丙型肝炎治疗药物研究与设计说明

69/69目录丙型肝炎治疗药物研究与设计………3以生命周期划分HCV治疗药物整理………4HCV的结构………………...……………4HCV生命周期………...…5以生命周期划分HCV治疗药物整理…………6总结和展望………...…………..……….13基于NS5A抑制剂的创新药物设计………14前言14NS5A靶点14NS5A抑制剂研究进展15BMS-790052(daclatasvir)研究20创新药物设计24参考文献26TLR-7激动剂研究与设计………………….29目前已开发的激动剂29咪唑喹啉胺（imidazoquinolineamine）类291-取代吡唑啉酮（1-SubstitutedPyrazolo(3,4-C)Ring）类318-氧-去氮嘌呤类/咪唑并吡啶酮类328-羟基腺嘌呤（8-Hydroxyadenine）类36扩环8-羟基腺嘌呤类57艾沙托立宾（Isatoribine）衍生物类61BitriazolylAcyclonucleoside类64三氮唑类（Triazole）65嘧啶类（Pyrimidine）668-SubstituedBenzoazepines类68Aminodiazepine类69未来可能的变动空间70创新药物设计71参考文献76基于NS5B抑制剂的创新药物设计….………...………….79已报道Sofosbuvir类似物碱性部分结构总结………………...………79sofosbuvir类似物碱性部分设计……….80丙型肝炎治疗药物研究与设计丙肝病毒（HCV）是一种血液传播病毒，丙型肝炎是由丙肝病毒引起的肝病，在世界围影响着大约1.5亿人口。HCV有六种基因型，在全球的分布不同（见下图）。丙肝的潜伏期为两周至六个月。最初被感染后，大约80%的人并不会出现任何症状。可能出现的急性症状包括发热、全身乏力、食欲下降、恶心、呕吐、腹痛、尿色深、大便颜色变浅、关节酸痛和黄疸（皮肤和眼白发黄）。大约75-85%的新感染者出现慢性肝病，慢性感染者中60-70%会出现慢性肝病，5-20%会出现肝硬化，1-5%会死于肝硬化或肝癌。丙肝是25%肝癌患者的致癌因素。每年，有35万余人死于与丙肝相关的肝脏疾病。目前，还没有预防丙肝的疫苗。干扰素和利巴韦林抗病毒联合疗法是目前治疗丙肝的主要方法。但干扰素在全球并不能普遍获得，并不总是耐受良好，有些病毒基因型对干扰素的反应优于其它基因型，而且许多使用干扰素治疗的人未完成其疗程。结果，虽然一般认为丙肝是可以治愈的，但很多人却未能痊愈。近来，全口服、无干扰素的直接靶向病毒的新一代抗丙肝药物大量出现，为丙肝的彻底治愈带来希望，其中尤其以吉立德（Gilead）公司的sofosbuvir最具潜力。并且，临床实践证明，将多组分、不同机制的药物连用的鸡尾酒疗法的效果最优。所以，全球对新机制的强效抗HCV药物的研发正在如火如荼的进行中，我们也对其产生极大兴趣。以生命周期划分HCV治疗药物整理为选择出最具潜力的治疗靶点，我们首先对目前已经披露的所有HCV治疗药物进行了总结，主要参考了近年的一些文献，然后按照其对应的HCV的生命周期进行分类，并对其风险、潜力进行简单打分\o"Pawlotsky,2006#828"ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA1。HCV的结构：如右图所示，HCV病毒体呈球形，直径小于80nm（在肝细胞中为36-40nm，在血液中为36-62nm），为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有剌突.图一、HCV结构如下图所示，HCV的RNA大约由9500－10000bp组成，5′和3′非编码区（NCR）分别有319-341bp和27-55bp，含有几个顺向和反向重复序列，可能与基因复制有关。在5′非编码区下游紧接一开放的阅读框（ORF），其中基因组排列顺序为5'-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3'，能编码一长度大约为3014个氨基酸的多聚蛋白前体，后者可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成10种病毒蛋白，包括三种结构蛋白，即分子量19KD的核衣壳蛋白（或称核心蛋白，Core）和两种糖蛋白（分子量为33KD的E1蛋白，分子量72Kd的E2蛋白），p7编码一种膜在蛋白，其功能可能是一种离子通道。非结构蛋白部分则包括NS2，NS3，NS4A，NS5A和NS5B，非结构蛋白对病毒的生活周期非常重要。NS2和NS3具有蛋白酶活性，参与病毒多聚蛋白前体的切割。此外，NS3蛋白还具有螺旋酶活性，参与解旋HCV-RNA分子，以协助RNA复制，NS4的功能尚不清楚。NS5A是一种磷酸蛋白，可以与多种宿主细胞蛋白相互作用，对于病毒的复制起重要作用。而NS5B则具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，参与HCV基因组复制。图二、HCV的基因结构HCV生命周期：HCV在体的生命周期可分为以下过程：病毒进入并脱壳，可能涉与LDL受体和粘多糖；转译以与加工多聚蛋白NS3/NS4A；HCVRNA复制，涉与到宿主质网以与病毒自身的BS4B，BS5B和NS5A；病毒组装和释放。图三、HCV的生命周期以生命周期划分HCV治疗药物整理对HCV不同周期时药物所针对的不同途径，我们分四个阶段进行总结，大体如下图所示：同时，我们对各个途径的新颖性，各个靶点、药物的风险、潜力进行了简单的评级，黑色四星（★★★★）为最高，白色四星（☆☆☆☆）最低。最后综合评价其风险与潜力，对靶点进行挑选。3.1、病毒进入并脱壳。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力病毒进入★★★☆ITX-5061phase2靶点：SR-BI避免耐药问题★★★☆★★★☆3.2、转译以与加工多聚蛋白。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力蛋白加工★★★☆Telaprevir上市NS3/NS4AincreaseSVRratesfrom~50%to~70%★★★☆Boceprevir上市NS3/NS4AHightowardGT1,lowertowardGT2andGT3★★★☆Simeprevir(TMC-435)Phase3NDANS3/NS4A★★★☆Faldaprevir(BI201335)Vaniprevir(MK-7009)Asunaprevir(BMS-650032)ABT-450Danoprevir(RG7227)Sovaprevir(ACH-1625)Vedroprevir(GS-9451)MK-5172Neceprevir(ACH-2684)Phase2-3NS3/NS4A与上述三个化合物结构类似加黑部分为第二代产品，活性更强，基因型更广，更耐突变★★★☆GS-9132DiscontinuedACH-1095NoDevelopmentReportedNS2-NS3（理论阶段）★★★★★★★☆3.3、HCVRNA复制，涉与到宿主质网以与病毒自身的BS4B和NS5A。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力RNA复制★★★☆Daclatasvir(BMS-790052)Phase3,NS5A极其强效。