌等的检测

RNA扩增技术检测病毒的靶核酸：RNA病毒或DNA病毒的mRNAA、如果2ml样本含有1个细菌

取0.2ml样本，最终得到细菌的几率是1/10。SampleCellLysisTargetRNAReleasedB、如果2ml样本含有1个细菌先裂解，后取样，2ml样本含有10000个rRNA。取0.2ml样本，可得到1000个分子。取样效率高扩增效率高RTRNAcDNART~1000copiesT7SATDNATaqTaqPCR30分钟内扩增1010倍RNADNARNA30分钟内扩增106-107倍特异性高

特异的转录：特异性引物因反应的高效性减少了反应时间，降低了酶促反应中的错配率，转录更忠实于模板特异的核酸提取：特异性靶标捕获法磁珠提取特点：去除反应抑制剂易于自动化

特异的检测：采用分子信标实时检测可区分“潜伏感染”和“活动感染”

活动性感染：RNA转录活跃

潜伏感染：RNA不转录

如CMV：SAT技术检测CMVpp65mRNA(编码晚期表达蛋白)正常体检儿童（潜伏感染）

CMV感染住院患者（活动感染）正常儿童31例样本中，PCR阳性9例，浓度均高于103copies/ml;SAT疑似弱阳1例，这例标本DNA浓度为105copies/ml。住院患者7例样本中，PCR和SAT检测阳性样本（5例）完全一致。与临床相关性好，可以区分“死菌”、“活菌”病原体死亡后RNA很快降解（=“培养”)，RNA扩增检测为阴性，可减少无效治疗，如抗生素滥用。而DNA仍能稳定存在至少3周时间，采用DNA扩增技术检测不利于临床的疗效监测和判愈。不易发生产物污染，不易出现假阳性。扩增产物是RNA，在环境中易被RNase酶降解RNA等温扩增技术的特点等温扩增（42℃

），不需要热循环需要逆转录酶、T7RNA聚合酶、RNaseH(NASBA)扩增效率高，一次循环产生模板的100~1000个拷贝转录本。4~5个循环RNA扩增109倍，而PCR需20个循环。15~30min内可将模板扩增约1010倍特异性强，特异性的核酸提取、扩增和检测操作简单，不需要模板的热变性不易发生产物污染，产物为RNA，易被RNase降解反应稳定，抑制物少常用于病原微生物检测，包括细菌、病毒、支原体、衣原体等二、探针扩增连接酶反应（ligasechainreaction,LCR）扩增对象：由引物组成的探针应用：检测碱基突变三、信号扩增支链DNA技术(branchedDNA,bDNA)DegradeRNasesandreleaseRNAReleaseanddenatureDNAHybridizeprobestoRNAorDNAandtosolidphase捕获探针延长探针HybridizebDNA(amplifier)Hybridizeenzymelabeledprobestoamplifier酶标探针AddDloxetanesubstrateandmeasurechemi-luminescenceOOOCH2OCHH稳定性高

重复性好

结果准确

灵敏度低、检测范围窄

检测下限：2×105拷贝/mlSampleisdenaturedwithbaseThisstepplishes3things:Lysesthecells.SeparatesthestrandsofDNAmakingthemavailableforhybridization.DestroysunwantedRNADenaturation:杂交捕获(hybridcapture,HC)Step1Target-specificsinglestrandedRNAprobetoDNA,creatingaRNA:DNAhybrid.Fromthispointforward,theRNA:DNAhybridswillserveasthetargetanalyte.Step2Hybridization:Step3TheRNA:DNAhybridiscapturedontoasolidphase(i.e.tubecoatedwithcaptureantibodiesspecificforRNA:DNAhybrids).CaptureRNA:DNA:Step4Oncecaptured,thehybrid isthendetectedwitha secondsetofRNA-DNA antibodiesconjugated toalkalinephosphatase.Detection:Step5Thealkalinephosphatasereactswiththedetectionsubstrate,resultinginachemiluminescentsignal.Theintensityofthelightemitteddenotesthe presenceorabsenceoftargetDNAinthespecimen.Multipleconjugatedantibodiesbindtoeachcapturehybridresultinginsubstantialsignalenhancement.SignalGeneration:Importanttonote:特异性高：大于99.5%敏感度高：5x103~5x109copies/ml重复性好：CV＜15%操作简便：简单、快速、无需严格环境。四、实时PCR(realtimePCR)

