基因工程制药-课件

第二章基因工程制药第二章基因工程制药1第一节概述第一节概述2基因工程制药

（geneticengineeringpharmaceutics）是利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞，进行大规模培养，以获得蛋白质药物的过程。基因工程制药

（geneticengineeringph3基因工程药物发展历程20世纪70年代DNA重组技术建立。1977年重组生长激素抑制因子克隆成功，美国成立第一家基因工程公司。1982年美国lilly公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界上第一个基因工程药物诞生。目前，全球上市的基因工程药物有140多种，有1700多种处于临床研究阶段，2600多种在实验室阶段。基因工程药物发展历程20世纪70年代DNA重组技术建立。4我国基因工程药物我国从20世纪80年代初期开始基因工程药物的开发研究。1989年第一个基因工程药物干扰素批准上市。α1b型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年通过Ⅲ期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。1992年，第一个基因工程乙肝疫苗投入市场。目前已有20多种基因工程药物上市。我国基因工程药物我国从20世纪80年代初期开始基因工程药物的5基因工程药物与传统生物技术的比较材料来源困难，无法研制出产品付诸应用。提取纯化成本高，供不应求。由于免疫原性，应用受到限制。传统生物技术药物基因工程药物与传统生物技术的比较材料来源困难，无法研制出产品6可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽。如：干扰素内源生理活性物质在作为药物使用存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如：白细胞介素-2基因工程技术生产药物的优点：可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽。如：干扰素基因7（1)免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；（2）细胞因子，如干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；（3）激素，如胰岛素、生长激素、心纳素；（4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。（5）疫苗：乙型肝炎疫苗等基因工程技术可生产的药物和制剂包括：它们的共同点都属于蛋白质。（1)免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；基因工程技术可生产8基因工程制药的基本环节基因工程制药的基本环节9基因克隆示意图目的基因的制备分离DNA重组体的构建重组体导入宿主细胞重组体筛选和鉴定外源基因的表达表达产物的分离纯化鉴定基因克隆示意图目的基因的制备分离DNA重组体的构建重组体导入10第二节基因工程制药基本知识第二节基因工程制药基本知识11将目的基因与载体连接后，转入大肠杆菌等受体细胞，即获得基因工程菌。一、基因工程菌的构建与筛选该过程也称为基因工程的上游技术。将目的基因与载体连接后，转入大肠杆菌等受体细胞，即获得基因工121、载体（vector）载体是携带外源目的基因或DNA进入宿主细胞，实现外源基因无性繁殖或表达有意义蛋白质所采用的DNA分子。包括质粒载体等。外源基因需借助载体的帮助才能进入受体细胞。1、载体（vector）载体是携带外源目的基因或DNA进入宿131、质粒载体（plasmid）质粒是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质（DNA分子）。存在于几乎所有细菌中，一种自我复制的双链环状DNA分子。能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。1、质粒载体（plasmid）质粒是指独立于原核生物染色体之14大小为1~300kb，有三种构型：cccDNA、ocDNA、lDNA。大小为1~300kb，有三种构型：cccDNA、ocDNA15质粒的特性质粒的特性161、具有遗传传递和遗传交换的能力可编码自身蛋白质，对宿主生存无决定性影响。可进行独立复制，并随宿主细胞的分裂传递给后代。1、具有遗传传递和遗传交换的能力可编码自身蛋白质，对宿主生存17用于克隆表达的质粒须具备以下要素复制子又称为复制起始区，包含控制质粒DNA复制起点和质粒拷贝数等遗传因素。用于克隆表达的质粒须具备以下要素复制子18选择性标记(seletivemarker)是质粒携带的赋予宿主细胞新的表型的基因，用于筛选转化有质粒的宿主细胞。方式：抗生素抗性基因，包括氨苄西林（Amp）、四环素（Tet）、氯霉素（Cm）、卡那霉素（Kan）和新霉素（Neo）等。含有质粒的宿主细胞被赋予拮抗抗生素的表型，能在含抗生素的环境中生长。选择性标记(seletivemarker)是质粒携带的赋予19指质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列，由人工合成。作用：在克隆操作中，在目的基因两端设计限制性内切酶酶切位点用于插入目的基因。多克隆位点（multiplecloningsite,MCS)指质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列，由20基因工程中常见的各种质粒载体举例基因工程中常见的各种质粒载体举例21pBR322应用最广泛。有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因。有许多种常用的限制酶的切点。它全长4352个核苷酸，排列顺序已全部测定。

pBR322应用最广泛。22（二）目的基因的常用制备方法

1、化学合成法采用DNA合成仪等将已知序列的目的基因用化学合成方法直接合成。

合成前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因。必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。目前，常用DNA自动合成仪合成。（二）目的基因的常用制备方法1、化学合成法目前，常用DN232、PCR（polymerasechainreaction）是根据生物体内DNA复制原理，在DNA聚合酶催化下，依赖DNA模板特异性扩增DNA.KaryBMullis特点：