不耐突变，与其它药物连用效果好。★☆☆☆★★★☆Ledipasvir(GS-5885)Phase3,NS5A★☆☆☆★★★☆GSK-2336805Phase2Clinical，NS5A★☆☆☆★★★☆ABT-267Phase3ClinicalNS5A★☆☆☆★★★☆ACH-3102Phase2ClinicalNS5A★☆☆☆★★★☆IDX-719Phase2ClinicalNS5A★☆☆☆★★★☆MK-8742Phase2ClinicalNS5A★☆☆☆★★★☆PPI-668Phase2ClinicalNS5A★☆☆☆★★★☆GS-5816Phase2ClinicalNS5A★☆☆☆★★★☆A-972338DiscoveryNS5A★★★☆★★☆☆??NoDevelopmentReportedNS5A★★★☆★★☆☆3.3、HCVRNA复制，涉与到宿主质网以与病毒自身的BS4B和NS5A。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力RNA复制★★★☆Sofosbuvir(GS-7977)Phase3ClinicalNDANS5B★☆☆☆★★★★Mericitabine(RG7128)Phase2ClinicalNS5B★★☆☆★★★☆VX-135Phase2ClinicalNS5B★★★☆★★★☆ABT-333Phase3ClinicalNS5BPalm-I/C★★★☆★★★☆BI207127Phase3ClinicalThumb-I/A★★★☆★★★☆BMS-791325Phase2ClinicalThumb-I/A★★★☆★★★☆Lomibuvir(VX-222)Phase2ClinicalNS5BThumb-II/B★★★☆★★★☆ABT-072Phase2ClinicalPalm-I/C★★★☆★★★☆Setrobuvir(RG7790)Phase2ClinicalPalm-I/C★★★☆★★★☆GS-9669Phase2ClinicalNS5BThumb-II/B★★★☆★★★☆TMC647055Phase2ClinicalNS5BThumb-I/A★★★☆★★★☆3.3、HCVRNA复制，涉与到宿主质网以与病毒自身的BS4B和NS5A。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力RNA复制★★★☆IDX-375NoDevelopmentReportedNS5B★★★☆★★★☆NesbuvirDiscontinuedNS5BMK-0608NoDevelopmentReportedNS5BPSI-6130DiscontinuedNS5BPSI-938Phase2ClinicalNS5B★★★☆★★★☆deleobuvirPhase3ClinicalNS5B★★★☆★★★☆TegobuvirPhase2ClinicalNS5B★★★☆★★★☆3.3、HCVRNA复制，涉与到宿主质网以与病毒自身的BS4B和NS5A。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力RNA复制★★★☆JTK-109DiscontinuedNS5B--DiscoveryNS5B★★★★★★★☆VX-759NoDevelopmentReportedNS5BClemizolePhase1ClinicalNS4B★★★★★★★☆DEBIO-025Phase3ClinicalCyclophilin抑制剂与其它药物联用，GT1★★☆☆★★★☆miravirsen3.4、病毒组装和释放。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力释放★★★☆celgosivirPhase2Glucosidaseinhibitors★★★☆★★★☆3.5、其它方式。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力利巴韦林和IFN连用最早上市疗程长副作用较大☆☆☆☆★★★☆疫苗★★★☆GI-5005Phase1bTherapeuticvaccine(BasedonNS3-Corefusionprotein)★★★☆★★★☆抗体★★★☆CivacirPhase3Anti-HCVenrichedimmuneglobulinproduct★★★☆★★★☆BavituximabPhase2aminophospholipidsoninfectedcells★★★☆★★★☆多样调节★★★☆ZadaxinPhase3A28aminoacidpeptidewithimmunomodulatingproperties★★★☆★★★☆EMZ702Phase2Interferonenhancer★★★☆★★★☆四、总结和展望：目前已有几十种DAAs和HTAs药物进入临床或已经上市，为HCV的彻底治愈带来曙光，并宣告了全口服、多组分、无干扰素、广谱、低副作用、高病毒学治愈率时代即将到来。虽如此，考虑到效价比、服药方便性、耐药突变等因素，还是很多优化改进之处。首先针对耐药突变问题，考虑鸡尾酒式疗法，以两种或三种不同作用靶点或机制的药物进行治疗；并且，针对耐药突变问题，临床试验显示组合中需要含有至少一个高突变门槛的药物成分。其次，丙肝广泛的基因类型（6种基因型100多亚型）也是一大挑战，尤其对非核苷类抑制剂以与第一代核苷类NS3-NS4A蛋白酶抑制剂以与NS5A抑制剂。综合上述总结，我们认为HCV药物最具潜力治疗方式是将核苷聚合酶抑制剂（NS5B抑制剂）、NS5A抑制剂、蛋白酶抑制剂结合的疗法。但考虑到成本优势，小分子的TLR7激动剂也有其价值。建议选取下列化合物做起点，进行HCV创新药物项目开发：1、核苷类HCV核苷聚合酶NS5B抑制剂，此类抑制剂活性好、耐药性好，并且比较广谱：Sofosbuvir(GS-7977)Mericitabine(RG7128)2、联苯类蛋白酶NS5A抑制剂，此类抑制剂活性极高，并且和其它药物连用效果较好，然而不耐病毒突变：Daclatasvir(BMS-790052)3、TLR7激动剂：此类化合物也是治疗HBV潜在药物。基于NS5A抑制剂的创新药物设计一、前言：世界围约1.5亿人感染HCV，并且目前针对HCV最理想的治疗手段是每周注射INF-α并结合每天两次口服利巴韦林（RBV）。此治疗方案对GT1型HCV感染者效果不明显，并且存在明显副作用。针对直接抗菌药物的开发主要集中在NS3B/NS4A蛋白抑制剂和NS5BRNA依赖的RNA聚合酶抑制剂，但是还需要其他作用机理的药物以面对多基因型（6种），多亚型（100多种）的HCV病毒。NS5A在HCV复制和组装中起到重要作用，还与宿主免疫反应有关，是一个比较新颖的靶点，此类药物大多处在临床阶段，这给我们很多追赶机会研发出中国自主的丙肝治疗药物。并且此靶点对小分子调节剂与其敏感，BMS-790052与其一系列类似物的IC50值（genotype1b/bovineviraldiarrheavirusreplicon）达到皮摩尔级别。而GT1型HCV感染者属于难治性基因型，中国的丙肝患者多数属于此类，占HCV患者的58.2%，其中GT1a为1.4%，而GT1b为56.8%。BMS0790052等抑制剂的活性虽然达到较理想水平，然而还存在易被病毒突变逃逸、潜在细胞毒性、药代特性等方面问题有待改进。