上一届课件-lecture8重组dna技术彩色版

1重组DNA技术的发年 球菌转化实1973 斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分 程公司,专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工1997年英 成功的克隆了多莉2345进行剪切和重新连接，形成重组的DNA扩增达有关的产物，进行结构与功能的研究（DNA序列分析、表达调控元件的研究、治疗等）、或对外源进行表达、分离、纯化的技术。6重组DNA binantDNAtechnology 的遗传元件（又称载体）中，形成重殖。这种或DN段以产生大量DNA拷贝7DNA重组DNA重组bination）接而形成重新组合的DNA重组DNA binantDNADNA分子。8 生物技术工程蛋细胞9DNA克隆的克隆（clone在细胞学中，指通过无性繁殖过程产一群体中的所有细胞具有完全相同的型“克隆”分子生物学中，是指通过重组DNA( binantDNA)技术获得的具有相同DNA序列的单一或DN段的多个贝(copy)获取同一拷贝的过程,称为克隆化DNA技术是通过一系列操作在 DNA分子

genemolecular重组DNA的策略与技术路1、获得目 /目的2、目 与载体的酶切和连3、重组DNA分子导入4、筛选和鉴定含重组DNA分子的5、DNA分子的 重组DNA技术常用的 binantDNA限制性核酸内切DNA聚合酶TaqDNA聚合T4DNA连接碱性磷酸末端转移

1978DNA聚合一、限制性核酸内切1、定义:一类能识DNA分子中特定或附近的磷酸二酯键的核酸内核酸种类通常所指的限制酶为II型限制酶内切II切割位点在识别位点内： Hin

Haemophilusinfluenzaed株 用罗马数字表示发现的先后次 识别序列一般为4~6bp称（二重对称）性或回文结构平末端（bluntendsorflushends粘性末端（stickyendsorcohesive粘性末端（stickyendsorcohesiveends）:5’端突出5’端突出的粘性末BamH3’端突出平末端（平末端（bluntendsorflushends5’AG5’AG3’TC4、异源同裂酶/同工异源酶特点：1）识别相同顺2）

GGTACCGGTACCCCGCGGCCGCGGGGATCCGGATCC5、同尾酶定义：酶的来源不同，识别序列切割DNA后可产生相同的粘特点：1）识别不2）SalSalXho

+TCGAG3’ C

二、DNA二、DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApolDNA聚合酶指以dNTP为底物，催化dNTP聚反应模板（template）：需核酸作为模以DNA作为模板，DNA指导的DNA聚合酶以RNA作为模板RNA指导的DNA聚合引物（primer):含3’-OH末端的低聚核苷酸3’-OH为合成的起始点DNA聚合酶：缓冲液1、大肠杆菌DNA聚合酶（E.coliDNApolymeraseI，全酶分子量为109kD，具有三种活性的多功5’→3’聚合3’→5’外切酶5’→3’外切(1)用切口平移方法标DNA探针2、Klenow酶（大肠杆菌DNA聚合酶I大片段largefragmentofDNApol蛋白E.coliDNApol Klenow酶(C端大片段3’→5’外切酶用途补平限制酶切割DNA所产生的3’对 段进行末端标在cDNA克隆中，用于cDNADNA序列测将粘性末端转变成钝性末OHG

DNA聚合

GAATCTTA CTTA

对5-粘性末端片段，利用大肠杆菌DNAI的33、TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase特点是一种耐热的DNA聚合酶，最佳作用温度为75-80C。活性，缺乏3’5’外切酶用途PCR，DNA序列测定4、逆转录酶(ReverseTranscriptaseRTase)特点以mRNA作为模板,以dNTP为底物,RNA指导的DNA聚合酶(RDDP，RNA-dependentDNApolymerase种类禽成髓细胞 Moloney鼠白血 功禽源:聚合酶活性和很强的RNaseH鼠源:聚合酶活性和相对较弱的RNasH无3’5’DNA外切酶活性,故无校对功能用途RT- cDNA文主要有两种：T4噬菌体 连接大肠杆菌 连接 3’-OH与5’-磷酸基之间3’5’-磷酸二将两段 断拼接起(连接双链DNA）四、T4多核苷酸激酶(T4polynucleotide催化ATPγ-磷酸转移到DNA链用途 将人工接头和其它没有5’-末端磷酸的 五、碱性磷酸酶（alkaline五、碱性磷酸酶（alkaline作用：催化切除DNA、RNA、dNTP5’磷酸用途防止酶切后DNA六、不依赖于模板的DNA——末端脱氧核苷酸转末端给载体或cDNA 段的3’末端

