受体与细胞功能调控-2015第三次

Chapter5

G-proteincoupledsevenTMS(transmembranoussegment)receptor

（GPCR）

andpost-receptorsignaltransduction（G蛋白的分类：SubtypesofG(%ofhomology)Eachtypeofreceptorhasitsownselectivity1.FundamentalstructureofG-protein

Heterotrimer:(39~52KDa)、(35~36)、(6~10)

FunctionofG：Couplingtoreceptor,signaltransduction

FunctionaldomainsofG：NC1.N-terminal:couplingto,2.C-terminal:couplingtoreceptor,Rec3.Conservativearea(G1–G5):GTPbindingandGTPase4.Effectordomain:couplingtoeffectorenzymesG1G2G3G4G5EffEff555.Others:CTx,PTx,MyristoylationMyristoylationCTxPTx,Receptor-Gprotein2.FunctionofG

IntercellularsignalIntracellularsignal

LinkedtoACorPLC

Gs：AC(adenylatecyclase)

Gi(Go)：AC(adenylatecyclase)

Gq(G11):PLC(phospholipaseC)

G12:PLC(notfullyclarified)PLCAboutG12:KuroseH.Lifescience74(2003):155-61GG蛋白（主要起信号转导）αγ异源三聚体,α亚基与GTP结合、GTP水解酶活性，它决定着G蛋白的个性，G蛋白亚型有10种以上。

γ亚基则由各种G蛋白所共用，α亚基激活，α亚基固定在细胞质膜上，提高了α亚基的局部浓度，有利于G蛋白与受体结合。

低分子量（小）G蛋白，分子量2万左右的单一多肽，分解GTP的活性

。包括癌基因ras的产物，15种蛋白质属于这种G蛋白类，作用多样性。Nativecellmembrane/G-proteins,usingSitedirectedantibodiestoblockG-proteinactivationCholeratoxin(CTx)toinhibitcertainGiAntisenseoligonucleotidestoblocknormalG-proteinsysnthesis3.ReceptoragonistdependentG-proteinactivation

agonistReceptorEffectorSilence:GbindtoGDP,dissociationofG-proteinandreceptor①②③④⑤⑥3.ReceptoragonistdependentG-proteinactivation

agonistReceptorEffector①

Agonistbindstoreceptor,leadingconformationalchangeofreceptorandassociationofG-proteinandreceptor①②③④⑤⑥3.ReceptoragonistdependentG-proteinactivation

agonistReceptorEffector②

GDPdissociation，formationofatransient“empty”G①②③④⑤⑥3.ReceptoragonistdependentG-proteinactivation

agonistReceptorEffector③

BindingofGTPtoG①②③④⑤⑥3.ReceptoragonistdependentG-proteinactivation

agonistReceptorEffector④

ConformationalchangeofGTP-

to

GTP-*,dissociationofG-proteinfromreceptor,followedbydissociationofagonist①②③④⑤⑥3.ReceptoragonistdependentG-proteinactivation

agonistReceptorEffector⑤Dissociationof*complextoGTP-*and，leadingtosignaltransductiontoeffector.①②③④⑤⑥3.ReceptoragonistdependentG-proteinactivation

agonistReceptorEffectorReceptorandG-proteinreturntooriginalsilentstate①②③④⑤⑥4.EndogenousGTPasede-activateG-proteinagonistReceptorEffector

⑥Gisitselfanenzyme,(GTPase):

GTP-*+H2OGDP-+PiGDP-+GDP-

ReceptorandG-proteinreturntooriginalsilentstateDissociationofGTP-*isirreversibleratherslow,rateconstantbeing0.05～5min-1,thereforehasamplificationeffect5.Functionofdimer

(notextensivelystudied)1）PromotethecouplingofGandreceptor2）InhibitthedissociationofGDPandGduringsilencetoreducethebasalsignal