二、NS5A靶点：NS5A在HCV生命周期中的复制和组装阶段发挥作用，如下图一所示。此非结构蛋白质也参与若干细胞过程，比如干扰素抵抗以与凋亡调节。NS5A是一个含有447个残基的磷蛋白，有三个蛋白域\o"Tellinghuisen,2005#2064"ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA2。目前还没发现NS5A的酶功能，研究显示NS5A可能通过与其它的HCV蛋白或宿主细胞因子相互作用来发挥功能。图一NS5A在HCV生命周期中的位置NS5A的区域一（1-213残基）包含一个锌离子结合区和一个两亲的氮端螺旋，此螺旋能够促进膜连接（membraneassociation）。区域二（250-342残基）起着调节的功能，比如和蛋白激酶PKR、PI3K以与NS5B相作用，并且，此区域也包含IFN敏感性决定区。最近研究又发现区域三（356-447残基）在病毒组装而不是RNA复制中起到关键作用。并且，此组装作用就是通过区域里的磷酸化作用调节的。NS5A区域一中的36-198残基晶体结构显示其二聚为一个U型结构，并且表面排列一系列碱性氨基酸，此氨基酸被认为是与病毒RNA结合部位。而抗NS5A抑制剂的突变位点也在NS5A的氨基端附近，位于蛋白和膜之间，表明抑制剂可能就结合在二聚体结合面。图二、NS5A区域一单体结构。区域一的分子表面，A、C两图显示区域一的表面电势，以不同颜色表示，红色为酸性，白色为中性，蓝色为碱性。B、D两图显示区域一的保守度，一不同颜色表示，品红色表示>95%，淡粉红色表示75%-95%，白色表示<75%。图三、NS5A区域一的二聚体结构。A）三个方向的带状图。B）二聚体表面电势分布。由A和B图分析可见，此二聚体在靠近氮端形成了一个相对平面的、碱性表面，并在两个IB区形成了大的沟。C）NS5A结构相对质网膜的位置。三、NS5A抑制剂研究进展：大约有60篇专利报告了NS5A抑制剂作为HCV治疗药物。NS5A抑制剂的代表性化合物是BMS-790052，已经进入3期临床，结构如下图，其初步构效关系已被报道\o"Jeffrey,2011#2060"ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA3。Daclatasvir(BMS-790052)图四、NS5A抑制剂结构。目前研发较深入的NS5A抑制剂总结见表一，大部分化合物的结构没有披露，但根据其专利信息，可以发现都是BMS-790052的结构类似物。表一、代表性NS5A抑制剂CompCompanyInvitroEC50(pM)Phase1b1aBMS-790052(daclatasvir)Bristol–MyersSquibb9503GS-5885Gilead4342ABT-267（结构未知，以专利中代表性化合物代替）US2012172368A1Abbott5142GSK2336805，WO2011091446A1GlaxoSmithKline8442ACH-2928（结构未知，以专利中代表性化合物代替）Achillion2–3461ACH-3102（结构未知，以专利中代表性化合物代替）US2012302538A1Achillion4101PPI-461（结构未知，以专利中代表性化合物代替）WO2010096777A1Presidio102101续表一、代表性NS5A抑制剂CompCompanyInvitroEC50(pM)Phase1b1aPPI-668（结构未知，以专利中代表性化合物代替）US2012115855A1Presidio101001IDX719（结构未知，以专利中代表性化合物代替）US2011150827A1Idenix381EDP-239（结构未知，以专利中代表性化合物代替）US2011217261A1Enanta/Novartis434PCMK-8742（结构未知，以专利中代表性化合物代替）US2012083483A1Merck34PC还有另外一些结构类型，仅挑选其中高活性代表化合物，见下表：表二、其它代表性NS5A抑制剂CompCompanyInvitroEC50(pM)注1b1aExample1002BOEHRINGERINGELHEIMINTERNATIONA15230Example44JANSSENR&DIRELAND5NT四、BMS-790052(daclatasvir)研究：4.1、BMS-790052部分活性数据：表三、代表性NS5A抑制剂BMS-790052活性数据项目数值项目数值HCVreplicon(pM)EC504.2±1.5HCVreplicon(pM)EC9020±7.5t1/2(min)(HLM)56.3Eliminationrateconstant(k)0.012Cytotoxicity,CC50(μM)PBM19Cytotoxicity,CC50(μM)Vero21Cytotoxicity,CC50(μM)CEM9.6CLint(μL/min/mgprotein)12.3CYP1A2(μM)IC50>100CYP1A2(μM)IC90>100CYP3A4(μM)IC507.2±1.7CYP3A4(μM)IC90>100CYP2D6(μM)IC50>100CYP2D6(μM)IC90>100CYP2C9(μM)IC5059.5±13.6CYP2C9(μM)IC90>100ResistanceMutationsL31V4.2、BMS-790052的结合位点：BMS-790052的结合位点还未见报道，但其类似物BMS-411的可能结合位点已被披露\o"Donald,2013#2068"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Donald</Author><Year>2013</Year><RecNum>2068</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">4</style></DisplayText><record><rec-number>2068</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrp2d0tf1xrte0ewdtppta2bd2909f2f9z0z">2068</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Donald,R.O'Boyle,II</author><author>Jin-Hua,Sun</author><author>Peter,T.Nower</author><author>Julie,A.Lemm</author><author>Robert,A.Fridell</author><author>Chunfu,Wang</author><author>Jeffrey,L.Romine</author><author>Makonen,Belema</author><author>Van,N.Nguyen</author><author>Denis,R.StLaurent</author><author>Michael,Serrano-Wu</author><author>Lawrence,B.Snyder</author><author>Nicholas,A.Meanwell</author