生物分离工程全册配套完整课件

生物分离工程全册配套完整精品课件生物分离工程

（BioseparationEngineering)课程主要参考书目

生物分离工程（第二版）孙彦编著

BioseparationProcessScienceAntonioA.Garcíaetal编著成绩构成平时成绩：30分

课堂测验、作业、出勤情况期末考试：闭卷考试，70分32学时绪论2学时细胞分离与破碎2学时初级分离2学时膜分离技术6学时生物产品萃取技术8学时色层分离技术10学时蛋白质复性2学时沉淀与结晶2学时第一章绪论

重要性生物分离过程特点一般步骤工业生物分离过程

典型的生物分离过程过程的选择依据生物分离过程的重要性生物分离工程的概念生物分离工程:从粗原料中获得合乎使用要求的目标产物的过程，包括目标产物的提取、浓缩、分离纯化及成品化等。多学科的交叉

多种分离技术的集成

生物工程科学研究的（Engineering)合乎使用最新成果要求的产品(Science)(Product)

UpstreamTechnology

DownstreamProcessingGeneticEngineeringBioreactionEngineeringBioseparationEngineering生物分离技术的重要性

在基础研究领域，生物分离技术的发展在某种程度上决定人类对生命、对自然的认知程度；在工业生物技术领域，决定了生物产业的成本和经济效益。

生物工程的基本过程生产生产生物分离过程决定了生物产业的经济效益回收纯化过程成本占总生产成本的比例：

大多数酶：70％医用酶如天门冬酰胺酶：85％基因工程表达产物：85％一90％以上青霉素：50％乙醇：14％传统产品小分子（少数工业用粗酶）理化性质清楚易于放大基因产品大分子胞内不稳定放大困难

生物分离过程的特点目标产物含量低

待分离物组成复杂稳定性差，容易失活对最终产品的质量要求严格

发酵液中：青霉素4.2%

庆大霉素0.2%

动物细胞培养液：目标物含量5~50g/mlBack细胞组成（占干重百分比）类型蛋白质%核酸%多糖%类脂物%细菌40-7013-342-1010-15酵母40-504-10小于151-6丝状真菌10-151-3小于102-9藻类10-601-5小于154-80动物细胞小于10小于50小于50小于50植物细胞小于70小于30小于50小于80Back

产物失活的主要机制是化学降解或微生物引起的降解。影响因素包括：

pH温度浓度蛋白水解酶等要求：分离条件温和，并采用快速的分离纯化方法除去影响目标产物稳定性的杂质。Back

目前对医药、生物制剂的要求：无菌、无热源，对于蛋白类药物，一般要求杂蛋白含量2%。例如：对医用青霉素，噻唑蛋白类的含量必须要1.510-6；原亲酶素和重组胰岛素，杂蛋白含量应0.01%。对有些产品还要求呈稳定的无色晶体

高效生物分离技术缺乏目标产物的回收率低分离的成本高生物分离过程中存在的主要问题生物分离的一般步骤

破碎、萃取沉淀、吸附层析、色谱超滤、冷冻干燥离心、过滤萃取、超滤电泳喷雾干燥、结晶粗提初分离精分离成品化目标产物回收率的计算每步的回收率：Yi=mi2/mi1mi2—

第i步分离后得到产品的总量，mi1—

第i步分离前产品的总量总回收率：

分离原则提高每步操作的回收率减少操作步骤

对分离技术及设备进行系统研究，努力开发新型高效的分离纯化方法是实现降低目标产物的成本、提高经济效益的必由之路。例如：对人干扰素的分离

总回收率：16%离子交换（62.7%)硫酸盐盐析(96.2%)铜亲合层析(46.0%)疏水层析（78.3%)凝胶电泳(88.9%)

仅三步产品的回收率就达到81%，且产品的纯化程度与上述纯化过程相当。

分离路径的选择非常重要！！硫酸盐盐析免疫亲合层析阳离子交换层析如何进行分离方法的选择？方法：1寻找差异

物理性质：重力，分子大小，溶解度化学性质：分子的亲疏水特性及其所带电荷性质的差异生物学性质：生物分子间的特异性识别作用

性质上最大的差异将导致最有效的分离2

对于生物活性物质，必须考虑分离方法对其生物活性的影响生物分离产品的类型：小分子类：MW

<1000，大多数中药有效成分（生物碱类、萜类、酮类、皂苷类、内酯类等），脂类、抗生素、有机酸、氨基酸等；大分子类：MW>1000，酶、抗体、重组蛋白、核酸等.生物分离的理论基础利用分子间相互作用力的差异实现分离利用生物分子的化学和生物学性质的差异沉淀、萃取、吸附、色谱等利用分子间物性上的差异实现分离如分子量、沉降系数、挥发度等膜过滤、凝胶筛分、电泳、离心、蒸馏等生物分离方法及分离机理