可在体外大量特异性扩增目的基因，实验室常用。2、PCR（polymerasechainreactio24PCR反应成分1、模板DNA；2、引物；3、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）

；4、DNA聚合酶；5、反应缓冲液、Mg2+等。PCR反应成分1、模板DNA；2、引物；3、四种脱氧核糖核苷25PCR反应基本步骤

变性：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。

退火：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子，（55℃，30s）。延伸：在DNA聚合酶、dNTPs、

Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链，即中温延伸反应（70～72℃，30～60s）。

PCR反应基本步骤变性：退火：延伸：26

以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。从而目的基因得到大量扩增。是目前最为常用的目的基因制备方法。以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可27三、载体与目的基因的链接即连接酶催化载体DNA与目的基因DNA片段连接，形成重组子（recombinant）。该技术称为DNA体外重组技术。三、载体与目的基因的链接即连接酶催化载体DNA与目的基因DN28连接可分为以下几种类型粘性末端（stikyend）连接

目的基因两端有与载体上相同的限制性核酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端，能重新互补结合，在DNA连接酶催化下，目的序列就与载体DNA链相连接。

效率较高，较常用。连接可分为以下几种类型粘性末端（stikyend）连接效率29平头末端（bluntend）链接：

效率很低（约1/10~1/100），T4DNA连接酶可催化。平头末端（bluntend）链接：30四、重组DNA导入宿主细胞基因工程中常见宿主细胞：宿主细胞原核细胞真核细胞大肠杆菌枯草杆菌链球菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞植物细胞四、重组DNA导入宿主细胞基因工程中常见宿主细胞：宿主细胞原311、重组DNA导入大肠杆菌的方法1970年，Mandel和Higa发现大肠杆菌经氯化钙处理，能吸收噬菌体DNA，之后Cohen等实现了质粒DNA转化感受态大肠杆菌。受体细胞1、重组DNA导入大肠杆菌的方法1970年，Mandel和H3250-100mmol/LCaCl2

感受态细菌重组体转入细菌对数生长期的大肠杆菌经冰浴（0℃)的氯化钙低渗溶液处理后，细胞膨胀成球形，细胞膜通透性会增加，成为感受态细胞；氯化钙转化法加入重组质粒，重组质粒与钙离子形成复合物并粘附于细胞表面，在42℃短时间（90s）热冲击后，重组质粒进入感受态细胞，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。50-100mmol/LCaCl2感受态细菌重组体转入细33五、重组子的筛选与鉴定

1、载体遗传标记法

五、重组子的筛选与鉴定1、载体遗传标记法34

（1）、抗生素抗性筛选法（最常见）

抗氨苄青霉素基因抗四环素基因抗卡那霉素基因等（1）、抗生素抗性筛选法（最常见）35如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性基因导致本来Amp敏感的菌株也可以在含有Amp的固体培养基上生长，如图1。如转化不成功则Amp敏感的菌株和阴性对照不会在含有Amp的固体培养基上生长，如图2。图1图2如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性基因导致本36蓝－白筛选示意图蓝－白筛选示意图37基因工程制药-课件38六、原核细胞表达的特点及选择六、原核细胞表达的特点及选择39原核表达系统有大肠杆菌芽孢杆菌链霉菌原核表达系统有大肠杆菌40大肠杆菌（E.coli）优点：开发最早、研究最成熟遗传学研究深入，基因组序列已明确。

生长迅速，适合大规模生产。所以是外源基因表达的首选表达系统。大肠杆菌（E.coli）优点：开发最早、研究最成熟所以41中心法则中心法则422、外源基因在大肠杆菌中的表达形式表达产物可位于以下三个区域：胞内周质胞外

