硕士课程-中药指纹图谱

中药指纹图谱

－质量评价、质量控制与新药研发章弘扬化学与分子工程学院分析教研组内容中药指纹图谱基础理论中药指纹图谱获取方法学研究中药指纹图谱特征性研究中药指纹图谱新方法中药指纹图谱信息处理应用：药材、方剂、二次开发与组效学中药质量智能控制体系（一）中药指纹图谱基础理论中药的特点中药具有与西药不同的物质基础和理论体系

西药单一化合物

中药有效化合物群

药材配伍中药是一个多成分群配伍协同作用的复杂体系。中药标准应以我为主，自主创新，推动与国际双向接轨；现行药典标准需要与时俱进，进一步提高。传统中药质控模式面临的挑战

传统的质控模式是控制一个或几个成分，不能全面表达有效化合物群的整体特征，因此有时甚至会存在确立的质量控制指标和临床疗效间的不一致的问题例如人参根和人参叶:皂苷Re+Rg1的量:

人参叶>人参根临床疗效:

人参根>人参叶个别成分不能代表整个药材或者复方药物的质量和疗效中药质量控制的核心是要对有效成分群的整体控制指纹图谱（fingerprint）技术DNA指纹图谱银杏叶制剂-指纹图谱（德国）德国应用指纹图谱制定了标准，体现了制剂所含的多个化学成分和各自的含量。经化学和药效相关性研究，发现约24%银杏黄酮和约6%银杏内酯组成的提取物具有最佳疗效。基于此，通过规范种植、严格质控，可使最终产品质量稳定，指纹图谱重现性良好，含量浮动范围为5%左右。使中药从单一成分控制过渡到与中医理论相符的整体控制成为可能。作为中药整体化学信息的一种表达方式，为从整体上研究中药组分与疗效的相关性（组效学）提供了技术手段一次完成对处方中多信息的控制，可减少对多项单一指标分别控制方法的人力物力消耗，降低对分离制备大量中药对照品的依赖。指纹图谱分析技术平台，得到的信息量大，应用价值高,可推广性强。将指纹图谱纳入中药研究体系的必要性中药指纹图谱的定义中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光（波）谱图。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂、半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。指纹图谱－新的中药质控模式多指标成分定量有效化合物群

中药现代质量标准体系中药整体特征具体特征中药指纹图谱+“有效部分”多维分析技术药理药效研究信息处理中药指纹图谱研究技术模式质量评价新药研发质量控制图谱获取方法验证应用中药功能指纹图谱

特征提取A.中药指纹图谱的分类薄层色谱（TLC）指纹图谱高效液相色谱（HPLC）指纹图谱气相色谱（GC）指纹图谱高速逆流色谱（HSCCC）指纹图谱X射线衍射指纹图谱核磁共振（NMR）指纹图谱质谱（MS）指纹图谱红外光谱（IR）指纹图谱紫外光谱（UV）指纹图谱毛细管电泳（CE）指纹图谱多维指纹图谱（LC/DAD/MS/MS、LC/NMR…）B.

中药指纹图谱的研究内容中药指纹图谱获取方法学研究指纹图谱鉴别方法学研究中药药效组分筛选及检测方法学研究中药指纹图谱组效学研究1.中药材、中药制剂化学指纹图谱建立方法研究2.中药材、中药制剂指纹图谱鉴别计算方法3.中药药效组分筛选研究4.中药组效学研究方法中药指纹图谱技术－多学科融合（二）中药指纹图谱获取方法学研究中药指纹图谱获取方法样本采集和样本制备

采集－代表性和均一性：确定品种、药用部位、产地、采收期、炮制方法

制备－整体性和专属性：分步、系统提取指纹图谱获取方法

色谱分离优化－时间（<60min）与整体分离度指纹图谱方法学验证

专属性、准确性、精密度、线性范围、灵敏度、稳定性、耐受性1.中药各类组分分步、系统提取常规提取法：水蒸气蒸馏法水提法水提醇沉法有机溶剂提取法分馏法吸附法…特殊制备方法：超临界萃取膜分离分子蒸馏微波萃取…2.一般未知体系色谱方法选择与优化方法优化原则：时间<60min整体分散（梯度洗脱）整体检测（波长）LSC－液固色谱；NP-BPC－正相键合相色谱；RP-BPC－反相键合相色谱；GPC－凝胶渗透色谱；GFC－凝胶过滤色谱；IPC－离子对色谱；IC－离子色谱举例：HPLC举例：痛必定注射剂指纹图谱梯度优化预实验优化后举例：痛必定注射剂指纹图谱波长选择原则：峰数量基线灵敏度波长（nm）出峰数基线28018基线平，波动不大25414基线平，波动不大23015基线波动较大3.指纹图谱分析方法验证实例柱温