3）LocalizationofG-protein,promotetheexchangeofGDPandGTP,promotetheagoniststimulatedphosphorylationofreceptor4）Maybedirectlyinvolvedinsignaltransduction

ActivatePLA2K+

channelActivatePLCIP3pathwayInvolvedinregulatingcertainsubtypesofAC受体特点：激活G蛋白（一种与三磷酸鸟苷结合的膜蛋白质）、细胞内产生第二信使改变其他酶活性七跨膜型受体G蛋白特点：介导的信号转导反应是一种慢速的过程，经历时间长，但是敏感性高，灵活性大。第二信使：cAMP、Ca++、IP3(肌醇1,4,5-三磷酸)、

DAG（二酯酰甘油）等。

cAMPpathwayPhosphatidylinositolpathwayGs、Gi、G12GqAdenylatecyclase(AC)PhospholipaseC(PLC)ProteinkinaseA(PKA)Hydrolysisof4,5-diphospho-IntracellularcAMPphosphatidylinositol(PIP2)ProteinphosphorylationIP3（Ca2+）+DAGBiologicaleffectBiologicaleffect

twopathwaysSignaltransductionviaG-protein与G蛋白相互作用的效应蛋白Gs:激活腺苷酸环化酶,提高cAMP含量GiorGo:抑制腺苷酸环化酶,降低cAMP含量Gt:视网膜杆状细胞中视紫红质接受光,激活cGMPGq:激活磷脂酶C,产生IP3+DAG离子通道、PLA2（水解产生花生四烯酸，该酸是前列腺素、白三烯、血栓恶烷的前体，神经突触前的介质）、转运蛋白（葡萄糖转运蛋白、镁转运蛋白、Na/H+交换蛋白）SecondMessenger

(Sutherland,1972NobelPrize)1.AshouldbeabletoyieldsimilarbiologicaleffectasHinrespectivecells.

2.HshouldbeabletoraisetheAcontentinrespectivecells.

3.Hshouldbeableto

effecttheactivityofenzymesforthesynthesisorbreakdownofA.4.Thetimerelationshouldbe:ChangeofHcontentearlierthanchangeofAcontent,andchangeofAcontentearlierthanchangeofbiologicaleffect.5.DrugseffectingAcontentcanmimicorsuppresstheeffectofH.Whatis2ndmessenger?IfhormoneHisthe1stmessenger,anintracellularmoleculeAis2ndmessenger,Ashouldsufficethefollowingrequirement:第二信使：受体被激活，细胞内产生介导信号转导通路的活性物质。1.CyclicAMPpathwayofG-proteinsignaltransduction

1.

FormationanddegradationofcyclicAMP(cAMP)：

Adenylcyclase,AC：

ATPcAMP

Twostate:ACaandACi,regulatedbyGsandGi

Phophodiesterase,PDE：irreversiblehydrolysisofcAMP

HalflifeofcAMPisveryshort,onlyafewmin2.ActivateProteinkinaseA,PKA

2catalyticand2regulatoryunitscAMPcausesdissociationofcatalyticandregulatoryunitCatalyticunitbeingactivatedDissociationandassociationarereversible,dependsoncAMPconcentration,hencetheactivityofPKAdependsoncAMPconcentration

3.ActionofcAMP:

PKA(inactive)PKA(active)ProteinphosphorylationPKA:IandIItypesRsubtypedifferencecAMP刺激：浓度、应答不同取决于PKA底物、信号转导通路差异。cAMP停止细胞增殖：纤维母细胞、造血细胞促进细胞增殖：上皮和内皮细胞系统ResultofactivationofPKA:

phosphorylationofvariousproteins

-AdrenoceptorPKAPhosphorylationofCa2+channel,Glycogensynthetase,Phosphorylasekinase,TroponinIContractionforce,tension,beatrateofheartincreasedNothighlyspecific,whichonepredominantdependsonthespecificcell