大肠杆菌电镜照片2、外源基因在大肠杆菌中的表达形式表达产物可位于以下三个区域43胞内表达有两种表达形式，即非融合蛋白和融合蛋白。由两种蛋白结合在一起的蛋白质，称为融合蛋白。胞内非融合蛋白是指表达的外源蛋白的N端不含任何大肠杆菌的多肽序列。融合蛋白是指将外源基因融合至某种特定基因的下游，表达的外源蛋白N端含原核多肽。胞内表达有两种表达形式，即非融合蛋白和融合蛋白。由两种蛋白结44分泌表达方法：通过将外源基因融合至编码原核蛋白信号肽序列的下游。融合蛋白（含信号肽和外源蛋白）在跨过膜后，信号肽酶切去信号肽，外源蛋白被分泌至细胞周质空间或胞外。外源基因高效表达，可达大肠杆菌总蛋白的10~70%，易形成包涵体，故采用分泌表达。分泌表达方法：通过将外源基因融合至编码原核蛋白信号肽序列的下45什么是包涵体？原因细胞的外源蛋白质，蛋白合成速度太快(可达大肠杆菌总蛋白的10~70%)，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。这些蛋白质会堆积起来形成不溶的形式。大的包涵体可以利用光学显微镜看得到。在一些情况下，有些包涵体比较大，直径大于大肠杆菌的直径，使得大肠杆菌有一个突起。细胞内包涵体什么是包涵体？原因细胞的外源蛋白质，蛋白合成速度太快(可达大46什么是信号肽？分泌蛋白新生肽链N端的一段20～30氨基酸残基组成的肽段。用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）。什么是信号肽？分泌蛋白新生肽链N端的一段20～30氨基酸残基47七、真核细胞表达的特点原核表达的缺点

缺乏蛋白翻译后加工修饰系统，影响外源蛋白生物活性。 以包涵体形式存在，须经变性，复性处理。 外源蛋白在原核生物中不稳定。真核生物和原核生物基因表达过程示意图七、真核细胞表达的特点原核表达的缺点真核生物和原核生物基因表48常用的真核表达系统酵母表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统常用的真核表达系统酵母表达系统491、酵母表达系统基因工程中应用最广泛的酵母表达系统为巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母结构模式图1、酵母表达系统基因工程中应用最广泛的酵母表达系统为巴斯德毕50巴斯德毕赤酵母简介是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。

1987年，Cregg等人首次报道了用甲醇营养型酵母表达乙型肝炎表面抗原(HbsAg）。巴斯德毕赤酵母简介是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯51巴斯德毕赤酵母主要优点为高表达量高稳定性翻译后修饰功能分泌表达巴斯德毕赤酵母主要优点为高表达量高稳定性翻译后修饰功能分泌表523、哺乳动物细胞表达系统蛋白质正确折叠，具有蛋白质翻译后加工功能。所以外源蛋白在结构、理化性质和生物功能最为接近天然的高等生物。3、哺乳动物细胞表达系统蛋白质正确折叠，具有蛋白质翻译后加工53哺乳动物细胞表达系统的表达载体病毒载体质粒载体哺乳动物细胞表达系统的表达载体病毒载体54常用哺乳动物细胞株CHO细胞骨髓瘤细胞株常用哺乳动物细胞株CHO细胞55基因重组蛋白的分离纯化和分析鉴定基因重组蛋白的分离纯化和分析鉴定56分离纯化技术应满足以下要求技术条件要温和选择性要好回收率要高分离纯化过程要快分离纯化技术应满足以下要求技术条件要温和选择性要好回收率要高57（一）基因重组蛋白主要的分离技术1.离心实现固液分离分离细胞、细胞碎片、包涵体和病毒颗粒（一）基因重组蛋白主要的分离技术1.离心582.蛋白沉淀利用某些方法使蛋白质沉淀，再离心分离等电点沉淀法盐析法，常用硫酸铵2.蛋白沉淀等电点沉淀法盐析法，常用硫酸铵59等电点沉淀法

原理：在等电点时，蛋白质分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀。等电点沉淀法原理：在等电点时，蛋白质分子净电荷为零(即正负60盐析法的原理蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。

加入高浓度中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。

盐析法的原理蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子613.膜分离是指用半透膜（semi-permeablemembrane）（如醋酸纤维素膜）作为选择性障碍层，使溶液中某些组份通过，而截留其它组分的分离方法。3.膜分离是指用半透膜（semi-permeablemem62（1）透析透析是指分子量较小的分子或离子（如生理上的电解质）能够穿透半透性膜（semi-permeablemembrane）析出，较大的分子就不能通过半透膜。（1）透析透析63透析可用于脱盐和去除杂蛋白。透析可用于脱盐和去除杂蛋白。64（二）基因重组蛋白的主要纯化技术主要是层析法（二）基因重组蛋白的主要纯化技术主要是层析法65层析(chromatography)

基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。

层析(chromatography)基于不同物质在流动相和661.离子交换层析(ion-exchangechromatography)