单元操作 分离机理 分离对象举例膜分离微滤压力差、拆分菌体、细胞超滤压力差、筛分蛋白质、多糖、抗生素反渗透压力差、筛分水、盐、糖、氨基酸透析浓度差、筛分尿素、盐、蛋白质电渗析电荷、筛分氨基酸、有机酸、盐、水渗透汽化汽液相平衡乙醇萃取有机溶剂萃取液液相平衡有机酸、抗生素双水相萃取液液相平衡液液相平衡蛋白质、抗生素液膜萃取液液相平衡氨基酸、有机酸、抗生素反胶团萃取相平衡液液相平衡氨基酸、抗生素超临界流体萃取相平衡 香料、脂质层析凝胶过滤层析浓度差、筛分脱盐、分子分级反相层析分配平衡甾醇类、维生素、脂质、肽离子交换层析电荷、浓度差（pH、蛋白质、氨基酸、抗生素、离子强度）核酸、有机酸亲和层析生物亲和作用蛋白质、核酸疏水相互作用疏水作用蛋白质 层析聚焦电荷、浓度差（pH）蛋白质电泳凝胶电泳筛分、电荷蛋白质、核酸等电点电泳筛分、电荷、浓度差蛋白质、氨基酸等速电泳筛分、电荷、浓度差蛋白质、氨基酸区带电泳筛分、电荷、浓度差蛋白质、核酸离心离心过滤离心力、筛分菌体、菌体碎片离心沉降离心力菌体、细胞、血球超离心离心力 蛋白质、核酸、糖类了解分离产物的物性对分离过程的设计是必需的

溶解度：受pH、盐等影响，将指导沉淀过程或萃取过程分子电荷：将指导如何有效地进行离子交换等分子大小：指导凝胶过滤和膜过滤疏水性：指导沉淀过程和疏水分离功能团：功能团为稳定条件、提取剂及亲和吸附剂的选择提供依据稳定性：适宜的pH值范围、温度范围、半衰期挥发性：是小分子物质选择分离过程的依据生物物质常用的分离方法1．氨基酸：两性电解质，具有等电点，溶解度受溶液pH影响显著的特点。常采用的分离纯化方法结晶离子交换2．蛋白质和多肽：特点：两性电解质，具有带电性、疏水性和生物亲和性，分子量差异较大。常用的分析方法：离心沉淀膜分离萃取：双水相萃取、反胶团萃取层析电泳等

3、糖类：单糖、低聚糖、多糖分离纯化方法以吸附层析为主4、脂质：

脂肪酸、不饱和脂肪酸、卵磷脂等。分离纯化方法：有机溶剂萃取

超临界流体萃取层析等方法5．抗生素：分离纯化主要采用：

有机溶剂萃取离子交换结晶吸附层折6．其他

天然植物及中药中的药用成分。分离纯化：

萃取：溶剂萃取和超临界萃取吸附层析等工业生物分离过程选择的依据

对于生物产品，消费者更看重的是产品的价格、质量和实用性。所以，工业生物分离过程选择的标准应该是以获得高质量、低价格的产品为目标。影响产品成本的除了分离步骤和效率外，还有一个重要的因素就是产品的浓度。

根据热力学第二定律，混合过程熵增大，是自发过程。所以，两种互溶的物质相互混合时，不需要外界能量。但是，要使混合的物质得到分离，必须补充使熵减小所需的能量。在恒温条件下使混合物中的各组分提纯为纯粹的物质所需的最小功与吉布斯自由能变化相等，即在稀溶液中：即得到单位质量物质所需的能耗与成正比。所以，原料中目标产物浓度越低，所需能耗越高，分离回收的成本越大。采取的方法：1）增加产品在发酵液或细胞内的浓度；2）将浓缩过程尽可能地放在分离的最初阶段。

分离效率的评价评价一个分离过程对目标产物的分离效率主要有下面三个标准：浓缩率m（concentrationfactor)：

表征以浓缩为目的的分离过程的最重要指标分离因子（separationfactororpurificationfactor)

表征目标产物的分离纯化程度的重要指标回收率R

(recovery

factor)FCFP

原料产品

CTC，CXCCTP，CXP

FWCTW，CXW

废料其中，F表示流速，C表示浓度，下标T和X分别表示目标产物和杂质，C、P和W分别表示原料、产品和废料。浓缩率mT=CTP/CTCmX=CXP/CXC如果mT=mX

，则目标产物未得到分离纯化分离器分离因子=分离因子越大，分离效率越高回收率RR=100%

=100%工业生物分离过程举例1单克隆抗体的生产（monoclonalantibodies)用途：临床治疗、检测及实验研究生产规模：1m3/day，小规模批量生产，属于高附加值产品，反应器的体积一般为35L左右。类型：IgG：分子量160,000Da，能够分泌到胞外；

IgM：分子量是IgG的5倍，存在于细胞膜表面。生产的方式：杂交瘤细胞生产的融合蛋白（血清培养）.