末端转移 末端转移酶（一（二）RNase作用于DNA-RNA杂交分子RNA链,（三）DNaseds-DNA结构切口缺口 缺口 切口 断口重组DNA技术中常工具酶 ②填补3´二链合成，双链DNA3末端标记等合成②催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探在3´羟基末端进行同质多聚物加第二 克隆的载载体定义：

克隆的载携带目的 段进入宿主细进行扩增和表达的一类DNA载体的本质 载体的特1、能自 ：至少有一 起始（originofreplication，ori）2、具备筛选标记（selectionmarker），便于重组体的筛选和3、在细胞中拷贝数4、有适当的限制性内（常具有多个单一酶切位点，称多克位点，即MCSmultiplecloningsites，多克隆位MultiplecloningHind

Sph

Pst

SacIAccI

Xba

BamHISmaIKpnXma

Sac

EcoR载体的 能克隆型载体（扩增表达宿主真核细胞载体(表达/穿梭载体来源质粒载体、 嗜菌体载体、昆虫载体质粒载体是最常用的载质粒载体（plasmid）粘粒载体（cosmid）酵母人 载体（Yeast载体逆转录 疱 、腺相昆虫一、质粒载（一）质粒是存在于多数细菌和某些真核生 分子生物学中常用的质粒松弛型质粒（须经人工改造作为克隆载体的质如：抗生素-半乳糖苷 （Lac具有多个限制性内切酶的单一切点便于外 的插入某种标 的插入失活,便于筛选（二）质粒载的、携带目的DN段进入宿主细胞进行（三）（三）11长度筛选标筛选方法：双抗生素对照筛1000—3000个拷贝。22.69筛选标记:pUC18pUC18和pUC19多克隆位点方向相

EcoR

Sac

KpnISmaIBamHXma

SacXba Acc

Pst

Sph

HindHind

Sph

Pst

SacIAccI

Xba

BamHISmaIKpnXma

Sac

EcoRPrimer与待测核酸模板特异互补的寡聚核苷酸单链(自行设计) 载体pUC18/19pGEMM13嗜菌体载体(单链合待通引载体待通引引载体引合成3、 Neomycin(真核pcDNA3.1(+)(5428 质粒载

克隆表达

真核表达载克隆载体的克隆载体(cloning保存和扩增小于2kb的 构建cDNA用于目的DNA表达载体的为使插入的外源DNA序列在受体细胞转录翻译成多肽链而特意设计的质粒载 用：表达目 治疗，目 的研究重组蛋白质 等质粒载体的缺陷 段较小(<2kb)。二、噬菌 是一段DNA，结构巴,尾巴上的微丝可以把菌体的DNA注入细菌内噬菌体 结构不同，生物学性状不同噬菌体载体的结构不同，用途双链噬菌体载体（λ噬菌体：改造λ噬菌体gt系 （插入型，适用cDNA克隆EMBL系列（替换型，适 组克隆单链噬菌体载体（M13：改造M13噬菌体含 （一）λ1、λ噬菌体的生物学特组特点：双链线性溶菌性生长（裂解性生长（lytic溶源性生长（lysogenic噬菌 整合和重 (非必要区衣壳粘性

调控粘性Cos位点（Cohesive-end头、cI头、cIcroDNA

头部合尾部合DNA必须由外壳蛋白包装后方可形成完整的，才能感染大肠杆菌，而且包装的噬菌体大肠杆菌要比质粒转化噬菌体载体的克隆操作要包装对DNA长度的限：插入或置换型载 （1）(insertλgt10

<EcoREcoREcoREcoR

构建cDNA文库，能克隆7kb以下的外源DNA14kb的非必需区，可被非必需区两侧有一对限制性酶如

EcoRIBamHISalI（二）M13噬菌体及载闭环单股正链在细菌内形成过渡的双链环状以 单链形式分泌到培养基M13载体优点：产生单链正型DNA（RF Replicativeform正不对称滚含 中有多克隆位点M13mp18和M13mp19的差多克隆位点方向相EcoR