根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。即不同蛋白质在一定pH下所带电荷不同，与分离介质上的离子化基团结合能力也不同，从而实现分离纯化。1.离子交换层析(ion-exchangechromato67分为阳离子交换和阴离子交换层析等。优点：操作容易，应用广泛，是基因工程蛋白质药物分离纯化的重要方法。缺点：特异性不强分为阳离子交换和阴离子交换层析等。682.亲和层析(affinitychromatography)

在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合。这种结合具有特异性和专一性的，又具可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。2.亲和层析(affinitychromatography69优点：纯化后纯度高，可去除大多数杂蛋白。缺点：难找到合适的层析介质，成本高，应用范 围不广。优点：纯化后纯度高，可去除大多数杂蛋白。缺点：难找到合适的层703.凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)

凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状来实现分离纯化。所用凝胶颗粒是惰性不带电荷的多孔网状支持物。3.凝胶过滤层析(gelfiltrationchrom714.疏水色谱利用蛋白质分子的疏水性差异来实现分离。固定相疏水基团蛋白质上的疏水区域丙氨酸甲硫氨酸色氨酸苯丙氨酸4.疏水色谱利用蛋白质分子的疏水性差异来实现分离。固定相72RP-HPLC色谱柱RP-HPLC色谱柱73人血浆中不同蛋白分离色谱图人血浆中不同蛋白分离色谱图74基因工程药物质量控制基因工程药物质量控制75一、基因工程药物质量控制要点蛋白质含量测定蛋白质纯度检测蛋白质分子量测定蛋白质等电点测定蛋白质序列分析杂质分析一、基因工程药物质量控制要点蛋白质含量测定蛋白质纯度检测蛋白76蛋白质含量测定方法蛋白质含量测定方法77色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸在280nm波长附近有吸收峰，蛋白质中含有这些芳香族氨基酸，故蛋白质在280nm处有特征吸收，故测定280nm处的吸光度值可计算蛋白含量。1.紫外吸收光谱法色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸在280nm波长附近有吸收峰，蛋白78标准曲线标准曲线792.BCA法（BicinchoninicAcid）

形成一个在562nm处有最大吸光度的紫色复合物，其吸光度与蛋白质浓度成正比。2.BCA法（BicinchoninicAcid）803.Lowry法Folin-酚法所用的试剂（Folin-酚试剂）由两部分组成。试剂甲：其中的Cu可与蛋白质中的肽键形成复合物。试剂乙：磷钨酸和磷钼酸混合液，复合物可与其产生蓝色。3.Lowry法Folin-酚法所用的试剂（Folin-酚814.考马斯亮蓝法（coomassiebrilliantblue）染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后引起染料颜色改变为蓝色，在595nm处有最大吸收，光吸收增加，因此大大提高了测定蛋白质的灵敏度（1ug）目前应用很广。4.考马斯亮蓝法（coomassiebrilliantb82蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定83SDS-聚丙烯凝胶法（SDS)即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法。SDS-聚丙烯凝胶法（SDS)即十二烷基硫酸钠—聚84在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS加入到电泳系统中能结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS）85蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定86测定方法SDS凝胶过滤质谱法（最为准确，成本也较高）测定方法SDS87