IgGproductCellsSupernatant

IgGeluted

Unboundmaterial

单克隆抗体的回收和纯化（JohnWiley等，1995）BioreactorfluidwithcellContinuouscentrifugation100,000MWmembraneAffinitychromatographSterilefiltrationFormulationMembraneconcentration2.人胰岛素（humaninsulin)生产方式：基因工程E.coli；以包含体的形式存在于胞内；细胞培养产生的是胰岛素前体，需进一步进行化学转化为胰岛素含量：小于1g/L（相当低）；用途：临床注射用，要求的纯度相当高；3.狂犬病疫苗（Rabiesvaccine)

病毒性疫苗的生产一般是在动物体内、单层培养或悬浮培养，在病毒溶解细胞后在将其收集。生产方式：使用猿猴细胞作为微载体悬浮培养，反应体积上百立升。动物细胞被固定在珠状的微载体上。病毒（0.3m)首先感染细胞并在其内复制。其后被收集分离。

ProductProductB-chainCelldebrisA-chainSupernatantCyanogen人胰岛素的回收和纯化Bromide（SanDiego等，1998）BioreactorfluidwithcellsPrecipitationChromatography阴离子、体积排阻CelldisruptionCentrifugalextractionDialysisCleaningproinsulinPrecipitationpH=5.0Chromatography弱阴、反向HPLCExtractionSulfonationDialysis狂犬疫苗的下游分离过程

（JohnWiley等,1994)

CellsPermeateConcentratedvirus

-Propiolactone

丙酸内脂4C37CHSANonantigenicmaterialProductBioreactorfluidwithcellsMembraneUFmembrane10-100kDaVirusinactivationHydrolysis(24hr)Zonal(蔗糖）Centrifugation除菌青霉素（penicillin)：用青霉菌生产，主要提取步骤为萃取。蛋白酶（protease)用途：洗涤剂，所以对纯度要求不高目的：高浓度、高产率，而非高纯度L-赖氨酸（L-lysine)

可用于动物和人使用，不同用途，不同的纯化方式。主要分离方式为吸附。柠檬酸（citricacid)

由Aspergillusniger（曲霉）生产，酸性菌，在低pH值下生长。主要分离方式为萃取（用煤油和叔氨）。青霉素的分离及纯化（Macmillan,1983)

Product

CaClandPolyelectrolyteT=5CSpentsolventFiltrateSpentIsopropanolAmylacetatesolventorbutanol乙酸戊酯

ExtractSpentsolventAcetoneandwaterandCarbonandsodiumorImpuritiespotassiumacetateBioreactorfluidwithcellsFiltrationExtractionspH2-3ActivatedcarbontreatmentFiltrationDryingFiltrationWashingFiltrationPrecipitation

蛋白酶的分离纯化

（ShulerML等,1992)SolidProduct

Coolto4-5CFilteraid

LiquidProductCellsPrecoatBioreactorfluidpretreatmentFiltrationorcentrifugationTwo-stageultrafiltrationUltrafiltrationSterileultrafiltrationPolishingultrafiltrationFormulationFormulationDryingRotaryfilterPrecipitationLiquidsorsolids赖氨酸的回收和分离（MarcelDekker,1996)

柠檬酸的下游分离（BanidAM等，1981）小结在工业生物分离纯化中作为设计者应关注的关键问题：高收率，降低总成本（也要考虑环境成本）；高的可靠性和重复性：保证产品质量的稳定。

应遵循的分离原则提高每步操作的回收率减少操作步骤将减小体积，增加目标物的浓度放在分离之初首先分离最易除去的物质在分离过程中尽早采用具有高分辨率的分离步骤将最困难的分离留在整个工艺过程的最后分离条件应保证产物的稳定性和活性缩短分离时间以减小产物分解，提高活性思考题在工业上，欲分离纯化某种胞内蛋白，请谈谈你对其分离纯化路径的设计思路以及在分离过程中应注意的问题。为什么在成品化的前一步要进行产品的浓缩?请阐述各项生物分离原则的理论依据。作业查找资料，提交一份生物产品分离纯化的具体工艺。包含体的复性贾凌云基因工程产品目前的研发状况