><author>David,R.Langley</author><author>Min,Gao</author></authors></contributors><titles><title>CharacterizationsofHCVNS5Areplicationcomplexinhibitors</title><secondary-title>Virology</secondary-title></titles><periodical><full-title>Virology</full-title></periodical><dates><year>2013</year></dates><isbn>0042-6822</isbn><urls><related-urls><url>:///10.1016/j.virol.2013.06.032</url></related-urls><pdf-urls><url>E:\TLR7agonists\1-s2.0-S0042682213004029-main.pdf</url></pdf-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.virol.2013.06.032</electronic-resource-num><remote-database-name>READCUBE</remote-database-name></record></Cite></EndNote>4。BMS-411的结构如下图所示：结合方式通过QUANTA软件模拟，可见BMS-411活性状态为γ-扭曲形结构，横穿NS5A二聚体的接触面，其“盖子”区靠近Y93氨基酸，其核心区域平躺于氨基酸L31残基之下，氨基酸残基Q54靠近BMS-411的末端，并与α螺旋的氨基酸残基L28相接触。BMS-411与NS5A蛋白二聚体结合模式预测图，黄色棒球部分代表高耐药突变残基。4.3构效关系研究：我们将化合物分成四个部分讨论起构效关系：联苯的Linker/Core结构，这部分已经被密集的考察过；咪唑部分，研究很少；脯氨酸部分，仅有氟化和三元环化有报道；氨基酸与其“盖子”部分，这部分被密集考察过。4.3.1片段I的构效关系\o"Omar,2013#2037"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Omar</Author><Year>2013</Year><RecNum>2037</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">3c</style></DisplayText><record><rec-number>2037</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrp2d0tf1xrte0ewdtppta2bd2909f2f9z0z">2037</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Omar,D.Lopez</author><author>Van,N.Nguyen</author><author>Denis,R.StLaurent</author><author>Makonen,Belema</author><author>Michael,H.Serrano-Wu</author><author>Jason,T.Goodrich</author><author>Fukang,Yang</author><author>Yuping,Qiu</author><author>Amy,S.Ripka</author><author>Peter,T.Nower</author><author>Lourdes,Valera</author><author>Mengping,Liu</author><author>Donald,R.O’Boyle</author><author>Jin-Hua,Sun</author><author>Robert,A.Fridell</author><author>Julie,A.Lemm</author><author>Min,Gao</author><author>Andrew,C.Good</author><author>Nicholas,A.Meanwell</author><author>Lawrence,B.Snyder</author></authors></contributors><titles><title>HCVNS5Areplicationcomplexinhibitors.Part3:discoveryofpotentanalogswithdistinctcoretopologies</title><secondary-title>Bioorganic&MedicinalChemistryLetters</secondary-title></titles><periodical><full-title>Bioorganic&medicinalchemistryletters</full-title></periodical><volume>23</volume><dates><year>2013</year></dates><isbn>0960-894X</isbn><urls><related-urls><url>:///10.1016/j.bmcl.2012.11.086</url></related-urls><pdf-urls><url>E:\TLR7agonists\1-s2.0-S0960894X12015387-main.pdf</url></pdf-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.bmcl.2012.11.086</electronic-resource-num><remote-database-name>READCUBE</remote-database-name></record></Cite></EndNote>3c：片段I被相当密集的考察过，在通向BMS-790052的道路中，对此部分的考察是通过下面化合物1进行的：通过此部分考察发现此核心结构的平面性、指向、极性、长度都活性影响很大。首先，通过对烯烃电子生物等排体的考察，发现其所连苯环倾向于反式共平面结构，而换成饱和烷基链后活性降低67倍，醚链活性比烷基链进一步降低16倍，对此，进行构象分析，认为两边的苯环倾向于共平面或平行排列，而不是处于正交平面：然后，考察链的长短对活性的影响，发现将乙烯基置换成亚甲基，羰基，氧，都会使活性极大降低。而延长饱和烷基链的链长，活性降低程度中等。并且发现用杂芳环取代乙烯基活性也是中等程度降低，然而这赋予了化合物优化药代特性的能力。同时，杂芳环的引入也使得某些化合物具备了对GT1a的中等程度的抑制活性。