蛋白质序列分析N-端氨基酸序列分析Edman法，测定重组蛋白N-端15个氨基酸。C-端氨基酸序列分析羧肽酶法，测定重组蛋白C-端3个氨基酸左右。蛋白质序列分析N-端氨基酸序列分析Edman法，测定重组蛋白88第五节基因工程制药应用实例第五节基因工程制药应用实例89胰岛素（insulin）胰岛素（insulin）901.简介是一种蛋白质类激素，胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。1.简介是一种蛋白质类激素，胰岛β细胞受内源性或外源性物质如912.胰岛素的发现胰岛素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特首先发现。1922年开始用于临床，使过去不治的糖尿病患者得到挽救。1955年英国F.桑格小组测定了牛胰岛素的全部氨基酸序列，开辟了人类认识蛋白质分子化学结构的道路。1965年9月17日，中国科学家人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素，它是第一个在实验室中用人工方法合成的蛋白质。2.胰岛素的发现胰岛素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C9270年代初期，英国和中国的科学家又成功地用X射线衍射方法测定了猪胰岛素的立体结构。1979年，胰岛素的基因被克隆。70年代初期，英国和中国的科学家又成功地用X射线衍射方法测定93胰岛素的结构与性质不同种族动物（人、牛、羊、猪等）的胰岛素功能大体相同，成分稍有差异。图中为人胰岛素化学结构。胰岛素由A、B两个肽链组成。A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸，共51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。胰岛素的结构与性质不同种族动物（人、牛、羊、猪等）的胰岛素功94多克隆位点多克隆位点95二.制备工艺1982年，基因工程胰岛素问世。二.制备工艺1982年，基因工程胰岛素问世。961.基因的构建与表达目前表达系统主要有两种：大肠杆菌和酵母表达系统。大肠杆菌表达系统的优点：表达量高，表达出包涵体。缺点：表达出的胰岛素无生物活性酵母表达系统的优点：二硫键正确，不需要复性加工处理。缺点：产量低，发酵时间长。1.基因的构建与表达目前表达系统主要有两种：大肠杆菌和酵母表97大肠杆菌表达胰岛素原90年代初礼来公司通过先表达出胰岛素原再通过酶切得到具有活性的胰岛素。分离纯化得到胰岛素原mRNA反转录得到胰岛素原cDNA构建重组质粒转化大肠杆菌，构建工程菌发酵，表达纯化得胰岛素原融合蛋白酶切得具活性胰岛素大肠杆菌表达胰岛素原90年代初礼来公司通过先表达出胰岛素原再98酵母表达胰岛素原诺和诺德公司开发，细胞表达微小胰岛素原（几个氨基酸取代了C肽），经转录后修饰成具有正确二硫键的微小胰岛素原，分泌到胞外，经分离纯化得到。酵母表达胰岛素原诺和诺德公司开发，细胞表达微小胰岛素原（几个99大肠杆菌（E.coli）大肠杆菌（E.coli）100枯草芽孢杆菌分泌能力强,可以将产物直接分泌到培养液中,不形成包含体.有很强的胞外代谢酶,对产物进行不同降解,应用受到影响.枯草芽孢杆菌分泌能力强,可以将产物直接分泌到培养液中,不形成101酵母菌的结构酵母菌的结构102病毒的结构示意图病毒的形态病毒的结构示意图病毒的形态103第二章基因工程制药第二章基因工程制药104第一节概述第一节概述105基因工程制药

（geneticengineeringpharmaceutics）是利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞，进行大规模培养，以获得蛋白质药物的过程。基因工程制药

（geneticengineeringph106基因工程药物发展历程20世纪70年代DNA重组技术建立。1977年重组生长激素抑制因子克隆成功，美国成立第一家基因工程公司。1982年美国lilly公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界上第一个基因工程药物诞生。目前，全球上市的基因工程药物有140多种，有1700多种处于临床研究阶段，2600多种在实验室阶段。基因工程药物发展历程20世纪70年代DNA重组技术建立。107我国基因工程药物我国从20世纪80年代初期开始基因工程药物的开发研究。1989年第一个基因工程药物干扰素批准上市。α1b型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年通过Ⅲ期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。1992年，第一个基因工程乙肝疫苗投入市场。目前已有20多种基因工程药物上市。我国基因工程药物我国从20世纪80年代初期开始基因工程药物的108基因工程药物与传统生物技术的比较材料来源困难，无法研制出产品付诸应用。提取纯化成本高，供不应求。由于免疫原性，应用受到限制。传统生物技术药物基因工程药物与传统生物技术的比较材料来源困难，无法研制出产品109可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽。如：干扰素内源生理活性物质在作为药物使用存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如：白细胞介素-2基因工程技术生产药物的优点：可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽。如：干扰素基因110（1)免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；（2）细胞因子，如干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；（3）激素，如胰岛素、生长激素、心纳素；（4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。（5）疫苗：乙型肝炎疫苗等基因工程技术可生产的药物和制剂包括：它们的共同点都属于蛋白质。（1)免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；基因工程技术可生产111基因工程制药的基本环节基因工程制药的基本环节112基因克隆示意图目的基因的制备分离DNA重组体的构建重组体导入宿主细胞重组体筛选和鉴定外源基因的表达表达产物的分离纯化鉴定基因克隆示意图目的基因的制备分离DNA重组体的构建重组体导入113第二节基因工程制药基本知识第二节基因工程制药基本知识114将目的基因与载体连接后，转入大肠杆菌等受体细胞，即获得基因工程菌。一、基因工程菌的构建与筛选该过程也称为基因工程的上游技术。将目的基因与载体连接后，转入大肠杆菌等受体细胞，即获得基因工1151、载体（vector）载体是携带外源目的基因或DNA进入宿主细胞，实现外源基因无性繁殖或表达有意义蛋白质所采用的DNA分子。包括质粒载体等。外源基因需借助载体的帮助才能进入受体细胞。1、载体（vector）载体是携带外源目的基因或DNA进入宿1161、质粒载体（plasmid）质粒是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质（DNA分子）。存在于几乎所有细菌中，一种自我复制的双链环状DNA分子。能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。1、质粒载体（plasmid）质粒是指独立于原核生物染色体之117大小为1~300kb，有三种构型：cccDNA、ocDNA、lDNA。大小为1~300kb，有三种构型：cccDNA、ocDNA118质粒的特性质粒的特性1191、具有遗传传递和遗传交换的能力可编码自身蛋白质，对宿主生存无决定性影响。可进行独立复制，并随宿主细胞的分裂传递给后代。1、具有遗传传递和遗传交换的能力可编码自身蛋白质，对宿主生存120用于克隆表达的质粒须具备以下要素复制子又称为复制起始区，包含控制质粒DNA复制起点和质粒拷贝数等遗传因素。用于克隆表达的质粒须具备以下要素复制子121选择性标记(seletivemarker)是质粒携带的赋予宿主细胞新的表型的基因，用于筛选转化有质粒的宿主细胞。方式：抗生素抗性基因，包括氨苄西林（Amp）、四环素（Tet）、氯霉素（Cm）、卡那霉素（Kan）和新霉素（Neo）等。含有质粒的宿主细胞被赋予拮抗抗生素的表型，能在含抗生素的环境中生长。选择性标记(seletivemarker)是质粒携带的赋予122指质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列，由人工合成。作用：在克隆操作中，在目的基因两端设计限制性内切酶酶切位点用于插入目的基因。多克隆位点（multiplecloningsite,MCS)指质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列，由123基因工程中常见的各种质粒载体举例基因工程中常见的各种质粒载体举例124pBR322应用最广泛。有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因。有许多种常用的限制酶的切点。它全长4352个核苷酸，排列顺序已全部测定。