目前基因表达的重组蛋白质已超过4000多种,其中用E.coli表达的要占90%以上,而这些蛋白质在E.coli中绝大多数是以包含体形式存在；用于临床的基因重组药物只占研发药物的约1%。存在的主要问题复性效率低：常用的复性方法—稀释和透析法的复性效率为5-20%；与杂蛋白分离困难，产品成本高。包含体

包含体是指外源基因在宿主细胞中表达时，表达的蛋白质不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1-3.0μm的固体颗粒-包含体。这些基因表达产物的一级结构(即氨基酸序列)虽然正确，但其立体结构是错误的。由于包含体具有很高的密度(约1.3mg/mL)它们在细胞裂解后可通过低速离心收获。包含体形成的原因1.蛋白质高效表达的结果在载体系统中采用强的启动子和增强子序列,靶蛋白质表达分别可占细胞总蛋白的40%～50%，蛋白质的合成速度太快，肽链来不及折叠形成正确构象，导致分子间疏水基相互作用聚合而不溶。2.宿主内缺乏目标蛋白质正确折叠的辅助因子

对于大肠杆菌,来源于真核细胞的蛋白质是一种外界刺激因子,在进化过程中细菌细胞还没有形成与之完全相适应的结构基础和折叠机制,例如,处于还原环境的细菌胞质不能有效地完成二硫键蛋白质的氧化折叠;又如,辅助肽链折叠的分子伴侣和折叠酶的种类和功能不能完全适应较复杂真核蛋白质的折叠。如何使包含体复性？1，先用化学试剂将包含体溶解成为伸展的蛋白质一级结构；常用变性剂尿素、盐酸胍以及去污剂SDS等，可分别破坏蛋白质的高级结构及肽链之间的疏水作用，使其变成松散的水溶状态。2，使蛋白质的一级结构在合适的条件下重新折叠成正确的构象。UI1I2···IZ

ICINNAC

A聚集：是由暴露在溶剂中的疏水区相互作用的过程，速度快，一般在30秒内完成。复性：分子链内自我折叠的过程，相对缓慢，完全复性大约需10分钟的时间。蛋白质的重折叠机制

溶菌酶处理→高压匀浆破碎→低速离心

包含体沉淀需用去污剂(TritonX-100或脱氧胆酸钠)和低浓度变性剂(如2mol/L尿素或盐酸胍等)洗涤以除去脂类和膜蛋白。通过以上制备可获得高纯度的包含体(纯度高于70%)。实现蛋白质重折叠的途径1.用膜透析法或凝胶过滤去除变性剂，也可用稀释的方法，一般1-20mol/ml的低浓度条件下，重组蛋白的复性效果较好。对小分子的多肽，复性效率较高，对大分子蛋白和二硫键较多的分子，复性很困难。2.加入分子伴侣人工分子伴侣体系(去污剂＋环糊精)环糊精与直链糊精辅助蛋白质复性分子伴侣：就是在细胞内催化及维持其他蛋白质正确构象的一类蛋白质，它参与细胞内许多蛋白质的折叠、聚合及跨膜运输，通过瞬时稳定其他蛋白质折叠中间体，阻止了蛋白质中间体聚集，帮助其形成正确的构象。环糊精的分子结构

其复性过程分为两步进行：第一步为捕获阶段，在变性蛋白质溶液中加入去污剂，去污剂分子通过疏水相互作用与蛋白质的疏水位点结合形成复合体，抑制肽链间的相互聚集；第二步剥离阶段，加入环糊精，由于环糊精分子对去污剂分子有竞争性吸附作用，去污剂分子被剥离下来，从而使多肽链在此过程中正确折叠为活性蛋白质。

环糊精的疏水性空腔能够结合变性蛋白质多肽链的疏水性位点，可以抑制其相互聚集失活，从而促进肽链正确折叠为活性蛋白质。直链糊精基本上能够模拟环糊精在辅助蛋白质复性方面的作用，而且具有这样一些优点：直链糊精的螺旋结构形成一个疏水性空管，可以结合更多的蛋白质分子；在水中溶解度较高，有利于提高复性酶浓度和实验操作；价格比环糊精便宜，实际应用前景较好。直链糊精存在的问题：

分子伴侣在实际应用中尚存在费用高并需要与复性蛋白质分离等缺点，目前，分子伴侣还处于研究阶段，没有真正用于工业规模的包含体复性。蛋白质的色谱复性及其纯化

液相色谱是纯化蛋白质的一个必不可少的手段。其原理是根据待分离物质与色谱固定相之间作用力的不同而得到分离。利用色谱复性正是利用了变性的蛋白质在色谱固定相上的吸附作用而避免了分子间的聚集作用，在吸附-脱附-吸附的过程中实现了蛋白质的复性。色谱法进行蛋白质复性的优点是:①在进样后可很快除去变性剂;②由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显地减少甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集,从而避免了沉淀的产生,提高蛋白质复性的质量和活性回收率;③在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白分离以达到纯化的目的,使复性和纯化同时进行;④便于回收变性剂,以降低废水处理成本。