有文献报道了BMS-790052联苯结构Linker/Core的构效关系\o"Shi,2012#2072"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Shi</Author><Year>2012</Year><RecNum>2072</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">5</style></DisplayText><record><rec-number>2072</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrp2d0tf1xrte0ewdtppta2bd2909f2f9z0z">2072</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Shi,Junxing</author><author>Zhou,Longhu</author><author>Amblard,Franck</author><author>Bobeck,Drew</author><author>Zhang,Hongwang</author><author>Liu,Peng</author><author>Bondada,Lavanya</author><author>McBrayer,Tamara</author><author>Tharnish,Phillip</author><author>Whitaker,Tony</author><author>Coats,Steven</author><author>Schinazi,Raymond</author></authors></contributors><auth-address>RFSPharma,LLC,1860MontrealRoad,Tucker,GA30084,USA.</auth-address><titles><title>SynthesisandbiologicalevaluationofnewpotentandselectiveHCVNS5Ainhibitors</title><secondary-title>Bioorganic&medicinalchemistryletters</secondary-title></titles><periodical><full-title>Bioorganic&medicinalchemistryletters</full-title></periodical><pages>3488-3491</pages><volume>22</volume><number>10</number><dates><year>2012</year></dates><isbn>0960-894X</isbn><urls><related-urls><url>:///10.1016/j.bmcl.2012.03.089</url></related-urls><pdf-urls><url>E:\TLR7agonists\1-s2.0-S0960894X12004106-main.pdf</url></pdf-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.bmcl.2012.03.089</electronic-resource-num><remote-database-name>READCUBE</remote-database-name></record></Cite></EndNote>5。结果显示，缩短此结构长度使活性极大降低，而增加长度至三个苯环活性基本保持，而毒性下降。引入杂环，改变联苯的角度，也对活性不理利。4.3.2片段II和片段III的构效关系\o"Zhang,2012#2039"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Zhang</Author><Year>2012</Year><RecNum>2039</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">6</style></DisplayText><record><rec-number>2039</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrp2d0tf1xrte0ewdtppta2bd2909f2f9z0z">2039</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Zhang,Hongwang</author><author>Zhou,Longhu</author><author>Amblard,Franck</author><author>Shi,Junxing</author><author>Bobeck,Drew</author><author>Tao,Sijia</author><author>McBrayer,Tamara</author><author>Tharnish,Phillip</author><author>Whitaker,Tony</author><author>Coats,Steven</author><author>Schinazi,Raymond</author></authors></contributors><auth-address>CenterforAIDSResearch,LaboratoryofBiochemicalPharmacology,DepartmentofPediatrics,EmoryUniversitySchoolofMedicine,Decatur,GA30033,USA.</auth-address><titles><title>SynthesisandevaluationofnovelpotentHCVNS5Ainhibitors</title><secondary-title>Bioorganic&medicinalchemistryletters</secondary-title></titles><periodical><full-title>Bioorganic&medicinalchemistryletters</full-title></periodical><pages>4864-4868</pages><volume>22</volume><number>14</number><dates><year>2012</year></dates><isbn>0960-894X</isbn><urls><related-urls><url>:///10.1016/j.bmcl.2012.05.039</url></related-urls><pdf-urls><url>E:\TLR7agonists\1-s2.0-S0960894X12006427-main.pdf</url></pdf-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.bmcl.2012.05.039</electronic-resource-num><remote-database-name>READCUBE</remote-database-name></record></Cite></EndNote>6：在片段II的咪唑4-位引入噻吩、呋喃或苯基导致活性下降，但引入小基团如氟、氯、溴等后，EC50基本不变，而EC90有中等程度提高。然而，卤素取代也使在淋巴细胞上的毒性提高。在片段III上的取代也表现出类似趋势，小体积的叠氮取代活性基本保持，并且（4-R）-叠氮取代在PBM、CEm和Vero细胞中没有表现出任何毒性（100μM），（4-S）-叠氮取代表现出毒性（略）。