30℃下分离较好不同仪器不同厂家的仪器在泵流量精度、梯度混合方式、检测灵敏度、死体积大小等不同，从而导致色谱分离情况有异

1：25℃；2：30℃；3：35℃）1：DIONEX；2：Aglient

3.指纹图谱分析方法验证实例色谱柱不同厂家的同类型色谱柱（C18硅胶键合相）有一定差异固定使用同一品牌不同批号的相同规格色谱柱对于样品的分离影响较小

应固定厂家同一型号的色谱柱

不同厂家同一类型色谱柱同一类型不同批号色谱柱3.指纹图谱分析方法验证实例流动相

不同厂家的合格市售试剂对指纹图谱影响不大

微小改变TEA添加剂的浓度，色谱分离变化不大，但是基线会有一定程度偏移

应添加适中的添加剂不同厂家流动相试剂添加不同浓度TEA3.指纹图谱分析方法验证实例专属性考察

三点峰纯度紫外数据比较（5%峰高处和峰极大值处；>0.80）

3.指纹图谱分析方法验证实例精密度连续5次进样，相对保留时间和相对峰面积具有一致性重复性同一供试品5份样品测定，结果相似度在0.99以上稳定性考察了0，2，4，8，12，16，24小时的样品稳定情况，相对保留时间和峰面积偏差小于5%10批痛必定样品指纹图谱（三）中药指纹图谱特征性研究中药指纹图谱特征性复杂系统分析方法学研究中药具有复杂系统的特点中药的复杂系统观、中药复杂系统的分析策略中药指纹图谱中成分指认多种检测器（质谱、NMR）信息组合分析指纹图谱特征信息提取与验证指纹图谱特征信息归属与全方相关性研究非线性多样性层次性涌现性开放性还原论——整体论单成分——多组分目标化合物——

目标化合物群1.复杂系统分析方法论整体性特征性复杂系统的特征方法论要求中药属于复杂系统中药的复杂系统观：整体论、关系论中药复杂系统分析策略：有效部分分析（HPLC）、全局性分析（LC-MS、LC-NMR-MS）、特征性分析（DNA分析－植物遗传特异性）2.中药指纹图谱中全成分指认举例—两种质谱信息组合分析高准确性：测定误差<5ppm高分辨率：13,000以上动态范围宽：3个数量级多级碎片分析：一般>3级高灵敏度：通常<1ppb提供分子组成信息提供碎片结构信息加速结构确证AgilentTOF-MSAgilentTrap-MSn结合两种质谱的优势－TOF精准质量测定和Trap多级碎片分析，构建一种LC/MS组合分析的策略研究对象：复方清开灵注射液全方由上述八味药材或提取物，经配伍而成清开灵注射液，由古方安宫牛黄丸拆方改制而成。是国家中药保护品种，具有保护肝脏、促进损伤肝细胞的修复、清热解毒、镇静安神等作用。A0.1%甲酸/水；B乙腈梯度洗脱

(a)正模式；(b)负模式清开灵全方HPLC-UV和LC/TOF-MSTIC图未知成分筛查和鉴定的分析流程AgilentLC/TOF-MS优化分离和全扫描分析，获得精确质量测定数据对未知峰进行分子式匹配，尤其注意查看特征“同位素分布”利用分子式信息，在Scifinder等数据库中查找可能的化学名称AgilentLC/Trap-MSn多级碎片分析，确定分子离子和碎片离子对未知物进行符合“双重标准”的鉴定：分子组成和碎裂方式采用可获得的标样进行确证举例：26号峰（黄芩苷）C15H9O5C21H17O11TOF-MS筛查Trap-MSn鉴定“－C6H8O6”清开灵全方TOF-MS筛查结果（部分）共筛查出33种可能成分，包含多对不同种类的异构体，需后续的Trap-MSn结合标样进行确证清开灵全方Trap-MSn鉴定结果（部分）结合标样，对TOF-MS筛查出的33种成分，进行了鉴定和确证。其中，三种绿原酸异构体采用MS3进行了区分三种绿原酸异构体的区分[M-H]–C16H18O9新绿原酸绿原酸异绿原酸碎裂机理推测三种异构体空间位置的差异，尤其是羟基位置的不同，决定了它们在三级碎裂中丢失水分子的数目！各成分归属ZhangHY,HuP,LuoGA,etal.Analytica