pBR322应用最广泛。125（二）目的基因的常用制备方法

1、化学合成法采用DNA合成仪等将已知序列的目的基因用化学合成方法直接合成。

合成前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因。必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。目前，常用DNA自动合成仪合成。（二）目的基因的常用制备方法1、化学合成法目前，常用DN1262、PCR（polymerasechainreaction）是根据生物体内DNA复制原理，在DNA聚合酶催化下，依赖DNA模板特异性扩增DNA.KaryBMullis特点：

可在体外大量特异性扩增目的基因，实验室常用。2、PCR（polymerasechainreactio127PCR反应成分1、模板DNA；2、引物；3、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）

；4、DNA聚合酶；5、反应缓冲液、Mg2+等。PCR反应成分1、模板DNA；2、引物；3、四种脱氧核糖核苷128PCR反应基本步骤

变性：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。

退火：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子，（55℃，30s）。延伸：在DNA聚合酶、dNTPs、

Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链，即中温延伸反应（70～72℃，30～60s）。

PCR反应基本步骤变性：退火：延伸：129

以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。从而目的基因得到大量扩增。是目前最为常用的目的基因制备方法。以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可130三、载体与目的基因的链接即连接酶催化载体DNA与目的基因DNA片段连接，形成重组子（recombinant）。该技术称为DNA体外重组技术。三、载体与目的基因的链接即连接酶催化载体DNA与目的基因DN131连接可分为以下几种类型粘性末端（stikyend）连接

目的基因两端有与载体上相同的限制性核酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端，能重新互补结合，在DNA连接酶催化下，目的序列就与载体DNA链相连接。

效率较高，较常用。连接可分为以下几种类型粘性末端（stikyend）连接效率132平头末端（bluntend）链接：

效率很低（约1/10~1/100），T4DNA连接酶可催化。平头末端（bluntend）链接：133四、重组DNA导入宿主细胞基因工程中常见宿主细胞：宿主细胞原核细胞真核细胞大肠杆菌枯草杆菌链球菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞植物细胞四、重组DNA导入宿主细胞基因工程中常见宿主细胞：宿主细胞原1341、重组DNA导入大肠杆菌的方法1970年，Mandel和Higa发现大肠杆菌经氯化钙处理，能吸收噬菌体DNA，之后Cohen等实现了质粒DNA转化感受态大肠杆菌。受体细胞1、重组DNA导入大肠杆菌的方法1970年，Mandel和H13550-100mmol/LCaCl2