而大体积的1,4-三氮唑取代使活性降低。将两个位置最优取代结合，得到化合物活性都能保持，并且发现咪唑溴代的叠氮产物在Vero细胞上无毒性（100μM）。同时，在咪唑上的某些卤素取代也改善了化合物的药-药相互作用问题。4.3.3片段IV的构效关系ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA\o"Denis,2013#2041"3d,\o"Belema,2013#2036"e：在此处的改造主要为提高在GT1a上的抑制活性，对此部分的考察是通过下面化合物3进行的：首先发现，去除乙基，在GT1a上的活性降低，但两个化合物苯甲酰胺和苯胺环的二面角大小基本一样，说明原化合物的GT1a上活性的提高不是邻位取代引起的空间效应所致。然后发现将苯甲酸的苯环置换为吡啶环后，在GT1a和GT1b上的活性都得到提高。基于此，对一系列含氮杂环进行了筛选，发现异喹啉甲酰胺表现出与原来预测相一致的活性，即：其结构是有GT1b高活性的苯乙酸和有GT1a高活性的苯甲酸的融合，而确实兼具了两者的优势，如下图所示，鉴于此，对此类结构进行了详细考察，主要考察取代基的影响，发现取代基效应非常明显，兵器最终得到了双取代化合物30（结构略），不仅在GT1两个亚型上表现强的抑制活性，在G-2aJFH（EC50=2.2nM）、G-2aNIH（EC50=14nM）、G-3a（EC50=3.2nM）和G-5ahybrid（EC50=3.0nM）也表现出强的抑制活性。但是比较30与化合物1，发现其亚型选择性不同。而比较30与化合物3苯甲酰胺和苯胺环的构想，发现相差很大，推测，可能化合物3的构象与NS5AGT1b的生物构象较符合，而30则与NS5AGT1a的较符合。虽然化合物30的获得是一个里程碑式进步，但其类药性却存在问题，比如其sp3-碳原子的比例仅为22%，而上市药物一般为47%.所以，一步改造的改造策略选择了去环化，如下图所示：这个策略相当成功，得到了一个GT1a和GT1b活性都极大提高的化合物3g.2，并且有许多良好的性质，如耐突变、高选择性等。进一步考察中为避免烯烃顺反互变带来的影响，将烯烃置换为炔键，主要进行甘氨酸类多样性考察:发现此处化合物活性随着取代基碱性的减弱而降低，并得到活性进一步提高的化合物5g.1。五、创新药物设计综合相关文献专利，此类化合物的基本形状是γ-扭曲形结构，Linker/Core为柱状结构，两边为氨基酸，其γ-扭曲通过环实现，如下图所示：此类化合物的Linker/Core的芳环结构给我们留下很大改动余地。据此，我们初步设计以了第一阶段工作计划，先合成以下几种Linker/Core的化合物，之后再选择活性较好的结构进行进一步环以与氨基酸部分改造：并三环类:四元环类：其它类：参考文献：ADDINEN.REFLIST1. (a)Pawlotsky,J.-M.,TherapyofhepatitisC:fromempiricismtoeradication.Hepatology(Baltimore,Md.)2006,43(2Suppl1),20;(b)Scheel,T.;Rice,C.,UnderstandingthehepatitisCviruslifecyclepavesthewayforhighlyeffectivetherapies.Naturemedicine2013,19(7),837-849;(c)Manns,M.;vonHahn,T.,NoveltherapiesforhepatitisC-onepillfitsall?Naturereviews.Drugdiscovery2013;(d)Delang,L.;Neyts,J.;Vliegen,I.;Abrignani,S.;Neddermann,P.;DeFrancesco,R.,HepatitisCvirus-specificdirectlyactingantiviraldrugs.Currenttopicsinmicrobiologyandimmunology2013,369,289-320;(e)Qiuwei,P.;Luc,J.W.v.d.L.,NewtargetsfortreatmentagainstHCVinfection.BestPractice&ResearchClinicalGastroenterology2012,26;(f)Bühler,S.;Bartenschlager,R.,NewtargetsforantiviraltherapyofchronichepatitisC.Liverinternational:officialjournaloftheInternationalAssociationfortheStudyoftheLiver2012,32Suppl1,9-16;(g)Vermehren,J.;Sarrazin,C.,NewHCVtherapiesonthehorizon.Clinicalmicrobiologyandinfection:theofficialpublicationoftheEuropeanSocietyofClinicalMicrobiologyandInfectiousDiseases2011,17(2),122-134;(h)Sofia,M.,NucleotideprodrugsforHCVtherapy.AntiviralChem.Chemother2011;(i)Lange,C.;Sarrazin,C.;Zeuzem,S.,Reviewarticle:specificallytargetedanti-viraltherapyforhepatitisC-aneweraintherapy.Alimentarypharmacology&therapeutics2010,32(1),14-28.2. 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(a)Jeffrey,L.R.;Denis,R.S.L.;John,E.L.;Scott,W.M.;Michael,H.S.-W.;Fukang,Y.;Min,G.;Donald,R.O.B.;Julie,A.L.;Jin-Hua,S.;Peter,T.N.;Xiaohua,H.;Milind,S.D.;Nicholas,A.M.;Lawrence,B.S.,InhibitorsofHCVNS5A:FromIminothiazolidinonestoSymmetricalStilbenes.ACSMedicinalChemistryLetters2011,2;(b)Denis,R.S.L.;Makonen,B.;Min,G.;Jason,G.;Ramesh,K.;Jay,O.K.;Julie,A.L.;Mengping,L.;Omar,D.L.;Van,N.N.;Peter,T.N.;Donald,O.B.;Yuping,Q.;Jeffrey,L.R.;Michael,H.S.-W.;Jin-Hua,S.;Lourdes,V.;Fukang,Y.;Xuejie,Y.;Nicholas,A.M.;Lawrence,B.S.,HCVNS5Areplicationcomplexinhibitors.Part2:Investigationofstilbeneprolinamides.