Sac

KpnISmaIBamHXma

SacXba Acc

Pst

Sph

HindHind

Sph

Pst

SacIAccI

Xba

BamHISmaIKpnXma

Sac

EcoR+转化大肠杆筛选白色噬菌 提取噬菌 提取 细菌人 如 载腺相 载逆转 载细菌质粒<M13mp细菌质粒<M13mp<4噬菌体载<粘粒<48kb(40-pYAC~1000四、表达载体（expression表达系统表达目的、合成目的真核细胞表载体的元件：表达原核细胞表达载体 真核细胞表达载体

只能被原核细胞表达系统识 启动

表达系统识第三 克隆的基本过重组DNA的基本过1、分：分离2、切：对目 和载体适当切3、接：目 与载体连4、转：重组DNA转入5、筛：筛选出含有重组体6 表达和蛋白纯一、目 的获得目 （target 或外源性DNA获得目 （一）直接 组DNA获得目 （二 文库的构建和筛选目genelibrarycDNA

GenomicLibrarycDNALibrary文库（gene两类 组文cDNA将某种生物细胞的组DNA切割这些含有一个有机体组DNA的重 组序 构 组文库、筛选目1、提 组DNA酶2、 段(酶切)与载体的连接及包

连接

尾的蛋包噬菌体颗3、导入受体细胞：噬菌 细4、筛选目 核酸杂交法：用与目 互补的标探针，与目 特异合，筛选出目 免 检测蛋白的方法——限制酶切位cos

R限制

限制酶部分除去中间片cos R

~20KbDNA外源DNA与载体DNAcos

~20Kb外源DNA片 R体外包

用重组噬菌大肠杆文片 片 组织或细 重重组DNA分受体

存在于转化细 组DNA的集合筛选筛选出所需要的克文库文库的特点及应2、构建难度大（单拷 、长片 3、筛选难4、用于研 组中的情cDNA文库(cDNAmRNA为模板合成cDNA，将获得的cDN段在某种特定细胞及特定状态下的全部cDNA克插入片段的总和：代表该生物（或组织）全mRNA序列特点cDNA文库仅包含正在表达 (外显子不同物种、不同组织的cDNA文库不总量少，易筛构建cDNA文库、筛mRNA的分离反转录合成cDNA第一cDNA第二链的重组DNAcDNA筛选（核酸杂交法、免 反转录

mRNA的分离纯化mRNA双链受体cDNA

噬菌体载体gt10、质粒载 pUC系扩扩增后供长筛选筛选出所需要的克mRNAmRNA——三种分离mRNA1、传统的分用oligo(dT)-纤维素柱分离2、把oligo(dT)-磁珠同总RNA混合，在强磁场下分离mRNA3、梯度离心用蔗糖梯度离心mRNA核糖体复合体（溶解细胞）来分离mRNA。oligo(dT)-纤维素柱分 cDNA第一链的

引物oligo-反转 AAA(A)n引物反转录酶

第一 TTTT12~18第一 AAA(A)ncDNA第二链(1)碱水解

TTTT12~185’AAA(A)nTTTT12~18

杂交TTTT12~18Klenow酶、TTTT12~18AAAA12~18S1核酸

TTTT12~18AAAA12~18 双链 （2）RNA

TTTT12~185’AAA(A)nTTTT12~18

Klenow酶T4DNA

双构建cDNA文库的流组织细细胞破碎，除去DNA和蛋白提取总oligo(dT)纤维素亲和层析纯化反转合成cDNA第一合成cDNA合成cDNA插入载重组DNA（与载体连接导入受体构建cDNA

合成构建cDNA

组组 RT-PCR（mRNA-cDNA-（四）人工合成目 或其产物的氨基酸序列。长度受限（<100nt）*化学合成法获由已知氨基酸序列推测可能的DNA二、载体的选择与准1、按实验目的选择构建

cDNA

噬菌体载DNA克隆

M13噬菌质粒表达2、载体 ：DNA提3、载体的

三、目 与载体的酶切与连（体外重组连接反应的粘性末端的连1、全同人工接头（一）粘性末端的1、来源：载体和外源DN段分别用—同— 制

BamHⅠ切割反 载体DNA用BamHⅠ切 G G

目的DNA用BamHⅠ切GGT4DNA连接载体

目 自 限制性酶3’连3’连接正向正向插反向插缺点1、高背景——载体自我环2增加筛选鉴定的工作插入与非插入的重组子正向与反向插入解决方法：载体片断去载体自我环化2、定定义：使外源DN 分子中的克隆方案叫定向克隆方案：将外源DN 限制性内切酶切割，相同的两个内切酶切割（双酶切连接方式：（1）（2）粘-平（酶切，补平定向克