感受态细菌重组体转入细菌对数生长期的大肠杆菌经冰浴（0℃)的氯化钙低渗溶液处理后，细胞膨胀成球形，细胞膜通透性会增加，成为感受态细胞；氯化钙转化法加入重组质粒，重组质粒与钙离子形成复合物并粘附于细胞表面，在42℃短时间（90s）热冲击后，重组质粒进入感受态细胞，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。50-100mmol/LCaCl2感受态细菌重组体转入细136五、重组子的筛选与鉴定

1、载体遗传标记法

五、重组子的筛选与鉴定1、载体遗传标记法137

（1）、抗生素抗性筛选法（最常见）

抗氨苄青霉素基因抗四环素基因抗卡那霉素基因等（1）、抗生素抗性筛选法（最常见）138如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性基因导致本来Amp敏感的菌株也可以在含有Amp的固体培养基上生长，如图1。如转化不成功则Amp敏感的菌株和阴性对照不会在含有Amp的固体培养基上生长，如图2。图1图2如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性基因导致本139蓝－白筛选示意图蓝－白筛选示意图140基因工程制药-课件141六、原核细胞表达的特点及选择六、原核细胞表达的特点及选择142原核表达系统有大肠杆菌芽孢杆菌链霉菌原核表达系统有大肠杆菌143大肠杆菌（E.coli）优点：开发最早、研究最成熟遗传学研究深入，基因组序列已明确。

生长迅速，适合大规模生产。所以是外源基因表达的首选表达系统。大肠杆菌（E.coli）优点：开发最早、研究最成熟所以144中心法则中心法则1452、外源基因在大肠杆菌中的表达形式表达产物可位于以下三个区域：胞内周质胞外

大肠杆菌电镜照片2、外源基因在大肠杆菌中的表达形式表达产物可位于以下三个区域146胞内表达有两种表达形式，即非融合蛋白和融合蛋白。由两种蛋白结合在一起的蛋白质，称为融合蛋白。胞内非融合蛋白是指表达的外源蛋白的N端不含任何大肠杆菌的多肽序列。融合蛋白是指将外源基因融合至某种特定基因的下游，表达的外源蛋白N端含原核多肽。胞内表达有两种表达形式，即非融合蛋白和融合蛋白。由两种蛋白结147分泌表达方法：通过将外源基因融合至编码原核蛋白信号肽序列的下游。融合蛋白（含信号肽和外源蛋白）在跨过膜后，信号肽酶切去信号肽，外源蛋白被分泌至细胞周质空间或胞外。外源基因高效表达，可达大肠杆菌总蛋白的10~70%，易形成包涵体，故采用分泌表达。分泌表达方法：通过将外源基因融合至编码原核蛋白信号肽序列的下148什么是包涵体？原因细胞的外源蛋白质，蛋白合成速度太快(可达大肠杆菌总蛋白的10~70%)，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。这些蛋白质会堆积起来形成不溶的形式。大的包涵体可以利用光学显微镜看得到。在一些情况下，有些包涵体比较大，直径大于大肠杆菌的直径，使得大肠杆菌有一个突起。细胞内包涵体什么是包涵体？原因细胞的外源蛋白质，蛋白合成速度太快(可达大149什么是信号肽？分泌蛋白新生肽链N端的一段20～30氨基酸残基组成的肽段。用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）。什么是信号肽？分泌蛋白新生肽链N端的一段20～30氨基酸残基150七、真核细胞表达的特点原核表达的缺点

缺乏蛋白翻译后加工修饰系统，影响外源蛋白生物活性。 以包涵体形式存在，须经变性，复性处理。 外源蛋白在原核生物中不稳定。真核生物和原核生物基因表达过程示意图七、真核细胞表达的特点原核表达的缺点真核生物和原核生物基因表151常用的真核表达系统酵母表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统常用的真核表达系统酵母表达系统1521、酵母表达系统基因工程中应用最广泛的酵母表达系统为巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母结构模式图1、酵母表达系统基因工程中应用最广泛的酵母表达系统为巴斯德毕153巴斯德毕赤酵母简介是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。