Chimica

Acta,2006,577:190-2003.指纹图谱特征信息提取与验证特征波长的选取特征指纹峰的选择（代表指纹图谱的整体特征）在代表整体的情况下，特征信息可突出差异，加强鉴别（四）中药指纹图谱新方法1.多波长指纹图谱（栀子药材）1、栀子酸；2、异栀子苷；3、京尼平龙胆二糖苷；4、栀子苷；5、绿原酸；6、藏红花素1；7、藏红花素2；8、藏红花素3；9、藏红花酸融合2.多维多息指纹图谱方法学验证：专属性、准确性、精密度、线性范围、灵敏度、稳定性和耐受性研究思路中药“有效部分”理论中药整体性和特征性多指标成分同时定量药材-中间品-成品生产工艺控制获取方法HPLC/DADHPLC/MS/MSHPLC/DAD/ELSDHPLC/MS/NMR3.指纹图谱与多指标成分定量结合（人参药材指纹图谱）Rb1Rg1Re4.全二维液相色谱技术（清开灵注射液）电平控制器－控制切换和数据记录清开灵注射液全二维色谱分离3D图MaS,ChenLX,LuoGA,etal.J.Chromatogr.A,20065.中药生产过程智能化控制系统（五）中药指纹图谱信息处理1.2D指纹图谱融合技术（清开灵）1.尿苷2.腺苷3.绿原酸4.咖啡酸5.栀子苷6.黄芩苷RetentionTime/min2.特征指纹图谱对药材快速鉴定人参图谱西洋参图谱原始图谱聚类特征图谱聚类峰匹配数据归一化处理特征提取（变化大）特征图谱建立3.中药指纹图谱相似度计算评价强度波动影响峰缺失影响夹角余弦法最佳4.中药色谱指纹图谱相似度评价系统中药色谱指纹图谱相似度评价系统(VisionAandVisionB)由8家单位合作开发，由国家药典委员会颁布中药指纹图谱工作站中药指纹图谱工作站不仅可以用于相似度评价，而且可以用于中药指纹图谱分类、识别、鉴定（六）应用：药材、方剂、二次开发与组效学HPLCfingerprintofrawmaterialofSalviamiltiorrhiza中药材指纹图谱:丹参（已列入香港中药材标准）1:丹参素;2:原儿茶酸;3:原儿茶醛;4:咖啡酸;5:丹酚酸

F;6:丹酚酸D;7:丹酚酸

I/J;8:丹酚酸

E;9:lithospermicacid;10:迷迭香酸;11:丹酚酸

B;12:丹酚酸

EIso.;13:丹酚酸

A;14:二氢丹参酮I;15:四氢丹参酮I;16:隐丹参酮;

17:丹参酮

I;18:丹参酮

IIA（红色标记为定量的指标成分）人参属药材及制剂的来源鉴别人参LC/MS(n)鉴定44种成分西洋参LC/MS(n)鉴定38种成分基于指纹图谱的主成分分析法（PCA）区分人参和西洋参

(识别率100%)人参西洋参将最终产品（中药制剂），如西洋参制剂中搀杂1％的人参替代品测定出来，非常灵敏LC/MS/MS多组分定量鉴别人参和西洋参制剂中的原料掺杂R1Rg1ReF11RfRg2Rb1RcRb2Rb3RdRdRg3黄芩栀子胆酸金银花板蓝根水牛角珍珠母整合中药复方多途径多靶点的治疗理念印证对物质基础研究提供研究思路清开灵全方及单味药的指纹图谱，以及各有效部分配伍，各药对有效部分配伍样品的指纹图谱化学物质指纹谱库功能指纹图谱库化学物质指纹性与药效结合复方整体特征的阐释方剂配伍指纹谱库清开灵注射液指纹图谱研究的整体思路清开灵注射液指纹图谱研究1234567891011121314源于黄芩苷源于黄芩苷响应微弱金银花、栀子、板蓝根、水解液响应区本指纹图谱着重表达金银花、栀子、板蓝根、水解液的特征信息；黄芩苷、胆酸、猪去氧胆酸以提取物入药可定量控制药材－药材阴性－成品指纹图谱相关性研究