目前用于蛋白质复性分离的色谱方法：体积排阻色谱离子交换色谱亲合色谱疏水色谱排阻色谱（SEC）复性机理:

在变性蛋白进入柱顶端时,因有高浓度变性剂的存在,变性蛋白质分子有一个随机的构象状态和大的动力学水合半径,不能进入柱的空隙,蛋白质在柱上不保留。当使用复性的缓冲溶液洗脱时,因其逐步取代变性剂并使变性剂浓度降低,使变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高能状态,这些蛋白质分子就会自发地向热力学稳定的低能态—

即蛋白质的天然状态转化,从而使蛋白质开始复性。此时，局部复性的蛋白质可以进入球

的内部,开始在液固两相间进行分配,随着时间的推移,当蛋白质分子的结构变得更加紧密时,蛋白质在两相中的分配系数会逐步增加。当蛋白质进入柱填料的孔隙后,其扩散速度减缓,从而限制了蛋白质的聚集,这样就减少了沉淀的产生。蛋白质分子大,先从柱子上洗脱下来,变性剂分子质量小,最后流出色谱柱。故SEC的主要作用不是变性蛋白质与SEC固定相间的特殊作用力,而是有利于更换变性蛋白质复性的缓冲溶液,这里当然更不涉及二硫键是否正确对接的问题。与稀释法比较,该方法可使溶菌酶、碳酸酐酶和重组白细胞介素等的蛋白质质量回收率和活性回收率显著提高。

离子交换色谱复性机理：不同于SEC之处在于变性蛋白质与固定相间有分子间的电荷作用,这种作用力可导致变性的蛋白吸附于固定相表面,在洗脱过程中进行吸附—解吸—再吸附的复性。

Hamaker将DEAE纤维素卷成柱状装入色谱柱中,使用等浓度洗脱,对重组白细胞分泌抑制因子进行了复性纯化,用该法复性的蛋白质浓度比稀释方法提高了6.4倍,且46%的蛋白质可以获得复性,质量回收率为96%,时间只用了5min.亲合色谱（AFC）复性机理：利用配体与目标蛋白质间的特异性亲和作用,使变性蛋白分子保留在柱的顶端使其与变性剂分离,而后在洗脱过程中进行复性的。按配基类型可分为:

固定化金属亲和色谱脂质体亲和色谱分子伴侣亲和色谱脂质体作为配基对蛋白质复性的原理推测为:

局部变性的蛋白质分子结构类似于融球状态,且具有与天然蛋白质相类似的二级结构,此时蛋白质分子仍然具有强的疏水表面,故可同脂质体的脂质双层作用以帮助蛋白质进行复性。例如：用脂质体色谱对失活的碳酸酐脱氢酶进行复性,其活性回收率为83%,如果使用没有脂质体的柱子,则回收率便降至58%;如果直接采用稀释50倍的方法,其活性回收率为52%。

分子伴侣亲和色谱介导蛋白质的复性同它在溶液中的作用一致。即分子伴侣在复性蛋白质时,为变性的蛋白提供一个中空环状疏水腔,当变性蛋白质进入空腔后,可部分避免或完全消除变性蛋白质分子间的相互聚集作用,使蛋白质在疏水环境下进行“结合-释放-再结合”的循环过程,直到其恢复到天然的构象状态。目前英国剑桥大学的一个研究小组在这一领域中做得最好。他们合成了几个复杂的固定相体系用于蛋白质复性,使这些在溶液中无法复性的蛋白质在柱子上得到了好的复性,并称之为折叠色谱(Refoldingchromatography)疏水色谱（HIC）复性机理:

当蛋白质、变性剂和杂蛋白质进入HIC系统后,由于HIC固定相对变性剂的作用力较弱,而对变性蛋白质的作用力较强,变性剂首先同变性的蛋白质分离,并随流动相一同流出色谱柱。又因HIC固定相能提供较通常方法高出数十乃至数百倍的能量,在变性蛋白质被HIC固定相吸附的同时瞬时除去以水合状态附着在蛋白质表面和与固定相表面接触区域的水分子,而蛋白质的特定的疏水性氨基酸残基与HIC固定相表面作用以形成区域立体结构(Micro-domain),接着形成折叠中间体(Intermediate),随着流动相的不断变化,变性蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再吸附,并在此过程中逐渐被复性,形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质并流出色谱柱。在此过程中,因不同的蛋白质与固定,形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质并流出色谱柱。在此过程中,因不同的蛋白质与固定相上的作用力强弱不同,复性的目标蛋白质就可以与大部分杂蛋白进行分离。利用HIC对E.coli表达的rhIFN和rhIFNα分别在复性的同时进行了纯化。rhIFN的GuHCl提取液在40min内使用一次色谱过程就可以使其纯度达到85%,活性回收率为稀释法的2-3倍.影响色谱复性的因素色谱固定相流动相的组成变性蛋白质的浓度蛋白质在柱上的停留时间流动相的流速、pH、温度疏水柱的复性分离效果色层分离技术色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱分离或层析分离。惯用法按固定相的基质（载体）类型分类：层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操作。色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高压下使用。也有人将层析称为色谱。用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使用要求的产品。色层分离原理当两相作相对移动时，利用溶质在互不相溶的两相中吸附或分配的差异，引起移动速度的不同而进行分离的方法。分类流动相与固定相：流动相：可为气相、液相、超临界流体等固定相：固体、液体和以固体为载体的液体薄层固定相的形状：纸层析薄层层析柱层析操作压力低压：﹤0.5MPa

中压：0.5-4.0MPa

高压：4.0-40MPa，用于分析目的分离操作模式

洗脱展开：最常用前沿（迎头）分析顶替展开用于大量制备分配机理

根据溶质和固定相间的作用机理凝胶过滤离子交换反相色谱疏水层析亲和色谱常规的色层分离色层分离过程包含两部分：固定相：载体或载体+功能基团流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很大区别。上样洗脱上样冲洗洗脱高压液相色谱分离操作过程层析分离操作过程液相色谱的基本原理和参数保留时间(tR)和保留体积(VR)

从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用tR表示。在这段时间内冲洗剂（流动相）流过的体积为保留体积，用VR表示。

色谱流出曲线及参数容量因子k

和平衡常数K

某物质的k定义为在分配平衡时该物质在两相中绝对量之比。而平衡常数K为平衡时，物质在两相的浓度比：

Vs和Vm分别为柱内固定相和流动相所占的体积。于是有

溶质在固定相停留的时间分数=

溶质在流动相停留的时间分数

在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移动速度()总是小于流动相的移动速度()，而等于流动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时间分数之积：而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反比：

当柱外死体积可忽略不计时，

选择性()和相对保留值()==柱效率：

塔板高度（H）和塔板数（N）是衡量色谱柱效率的两个重要指标。

塔板高度（H）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流动相之间达到分配平衡，这段柱长就相当于一个理论塔板的高度(HETP或H)。

理论塔板数的计算公式为：式中为标准偏差。理论塔板高度为：式中，柱长。塔板高度小，塔板数高，色谱分离效率高。影响柱效的因素1）理论塔板高度（）随填料粒度减少而减少；2）在一定范围内流速减小有利于提高柱效；3）减少冲洗剂粘度或提高柱温有利于减小；4）分子量较小的样品分子较小。

凝胶过滤层析（体积排阻色谱）Gelfiltrationchromatography,GFCSizeexclusionchromatograpy，SEC

是一种纯粹按照溶质分子在溶液中的体积大小进行分离的层析技术。应用：主要用于蛋白质等生物大分子的分级分离和除盐。一般用作原料液的初分离，获取几个不同分子量物质分级，供进一步分离纯化使用。分离原理：

含有不同分子大小的样品进入色谱柱（层析柱）后，较大的分子不能通过孔道扩散进入填料颗粒（凝胶珠体）内部，而与流动相一起先流出色谱柱（层析柱）。较小的分子可通过部分孔道、更小的分子可通过任意孔道扩散进入颗粒（珠体）内部。这种颗粒内部扩散的结果，使小分子沿柱流动的速度减慢，使混合样品中不同的分子按分子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分离的目的。凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关。（2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；（3）具有一定的孔径分布范围；（4）机械强度高，允许较高的操作压力。常用的分离介质天然及高分子介质经常使用的是葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、琼脂糖与葡聚糖接枝而成的复合凝胶（Superdex）以及聚丙烯酰胺类和聚乙烯醇类合成凝胶（TSKgel）。（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）

⑴SephadexG交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200每克干胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。

⑵SephadexLH-20，是─SephadexG-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。

（二）琼脂糖凝胶：

商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。（三）聚丙烯酰胺凝胶：

是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P（Bio-GelP），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。（四）聚苯乙烯凝胶