将粘性末端转变成钝性末OHG

GAATGAATCTTA

CTTA

对5-粘性末端片段，利用大肠杆菌DNAI的将粘性末端转变成钝性末C CCTGCG

核酸外切

（二）平末端粘端补齐或切特点：普遍适连接效率比目的DNA目的片段双向目载限制性内切限制性内切重组

人工接头：含某些人工接头：含某些限制性内切酶切点寡核苷酸种类：连接子特点两端平头，含限制酶切位点普适子CEcoC优点（四）同聚物加尾移酶（TdT）的作用下DNA3’-OH末目限制酶或机械剪

载体 λ-核酸外切 末端+ A(A)nA

λ-核酸外末端转移+T(T)nT

重组对象：PCR载体切口处加游离的T，可与产物T-vector两条链的T-vector两条链的5’-端含有一个游离的PCR过程中，普通的Taq3’-端多加一个反应反应体系：目的载体T4DNA连接连接缓冲液反应条件：DNA连接温度粘末端连接：12-平末端连接：室温（低于DNA载体分子数:目 分子数=1:1-酶量平端连接时需加大酶量构建重组载体产生DNA杂合分

四、重组DNA导入宿主重组DNA（重组子或重组体携带有目的DNA宿主细胞真核原核导入方导入/原核细胞，使其获得新的表将外源DNA直接转入真核细 将DNA（非包装）导入细胞采用包DNA转入细胞，噬菌体载体和细胞载体介导进行包装，形成噬菌体或假，外源常用的方化学法—氯化感受态细菌（competentcell）：处于容易吸收外源DNA状态氯化钙法原细菌00C、低渗CaCl2溶液中处理内转化反感受态细胞+连转化反感受态细胞+连接反应产物（重组子00C,2min液体培养基，370C将细菌铺于固体培养基370C, petent（二）真核细胞转染的方 介导 转移电穿DEAE- 转染外源DNA导入真核细方法 介导 转移 介导 转物理化学

电穿显微酸钙沉淀DEAE-葡聚糖 介导 转1、磷酸钙共DNA或重组质粒与磷酸钙形成DNA—磷酸钙复合物，加入到宿主细胞稳稳定转染效率已超过2、电穿孔电穿孔法把悬浮的受体细胞和DNA共同置于经过孔隙进入细胞适用的受体细原核细 点：转化效率（109-1010/ug3、 转染 多聚阳离子 LipofectamineTMReagent（Invitrogen）组成是带正电荷的类脂DOTMA与所组成的混合物原理聚阳离子脂与DNA迅速形成脂质效率高于磷酸钙法和DEAE-用途转染DNA、RNA、寡聚

4、显微需特殊的 动人 表达瞬时转染（transient转入细胞内的大部分外 ，稳定转染（stable 五、重组体的筛选与鉴遗传学筛选方（表型变化酶切PCR

-互补标志补救(marker核酸免疫学

原位Southern免疫化学方法及酶免检测分DNA序列测生物学活性

（一）（一）平板筛1、抗药性筛Ampr（ampicillin氨苄青霉素抗 ，编码-内酰胺酶，使氨苄青霉素水解，故具氨苄青霉素抗四环素抗 ()药插性入标失记活选法()外 在2、蓝白斑筛选2、蓝白斑筛选—— X-galβ-半乳糖苷酶 突变型lac-E.coli可表达β-半乳糖苷酶的（C端）才具β-半乳糖苷酶活性，可使底物（X-gal）变为蓝色化合物载 大肠杆 互互互蓝双酶单菌落扩大双酶 MW(MW(片断大小鉴定插入方向（三）PCR

载体上带有一些常（四）核酸原原位Southern

（五） Western（六）DNA序列测质PCR重组DNA技术操作的主要步 质 噬菌

目 （外 组 人工合 PCR产开环载体

限制目连接重组转 体外包装，转表型

带重组体筛酶切电泳鉴定 核酸杂 免疫 第四重组DNA技术在生物及医学中1、克隆并表达具有生物活性的蛋