Maybeonestep,maybeviacascadeSometimes,thephysiologicalresultistheharmonious

complexofphosphorylationofseveraltargetproteinThetargetproteinmaybeactivatedorinhibitedbyphosphorylation.-AdrenoceptorPKAPhosphorylationofCa2+channel,Glycogensynthetase,Phosphorylasekinase,TroponinIContractionforce,tension,beatrateofheartincreased

Activation

ActionofPKA:phosphorylationofproteins

DeactivationMetabolicenzymeActivationDeactivationPhosphataseCRETATACREBBasalComplex(cAMPresponseelement)

(CREbinding

protein)PKAPGeneExpression生理功能参与细胞周期的调控细胞DNA复制的控制组蛋白H1与真核基因表达的调节控制基因转录的调节蛋白合成因子及核糖体蛋白的调控蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。蛋白质磷酸化和去磷酸化常伴随蛋白质生理活性的变化，是一个动态平衡过程。蛋白质可逆磷酸化的调节在信号转导过程中有重要作用，是细胞生命活动的调控中心。

细胞内每时每刻进行着多种多样的生物化学反应，生物体能迅速对体内的环境和外界刺激产生正确的应答，这些过程都有复杂的调控机制，其中大多数是直接或间接由蛋白质的变构作用介导的。蛋白质本身的构象变化是通过变构效应和各种修饰来实现的，蛋白质磷酸化是最常见、最重要的共价修饰方式。G-蛋白的研究和含量测定的方法

InhibitoryAgonistStimulatoryAgonistRRGTPGTPGiGs

–+

GDPACGDPATPcAMP受体与G-蛋白偶联的测定试剂：-[35S]-GTPS、GDP、GTPS方法：

NSB:细胞膜+35S-GTPS+GTPSBasal:细胞膜+35S-GTPS+GDPReaction:

细胞膜+35S-GTPS+agonist

测量:

分离结合部分测cpm

计算：

cpmagonist-cpmNSB

cpmbasal

-cpmNSBWhatarethe2fundamentalcharacteristicsofG-proteincoupledreceptors?Thereare4importantdomainsofG-proteincoupledreceptors,whatisthemainfunctionofeachdomain?CanyoudescribebrieflyaboutthepresentlyacceptedcommonstructureofagonistbindingsiteofG-proteincoupledreceptors?DescribebrieflythebasicstructureofG-protein.DescribebrieflytheprocessofligandactivationofG-protein.WhydoestheactivatedG-proteinrapidlydeactivated?Howcanwemeasurethecouplingactivityandcouplingactivityby35S?Whatisthedifferencebetweencouplingactivityandcouplingefficiency?

cAMPpathwayPhosphatidylinositolpathwayGs、Gi、G12GqAdenylatecyclase(AC)PhospholipaseC(PLC)ProteinkinaseA(PKA)Hydrolysisof4,5-diphospho-IntracellularcAMPphosphatidylinositol(PIP2)ProteinphosphorylationIP3（Ca2+）+DAGBiologicaleffectBiologicaleffect

twopathwaysSection5.SignaltransductionviaG-proteinSection7.SignaltransductionviaG-protein

ThePhosphoinositolpathway1.G-蛋白信息传递中磷脂肌醇通路的

两个主要第二信使

PI-4KPLCDAGPIPI(4,5)P2IP3ATPADP1.PLC即磷脂酶C(PhospholipaseC),有、、三类，与G蛋白偶联的是PLC.某些受体被配基激动后通过Gq使之激活，将PI(4,5)P2

水解成IP3及DAG2.IP3及DAG是该通路最主要的两个第二信使，IP3主要通过调制细胞内Ca2+

的浓度调节细胞功能，DAG主要通过激活PKC调节细胞功能细胞膜三种磷脂酰肌醇的结构磷脂酰肌醇的水解PLC对三者都有水解作用，Ca2+浓度低时对PIP2的活力特别强

2.IP3和细胞内Ca2+IP3

对细胞内Ca2+

的调节作用

IP3

胞浆Ca2+

(从10-8

～10-9

到10-5

～10-6

mol/L)