商品为Styrogel，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40,000,000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。凝胶过滤的特点是：填料多为带有羟基、但不带电荷的惰性材料，亲水性能好，又不与待分离物质发生作用，因此分离条件温和，蛋白质回收率高，重现性好；工作范围广，分离分子量的覆盖面大，可分离几百到数百万分子量；设备简单、易于操作，周期短。填料再生性好，可连续使用数百次到上千次。功能脱盐：分离大小两类不同的分子即无机盐与生物大分子；分级：将分子大小相近的物质分开，通常为大分子间的分离。缺点：

凝胶强度低，可耐受的压力通常低于0.2个大气压，故流速低，通常的线速度小于20cm/h。因此，处理速度较慢。但Superdex的最大耐受压力可达15个大气压，流速也提高近10倍。无机填料：

表面改性后的硅胶，主要是用有机物或聚合物对硅胶颗粒进行处理，增加其亲水性并消除或抑制体积排阻以外的其他效应。优点：

可耐受较高的压力，最高压力可达上百个大气压。具有较高的柱效率和分离度。缺点：

pH的适用范围窄。以硅胶为基质的填料，pH范围在2.0-7.0，如果超过了这个范围，将会使有机层的溶解速率加快，减少柱子寿命。凝胶特性参数（1）排阻极限（exclusionlimit):

凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。不同的凝胶过滤介质品牌具有不同的排阻极限。SephadexG50的排阻极限是30kD。（2）分级范围（fractionationrange):

即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。SephadexG-50的分级范围为1.5~30kD.（3）溶胀率：

某些市售的干燥凝胶颗粒（如SephadexG系列），使用前要用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分率称为溶胀率，即

SephadexG50的溶胀率为500%30%。（4）凝胶粒径：一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。

软凝胶粒径较大，一般为50~150m，硬凝胶粒径较小，一般为5~50m。Sepharose和Sephadex凝胶粒径分布为45~165m，而Superose和TSKToyopearlHW系列可小到20~40m，甚至6~10m。（5）床体积（bedvolume）即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。SephadexG50的床体积为9~11cm3/g干胶。（6）空隙体积（voidvolume)

指层析柱中凝胶之间空隙的体积，即V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。一般使用相对分子质量为2000kD的水溶性兰色葡聚糖。影响分离特性的因素1、填料

分离度和蛋白质的分离范围以及最小分子量之比是选择填料要考虑的首要问题。目前TSK系列凝胶柱被认为是最好的蛋白质分离柱，其特点是分离度高和吸附性小。2、柱长

体积排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比，因此应根据分离的要求确定柱长，一般柱长60-120厘米对于蛋白质的分离比较理想，而长30厘米的柱子多用于快速分离。3、洗脱液洗脱液的pH值和离子强度都将影响到分离效果。以硅胶为基质的填料，pH范围在2.0-7.5,如果超出这个范围，将会使键合相的有机层溶解。当离子强度很低时，TSK系列凝胶柱上的硅醇基会与待分离的蛋白发生离子反应，一般通过加入0.3-0.5mol/L的NaCl来抑制。蛋白质和柱填料的疏水作用一般通过加入5-10%的乙醇或异丙醇来控制。3、流速

是影响蛋白质分离的重要因素。一般流速低分离效果好。如流速在小于0.1ml/min时，蛋白质的分离度好；在0.5-1.0ml/min时，对于7.5mm直径的柱子，分离效率较高。4、样品容量

进样体积和样品浓度将明显影响到蛋白质的分离度，高浓度、小体积对分离有利。合适的蛋白质样品浓度范围一般在0.01-0.5%，样品体积是柱体积的1-3%。凝胶筛分的应用1、分离纯化

GFC可用于相对分子量从几百到百万的物质的分离纯化，是蛋白质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸以及病毒（50-400nm）的分离与分析中频繁使用的液相层析法。2、脱盐盐析沉淀中得到的高盐浓度的蛋白质溶液用凝胶法脱盐后，可用于其它层析过程。也可用于缓冲液的置换。3、相对分子量的测定

通过分子量与分配系数的线性关系进行测量，对球形分子较准确。分配系数与相对分子量间的关系：

m=a-blgMr4、用于包含体的复性实验技术（一）层析柱

层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:1─10:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1，层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。（二）凝胶的选择

根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如SephadexG-20的吸水量为20，1克SephadexG─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的SephadexG-200效果好，脱盐用SephadexG-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。

（三）凝胶的制备

商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大加速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。

（四）样品溶液的处理

样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过SephadexG-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30％。分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。

（五）防止微生物的污染

交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有:叠氨钠（NaN3）：在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20℃时约为40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02％。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。

⑶乙基汞代巯基水杨酸钠：在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0.01％。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。（4）苯基汞代盐在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01％。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。