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters2012,22;(c)Omar,D.L.;Van,N.N.;Denis,R.S.L.;Makonen,B.;Michael,H.S.-W.;Jason,T.G.;Fukang,Y.;Yuping,Q.;Amy,S.R.;Peter,T.N.;Lourdes,V.;Mengping,L.;Donald,R.O.B.;Jin-Hua,S.;Robert,A.F.;Julie,A.L.;Min,G.;Andrew,C.G.;Nicholas,A.M.;Lawrence,B.S.,HCVNS5Areplicationcomplexinhibitors.Part3:discoveryofpotentanalogswithdistinctcoretopologies.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters2013,23;(d)Denis,R.S.L.;Michael,H.S.-W.;Makonen,B.;Min,D.;Hua,F.;Min,G.;Jason,T.G.;Rudolph,G.K.;Julie,A.L.;Mengping,L.;Omar,D.L.;Van,N.N.;Peter,T.N.;Donald,R.O.B.;Bradley,C.P.;Jeffrey,L.R.;Lourdes,V.;Jin-Hua,S.;Ying-Kai,W.;Fukang,Y.;Xuejie,Y.;Nicholas,A.M.;Lawrence,B.S.,HCVNS5AReplicationComplexInhibitors.Part4.(1)OptimizationforGenotype1aRepliconInhibitoryActivity.JournalofMedicinalChemistry2013;(e)Belema,M.;Nguyen,V.;StLaurent,D.;Lopez,O.;Qiu,Y.;Good,A.;Nower,P.;Valera,L.;O'Boyle,D.;Sun,J.-H.;Liu,M.;Fridell,R.;Lemm,J.;Gao,M.;Knipe,J.;Meanwell,N.;Snyder,L.,HCVNS5Areplicationcomplexinhibitors.Part5:Discoveryofpotentandpan-genotypicglycinamidecapderivatives.Bioorganic&medicinalchemistryletters2013,23(15),4428-4435.4. Donald,R.O.B.,II;Jin-Hua,S.;Peter,T.N.;Julie,A.L.;Robert,A.F.;Chunfu,W.;Jeffrey,L.R.;Makonen,B.;Van,N.N.;Denis,R.S.L.;Michael,S.-W.;Lawrence,B.S.;Nicholas,A.M.;David,R.L.;Min,G.,CharacterizationsofHCVNS5Areplicationcomplexinhibitors.Virology2013.5. Shi,J.;Zhou,L.;Amblard,F.;Bobeck,D.;Zhang,H.;Liu,P.;Bondada,L.;McBrayer,T.;Tharnish,P.;Whitaker,T.;Coats,S.;Schinazi,R.,SynthesisandbiologicalevaluationofnewpotentandselectiveHCVNS5Ainhibitors.Bioorganic&medicinalchemistryletters2012,22(10),3488-3491.6. Zhang,H.;Zhou,L.;Amblard,F.;Shi,J.;Bobeck,D.;Tao,S.;McBrayer,T.;Tharnish,P.;Whitaker,T.;Coats,S.;Schinazi,R.,SynthesisandevaluationofnovelpotentHCVNS5Ainhibitors.Bioorganic&medicinalchemistryletters2012,22(14),4864-4868.TLR-7激动剂研究与设计目前已开发的激动剂主要参考文献来自2008与2012年的两篇综述\o"Czarniecki,2008#397"ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA7。化合物分类依据其核心结构特点进行。咪唑喹啉胺（imidazoquinolineamine）类咪喹莫德（Imiquimod）在1980年代由3MPharmaceuticals公司前身RikerLaboratories作为抗菌剂开发，1997年被批准用作治疗局部乳头状瘤病毒感染。瑞喹莫德（Resiquimod）作为第二代药物研发，但2003年开发终止，原因是其缺乏足够的药效。它们的结构下图所示：咪喹莫德是TLR7的选择性激动剂，但有报道其有强烈催吐副作用\o"Witt,1993#743"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Witt</Author><Year>1993</Year><RecNum>743</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">8</style></DisplayText><record><rec-number>743</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrp2d0tf1xrte0ewdtppta2bd2909f2f9z0z">743</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Witt,P.</author><author>Ritch,P.</author><author>Reding,D.</author><author>McAuliffe,T.</author><author>Westrick…,L.</author></authors></contributors><titles><title>PhaseItrialofanoralimmunomodulatorandinterferoninducerincancerpatients</title><secondary-title>Cancerresearch</secondary-title></titles><periodical><full-title>Cancerresearch</full-title></periodical><dates><year>1993</year></dates><urls><related-urls><url>:///content/53/21/5176.short</url></related-urls></urls><remote-database-name>READCUBE</remote-database-name></record></Cite></EndNote>8。