也称为荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)，在PCR反应体系中加入荧光基团，实时检测PCR过程的荧光信号（通常在每个循环的延伸阶段收集信号）。通过对反应体系中荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并根据参照系统计算出初始模板量。循环阈值(cyclethreshold,CT)分子信标(molecularbeacons)探针背景信号低、灵敏度高、特异性强、操作简单用于基因突变、DNA/蛋白质相互作用、DNA/RNA杂交的动力学研究实时PCR的优点定量的方法外标法内标法动力学方法外标法内标法已知浓度的标准品与待测标本在同一管内扩增，然后通过内标的量计算待测模板核酸的量，排除了因管间扩增效率不同导致的差异。重复性好定量准确内部标准品非竞争性标准品与靶核酸无相同的引物结合位点和扩增的基因组，常用β-actin,GAPDH,rRNA等管家基因竞争性标准品人为构建的可与靶核酸竞争酶、核苷酸和引物分子的核酸。与靶核酸有相同的引物接合位点，只是引物间的序列存在差异。内标和靶基因的探针用不同的荧光染料标记动力学方法结果报告与评价COBAS®AmpliPrep

WorksincombinationwiththeCOBASTaqManAnalyzer.Barcodedreagentcartridges.Extractions/purificationsforupto72samplesinrunsof24peranalyteincludingcontrolsand4differentassays.Currentuse:HIV,HBV,HCV,CMV,extractionNA,amplification/detectionPCRRocheCOBAS®AmpliPrepandTaqMan®48AnalyzerRocheCOBAS®4800SystemUsefor:HumanPapillomaVirus(HPV)extraction,amplification/detectionPCR(94sample/run)GeneXpert:AnIntegrated,POC-LikeAssayforC.difficileTestingTenoveretal,JClinMicrobiol2010,48:3719CepheidGeneXpertMRSAforRapidDetectionandIdentificationPartaetal.J.Clin.Microbiol.47:1609-10,2009MolecularAssays:MultiplexPCRCoupledwithMicroarraysHighlysensitiveandspecificQualitativetestingonly“Onestoneformanybirds”BatchedorrandomaccessLimitedhands-ontimeTurnaroundtimevariesLowerRespiratoryTractSpecimens腺病毒229E型冠状病毒HKU1型冠状病毒NL63型冠状病毒OC43型冠状病毒人类偏肺病毒甲型流感病毒甲型流感病毒H1亚型

甲型流感病毒H3亚型甲型流感病毒2009年H1亚型

B型流感病毒副流感病毒1、2、3、4型鼻病毒呼吸道合胞病毒百日咳杆菌肺炎衣原体肺炎支原体HighlysensitiveandspecificQualitativetestingonly17viraland3bacterialtargetsIntegratedandclosedsystemHOT≈2min,TAT≈1hrCapacity≈24specimens/dayFilmArray血流感染(阳性血培养)测试条已获CE和FDA的认证耐药基因检测全封闭系统，减少外界污染仪器小巧，占地空间小标本量：100μL标本进，结果出工作原理Ruleout>90%ofagentswhichcauseacutegastroenteritisinsingletest.1,2,3Simultaneouslyscreensforelevendifferentbacteria,viruses,andparasitescommonlyresponsiblefordiarrheawithsamedayresults.xTAGGPPAssay–FDACleared!131|©Copyright2012LuminexCorporationONEtestf