GFC分离的优点：（1）由于溶质不与介质发生作用，可采用恒定洗脱法洗脱，操作条件温和。回收率可达100%；（2）使用后，不需要进行柱子的清洗和再生，利于循环使用；（3）作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切率小，蛋白活性回收率高；（4）分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。缺点（1）选择性低，料液处理量小；（2）洗脱展开后产品被稀释，因此还需要具有浓缩作用的单元操作。超临界萃取

（SupercriticalFluidExtraction)超临界流体(SCF):所谓超临界流体是指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体.特点：具有和液体同样的凝聚力、溶解力,而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍。超临界流体萃取

利用溶质在液相（固相）与超临界流体相中分配系数（溶解度）的不同实现分离的萃取过程。或者表述为利用超临界流体为萃取剂的萃取操作称为超临界流体萃取。特点：

超临界流体萃取具有很高的萃取速度，另外该流体随着温度与压力的连续变化，对于某些高沸点和热敏性物质的萃取具有选择性，而且萃取后分离也很容易。

萃取对象：脂肪酸、植物碱、醚类、酮类、甘油酯等在超临界流体中具有特殊溶解作用的物质，即可萃取固体，又可萃取液体。超临界流体萃取的基本原理1超临界流体的特性2CO2相图3超临界CO2流体的基本性质（1）超临界流体条件下物质的溶解度

CO2流体对不同类别物质的溶解度有不同的规律。

极性较低的碳氢化合物和类脂有机化合物，如酯、醚、内酯类、环氧化合物等可在7~10MPa较低压力范围内被萃取出来；引入极性基团（如-OH，-COOH），造成萃取困难。对于苯的衍生物，具有三个酚羟基或一个羧基和两个羟基的化合物仍然可以被萃取，但具有一个羧基和三个以上羟基的化合物是不可能被萃取的；更强的极性物质，如糖类、氨基酸类，在40MPa压力以下不可能被萃取出来。影响待分离物质在CO2超临界流体中溶解度的主要因素：（1）压力的影响增加压力将提高CO2流体的密度，因而具有增强其溶解能力的效应，并以在CO2临界点附近其效果最为明显。超临界流体中精油组分溶解度等温线（2）温度的影响在温度对溶解度的影响曲线中，都在800C左右出现最低点，其原因如下：随着温度的升高，CO2的流体密度下降，导致

CO2流体的溶剂化效应下降，使物质在其中的溶解度下降；另外，随着温度的升高，物质的蒸汽压增大，使物质在CO2流体中的溶解度增大。这两种作用的结果导致溶解度出现最低点。（2）超临界流体的传递特性

超临界流体的密度和液体相近，粘度和气体相近，自扩散系数比液体大100倍左右。这些性质决定了超临界流体萃取比常规的液体萃取的压降要低，完成传质、达到平衡要快，分离效果要好。

（3）超临界流体的选择性提高溶剂选择性的基本原则是：第一，操作温度和超临界流体的临界温度接近；第二，超临界流体的化学性质和待分离溶质的化学性质接近。若两条原则基本符合，效果就较理想，若符合程度降低，效果就会递减。

5夹带剂

单一组分的超临界溶剂有以下缺点:(1)某些物质在纯超临界气体中溶解度很低，如超临界CO2

只能有效地萃取亲脂性物质，对糖、氨基酸等极性物质，在合理的温度与压力下几乎不能萃取；(2)选择性不高，导致分离效果不好；(3)溶质溶解度对温度、压力的变化不够敏感，使溶质从超临界气体中分离出来时耗费的能量增加。

针对上述问题，在纯气体溶剂中加入与被萃取物亲和力强的组分，以提高其对被萃取组分的选择性和溶解度，这类物质称为夹带剂。

夹带剂的类型：非极性夹带剂极性夹带剂

夹带剂可以从两个方面影响溶质在超临界气体中的溶解度和选择性。一是溶剂的密度；二是溶质与夹带剂分子间的相互作用。

决定因素是夹带剂与溶质分子间的范德华作用力或夹带剂与溶质之间特定的分子间作用，如形成氢键及其它各种化学作用力等。

极性夹带剂可明显增加极性溶质的溶解度，但对非极性溶质作用不大；相反非极性夹带剂如果分子量与溶质相近，对极性和非极性溶质都有增加溶解度的效能。常用的夹带剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈等。加夹带剂丙烷后，萘在CO2中溶解度

超临界流体萃取过程

超临界流体萃取过程基本上是由萃取阶段与分离阶段所组成超临界CO2萃取中各操作参数的影响1、压力的影响萃取的物质最适的操作压力（MPa）碳氢化合物和低分子量的7-10

酯类等弱极性物质含较少-OH，-CO