与谱峰归属谱峰编号1234567891011121314151617181920板蓝根√√√√√√√金银花√√√√√√√√√栀子√√√√√水解液√√√黄芩苷混合胆酸清开灵注射液指纹图谱物质基础研究胆汁酸类成分（来自胆酸）氨基酸类成分（来自水牛角、珍珠母和板蓝根）黄酮类成分：黄芩苷、汉黄芩素等有机酸类成分：绿原酸、异绿原酸、奎尼酸以及栀子酸和藏红花酸等；核苷类成分（主要来自板蓝根）环烯醚萜苷类成分（主要来自栀子）色素类成分：藏红花素等挥发性成分：芳樟醇、棕榈酸和蒎烯等。无机元素：Mg、Si、K、Ti、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、Sr等，Ca包括无机游离和有机螯合两种状态。（鉴定了九类四十多种有机成分及十余种无机元素）指纹图谱在清开灵注射液质量控制中的应用基于指纹图谱的质量评价方法指纹图谱相似度方法 相似度数值（相对参照图谱）表达了产品整体质量状态 批次间相似度RSD大小表达了批次间工艺和质量的稳定性模式识别方法（聚类分析，主成分分析等）

与参照图谱空间距离大小反应了整体质量状态

空间分布的离散程度表达了批次间工艺和质量的稳定性控制工艺后，各厂样品相似度明显上升，说明产品质量得到提高，其中D厂提高最为明显指纹图谱相似度评价ABCDEFGH生产厂家相似度系数D厂前后指纹图谱对比质控前质控后稳定性差板蓝根有效成分响应低总峰响应低，损失严重各厂10批样品相似度RSD综合评定产品批间质量的稳定性（质控后指纹图谱）D厂相似度较高0.895，RSD最低1%，批间稳定性最好C厂相似度最低0.805，RSD最高5.52%主成分分析方法表征各厂产品质量

C厂偏离参照图谱最远（相似度相对低），样品点分布最离散（批间稳定性相对差）对照指纹图谱C厂D厂指纹图谱在清开灵注射液工艺控制中的应用提取液、混配液中间品指纹图谱各工艺点样品指纹图谱指纹图谱结合其他质控技术展开全过程工艺控制提取液、混配液中间品指纹图谱设置7个中间品指纹图谱，结合成品指纹图谱用于控制清开灵的主要生产工艺过程金银花提取液黄芩提取液（黄芩苷）混合液3混合液4混合液5成品板蓝根提取液胆酸混合液水解液混合液1混合液2牛胆酸猪胆酸栀子提取液栀子提取液参照图谱金银花提取液参照图谱板蓝根提取液参照图谱水解液参照图谱四混液参照图谱六混液参照图谱八混液参照图谱成品参照图谱指纹图谱结合其他质控技术展开全过程工艺控制指纹图谱（金银花、板蓝根、栀子、水解液）总固体量（原料药材转移率）总氮量（主要控制水牛角）灼烧残渣（主要控制珍珠母中无机成分）pH值UV吸光度含量测定（胆酸、黄芩苷）清开灵多波长多指标成分定量指纹图谱254nm—核苷330nm—有机酸280nm—黄芩苷240nm—环烯醚萜苷240nm254nm280nm330nmELSD1234567891.尿苷2.腺苷3.绿原酸4.咖啡酸

5.栀子苷6.黄芩苷7.熊去氧胆酸

8.胆酸9.猪去氧胆酸多波长HPLC法测定清开灵注射液中9种指标成分通过指标成分RSD变化评价各厂产品质量（以三个厂家为例）尿苷

uridine腺苷

adenosine绿原酸chlorogenicacid咖啡酸caffeicacid栀子苷geniposide黄芩苷baicalin熊去氧胆酸ursodeoxycholicacid胆酸cholicacid猪去氧胆酸hyodeoxycholic

aicdRSD最大，质量不稳定来源于纯度较高的提取物，质量较其他成分容易控制清开灵注射液质量控制体系小结8味原药材均有多个指标成分定量，结合药材指纹图谱整体控制。同时还进行农药残留和重金属的测定。注射液所含主要成分黄芩苷的含量有上下限限制。建立了清开灵注射液指纹图谱对质量进行整体控制。对注射液生产工艺全过程建立以指纹图谱为核心结合指标成分定量及其它指标的企业内部标准。对于具有潜在副作用的成分如绿原酸、靛蓝、靛玉红有限量控制。对于杂蛋白采用总氮量测定及毛细管电泳分析进行严格控制。清开灵注射液原药材质控指标清开灵注射液成品质控指标清开灵注射液（全方）指纹图谱中药复方清开灵二次开发(已鉴定了九类四十多种有机成分及十余种无机元素)[胆汁酸类、黄酮类、氨基酸、环烯醚萜苷类等9类][牛黄、黄芩、栀子、金银花、板兰根、珍珠母、水牛角

][指纹图谱，已鉴定成分40多种][牛黄、黄芩、栀子、珍珠母][胆酸、去氧胆酸、黄芩苷、栀子苷组、珍珠母水解氨基酸][单一成分

]药材有效组分群有效成分群药材组分成分有效化学成分（群）筛选优