1987年，Cregg等人首次报道了用甲醇营养型酵母表达乙型肝炎表面抗原(HbsAg）。巴斯德毕赤酵母简介是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯154巴斯德毕赤酵母主要优点为高表达量高稳定性翻译后修饰功能分泌表达巴斯德毕赤酵母主要优点为高表达量高稳定性翻译后修饰功能分泌表1553、哺乳动物细胞表达系统蛋白质正确折叠，具有蛋白质翻译后加工功能。所以外源蛋白在结构、理化性质和生物功能最为接近天然的高等生物。3、哺乳动物细胞表达系统蛋白质正确折叠，具有蛋白质翻译后加工156哺乳动物细胞表达系统的表达载体病毒载体质粒载体哺乳动物细胞表达系统的表达载体病毒载体157常用哺乳动物细胞株CHO细胞骨髓瘤细胞株常用哺乳动物细胞株CHO细胞158基因重组蛋白的分离纯化和分析鉴定基因重组蛋白的分离纯化和分析鉴定159分离纯化技术应满足以下要求技术条件要温和选择性要好回收率要高分离纯化过程要快分离纯化技术应满足以下要求技术条件要温和选择性要好回收率要高160（一）基因重组蛋白主要的分离技术1.离心实现固液分离分离细胞、细胞碎片、包涵体和病毒颗粒（一）基因重组蛋白主要的分离技术1.离心1612.蛋白沉淀利用某些方法使蛋白质沉淀，再离心分离等电点沉淀法盐析法，常用硫酸铵2.蛋白沉淀等电点沉淀法盐析法，常用硫酸铵162等电点沉淀法

原理：在等电点时，蛋白质分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀。等电点沉淀法原理：在等电点时，蛋白质分子净电荷为零(即正负163盐析法的原理蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。

加入高浓度中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。

盐析法的原理蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子1643.膜分离是指用半透膜（semi-permeablemembrane）（如醋酸纤维素膜）作为选择性障碍层，使溶液中某些组份通过，而截留其它组分的分离方法。3.膜分离是指用半透膜（semi-permeablemem165（1）透析透析是指分子量较小的分子或离子（如生理上的电解质）能够穿透半透性膜（semi-permeablemembrane）析出，较大的分子就不能通过半透膜。（1）透析透析166透析可用于脱盐和去除杂蛋白。透析可用于脱盐和去除杂蛋白。167（二）基因重组蛋白的主要纯化技术主要是层析法（二）基因重组蛋白的主要纯化技术主要是层析法168层析(chromatography)

基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。

层析(chromatography)基于不同物质在流动相和1691.离子交换层析(ion-exchangechromatography)

根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。即不同蛋白质在一定pH下所带电荷不同，与分离介质上的离子化基团结合能力也不同，从而实现分离纯化。1.离子交换层析(ion-exchangechromato170分为阳离子交换和阴离子交换层析等。优点：操作容易，应用广泛，是基因工程蛋白质药物分离纯化的重要方法。缺点：特异性不强分为阳离子交换和阴离子交换层析等。1712.亲和层析(affinitychromatography)

在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合。这种结合具有特异性和专一性的，又具可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。2.亲和层析(affinitychromatography172优点：纯化后纯度高，可去除大多数杂蛋白。缺点：难找到合适的层析介质，成本高，应用范 围不广。优点：纯化后纯度高，可去除大多数杂蛋白。缺点：难找到合适的层1733.凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)

凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状来实现分离纯化。所用凝胶颗粒是惰性不带电荷的多孔网状支持物。3.凝胶过滤层析(gelfiltrationchrom1744.疏水色谱利用蛋白质分子的疏水性差异来实现分离。固定相疏水基团蛋白质上的疏水区域丙氨酸甲硫氨酸色氨酸苯丙氨酸4.疏水色谱利用蛋白质分子的疏水性差异来实现分离。固定相175RP-HPLC色谱柱RP-HPLC色谱柱176人血浆中不同蛋白分离色谱图人血浆中不同蛋白分离色谱图177基因工程药物质量控制基因工程药物质量控制178一、基因工程药物质量控制要点蛋白质含量测定蛋白质纯度检测蛋白质分子量测定蛋白质等电点测定蛋白质序列分析杂质分析一、基因工程药物质量控制要点蛋白质含量测定蛋白质纯度检测蛋白179蛋白质含量测定方法蛋白质含量测定方法180色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸在280nm波长附近有吸收峰，蛋白质中含有这些芳香族氨基酸，故蛋白质在280nm处有特征吸收，故测定280nm处的吸光度值可计算蛋白含量。1.紫外吸收光谱法色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸在280nm波长附近有吸收峰，蛋白181标准曲线标准曲线1822.BCA法（BicinchoninicAcid）

形成一个在562nm处有最大吸光度的紫色复合物，其吸光度与蛋白质浓度成正比。2.BCA法（BicinchoninicAcid）1833.Lowry法Folin-酚法所用的试剂（Folin-酚试剂）由两部分组成。试剂甲：其中的Cu可与蛋白质中的肽键形成复合物。试剂乙：磷钨酸和磷钼酸混合液，复合物可与其产生蓝色。3.Lowry法Folin-酚法所用的