主要机制：钙池释放Ca2+

（内质网IP3受体）

可能机制：胞膜Ca2+

通道开放

细胞内Ca2+

的主要作用：形成Ca2+

-Ca-M(活性复合物)，导致很多蛋白的磷酸化2.IP3andintracellularCa2+IP3cytoplasmicCa2+

(10-8

～10-9to10-5

～10-6mol/L)Mechanism：opentheCa2+

channelofintracellularCa2+

pool(endoplasmicreticulum)(IP3-gatedion-channel)

Possiblemechanism:

openmembraneCa2+channel

activatesomeenzyme,Ca2+

bindcalmodulin

3.钙调蛋白(Calmodulin,CaM))

结构：两端成球状，各有两个

Ca2+结合位点,每个球状结构各有一凹陷，形成钳状，易与底物结合功能：Ca2+-CaM复合物促进底物蛋白与CaM结合，导致底物磷酸化细胞功能变化

Ca2+-CaM复合物促进底物蛋白磷酸化的效应CaMKIIisthemainkinaseformanyCa2+dependentproteins,activatingthembyphosphorylationCa2+-CaMBindtheregulatorydomainofCaMKIIConformationalchangeATPbindingsiteexposed

ATPboundtotheATPbindingsite

Thekinaseactivated

(Atsilence,regulatoryunitboundtotheATPbindingsite)Ca2+-CaM对神经系统的双相(精细)调节神经储钙蛋白(Calcineurin)：

蛋白磷酸酶2B(脑钙依赖性蛋白脱磷酸，导致失活)

Ca2+-CaM对脑钙依赖性蛋白质的综合作用：

活化的脑钙依赖性

蛋白质调节更精细4.一氧化氮(NO)和环一磷酸鸟苷(cGMP)

Ca2+-CaM是NO合成酶(nitricoxidesynthase)的主要激活因素

NO激活胞浆中的鸟苷酸环化酶(guanylylcyclase)

鸟苷酸环化酶(Guanylatecyclase,GC)

两类GC：膜GC(心钠素受体)

可溶性GC（血管内皮、脑、巨核细胞）可溶性GC结构和激活：

羧基端有一个催化域

氨基端有血红素结合域，与血红素结合，GC无活性

NO的激活作用：和血红素结合使之脱落，GC激活

环一磷酸鸟苷的生成、降解和作用cGMP的生成和降解：

NO(CO)

NO(CO)

活化

PDEGTP3’,5’-cGMP5’-GMP催化区血红素催化区

血红素cGMP及PKG的生理效应cGMP发挥作用的三条途径：通过PKG

通过离子通道通过影响cAMP分解PKG的活化cGMP及PKG的生理效应cGMP发挥作用的三条途径：通过PKG

通过离子通道通过影响cAMP分解PKG的作用：多种蛋白的磷酸化(研究较PKA少)

有些和PKA同方向，意义不明有些与PKA反方向，可能属精细调节如激活RNA聚合酶I、抑制磷酸果糖激酶(PKA相反)

有些有特殊意义：如扩张血管平滑肌：(可能是NO扩血管的主要机制)

脑细胞兴奋：突触传递的长时程增加/抑制

(可能是兴奋性氨基酸的重要中间环节)

NO-cGMP扩血管的机制

Angiotensin等

PKGcGMP

IP3NO

细胞内Ca2+Ca2+-CaMCaMKIILMCK活化，平滑肌收缩()PKG可能引起IP3形成过程某些成分磷酸化而导致抑制5.二脂肪酰甘油脂(diacyl-glycerol,DAG)和蛋白激酶C(PKC)PI-4,5-P2IP3+DAG

磷酸化后参予

PIP2的再生成循环

水解产生

花生四烯酸

(arachidonicA)

PKC(i)DAG•PKC(a)及前列腺素

(prostaglandin)分布：各种组织，其中脑、血癌细胞量最高