瑞喹莫德是TLR7/8的激动剂，作为HCV的治疗药物进入临床Ⅱa阶段。以0.01mg/kg给药，每周两次，连续四周，在此计量水平下化合物能被很好的耐受，但是没有表现出有意义的病毒载量和显著的系统性细胞因子和生物标记物水平的改变。随后对此类化合物进行了构效关系研究，得到了TLR8选择性激动剂，结构如下图所示：以与其它的TLR7/8激动剂，结构如下图所示：2007年3M将绝大部分的TLR激动剂产权打包出售给ColeyPharmaceuticalGroup，此公司随后被Pfizer收购。随着Pfizer将重点集中于Coley的寡核苷酸（oligonucleotides）类疫苗佐剂的研究，咪唑喹啉胺类小分子激动剂的研究在下面化合物披露后受到限制。\o"Nakamura,2013#484"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Nakamura</Author><Year>2013</Year><RecNum>484</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">9</style></DisplayText><record><rec-number>484</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrp2d0tf1xrte0ewdtppta2bd2909f2f9z0z">484</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Nakamura,Tomoaki</author><author>Wada,Hiroki</author><author>Kurebayashi,Hirotaka</author><author>McInally,Tom</author><author>Bonnert,Roger</author><author>Isobe,Yoshiaki</author></authors></contributors><auth-address>ChemistryResearchLaboratories,DainipponSumitomoPharma.Co.,Ltd,3-1-98Kasagade-naka,Osaka-city,Osaka554-0022,Japan.</auth-address><titles><title>Synthesisandevaluationof8-oxoadeninederivativesaspotentToll-likereceptor7agonistswithhighwatersolubility</title><secondary-title>Bioorganic&medicinalchemistryletters</secondary-title></titles><periodical><full-title>Bioorganic&medicinalchemistryletters</full-title></periodical><pages>669-672</pages><volume>23</volume><number>3</number><dates><year>2013</year></dates><isbn>0960-894X</isbn><urls><related-urls><url>:///10.1016/j.bmcl.2012.11.114</url></related-urls><pdf-urls><url>E:\TLR7agonists\1-s2.0-S0960894X12015661-main.pdf</url></pdf-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.bmcl.2012.11.114</electronic-resource-num><remote-database-name>READCUBE</remote-database-name></record></Cite></EndNote>9此化合物被Coley公司研发用作抗肿瘤，是TLR7的强效激动剂。在Pfizer收购后，重新作为治疗HCV药物进行研发，并进入Ⅰ期健康人体上的原理验证阶段（proof-of-mechanism）。此化合物能够计量依赖和给药频率依赖的诱导免疫生物标记物和IFN反应。但是在最大剂量（9mg）时，两个受试者出现严重副反应，表现为似流感症状、低血压、淋巴球减少等现象，这导致进一步的临床实验终止。目前，相关专利中对此类化合物的涵盖围如下：在专利US2011245289A1\o"AG,#547"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>AG</Author><RecNum>547</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">10</style></DisplayText><record><rec-number>547</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrp2d0tf1xrte0ewdtppta2bd2909f2f9z0z">547</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>4SCAG</author></authors></contributors><titles><title>US2011245289A1.pdf</title><secondary-title>NOVELSUBSTITUTEDIMIDAZOQUINOLINES</secondary-title></titles><periodical><full-title>NOVELSUBSTITUTEDIMIDAZOQUINOLINES</full-title></periodical><dates></dates><urls><pdf-urls><url>E:\专利\US2011245289A1.pdf</url></pdf-urls></urls><remote-database-name>READCUBE</remote-database-name></record></Cite></EndNote>10中，4SCAG.公司披露了以下骨架：此系列化合物是TLR7选择性激动剂，用作肿瘤的治疗。一般化合物结构见下图：1-取代吡唑啉酮（1-SubstitutedPyrazolo(3,4-C)Ring）类在专利US2009163533A1\o"INC,#529"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>INC</Author><RecNum>529</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">11</style></DisplayText><record><rec-number>529</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrp2d0tf1xrte0ewdtppta2bd2909f2f9z0z">529</ke