抗原抗体的反应课件

第七章抗原抗体反应的应用第七章抗原抗体反应的应用1免疫沉淀与免疫凝集免疫标记免疫定位分析抗原抗体反应的其他应用免疫沉淀与免疫凝集2免疫分析方法是利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量或质的测定分析。这类分析方法具有特异、灵敏和快速的特点，有的可以表现出一个氨基酸分子的差异，如用单克隆抗体进行检测的方法；测定的量可以达到μg甚至ng的水平，如ELISA法，放射免疫法等；反应在几小时，几分钟甚至更短的时间可以看到测定的结果，如免疫沉淀法等。这类免疫分析的方法可以用于医学，免疫学中抗原抗体的分析(包括病原的诊断，免疫细胞表面分子的检测等)，而且可以广泛的用于生命科学的几乎各个领域，甚至于食品科学，环境科学及分析化学等更为广泛的学科领域。免疫分析方法是利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行3一、免疫沉淀与免疫凝集1．溶液中的沉淀反应在体外，当抗体与相应抗原二者浓度比例适当时，会发生免疫沉淀(immunoprecipitation)反应，表明两者之间有特异性反应。免疫沉淀反应广泛用于抗原或抗体的定性及定量分析。在液相中形成的沉淀不易观察判断，利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于判断，即环状沉淀试验(ringprecipitanttest)(图7—l0)。沉淀试验可以在玻璃管中进行，将小试管或毛管的底部加入抗原溶液，在上层轻轻铺上不同稀释倍数的抗体溶液，勿使界面破坏，为了使界面更好地形成，常在下层抗原溶液中加入10％的蔗糖或甘油。抗原抗体溶液置于37℃或4℃孵育后，在界面上形成白色沉淀线。玻片上沉淀的形成必须在显微镜下观察。一、免疫沉淀与免疫凝集4抗原抗体的反应课件52.凝胶扩散沉淀

抗原抗体可在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。抗原分子和抗体分子在凝胶介质中自由扩形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的一定扩散部位相遇形成沉淀线。凝胶沉淀可用于测定抗原或抗体的相对浓度，也可用于比较不同抗原的特异性、纯度及相互关系。最常用的方法为单向免疫扩散(radialimmunodiffusion)和双向免疫扩散(double－immunodiffusion)。2.凝胶扩散沉淀6单向扩散法又称Mancini法，将适当浓度的抗体混于琼脂(0．8％—1％)中，琼脂凝固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔开始向周围扩散，并在小孔周围合适的位置形成沉淀环。沉淀环的面积与抗原浓度呈正相关。通过与已知抗原浓度形成的沉淀环面积进行比较，可确定被测抗原的浓度(图7—11)。单扩散常用于测定血清中IgG、IgM、IgA及补体的含量。单扩散法的特点使用抗体浓度大，当抗原浓度低于5—10μg／mL则不适用。单向扩散法又称Mancini法，将适当浓度的抗体混于琼脂(7双扩散法又称为Ouchterlony法，在琼脂板中抗原和抗体分别从相邻的孔中向四周扩散，在抗原孔和抗体孔之间二者比例合适的部位形成沉淀线。琼脂双扩散常用于分析抗原间的血清学关系和抗体间差异，相邻孔中不同抗原与同一抗血清反应形成的沉淀线形状的变化显示抗原间是否存在共同的抗原决定簇。当两个抗原完全—致时，两条沉淀线完全融合(图7—12A)；如果两个抗原无共同抗原决定簇而抗血清中有针对两种抗原的抗体时，沉淀线互不干扰，呈交叉状(图7—12B)；当两个抗原只是部分抗原决定簇相同，还有其他不同的抗原决定簇，则沉淀线在后者一方形成突出的小刺(图7—12C)。此外，根据抗体或抗原的不同，可形成其他不同特征的沉淀线。Ouchterlony法灵敏度不高，形成沉淀线需较长时间(18—24h)。但在抗原分析方面很有实用价值。双扩散法又称为Ouchterlony法，在琼脂板中抗原和抗体83．免疫电泳免疫扩散沉淀形成需较长时间，且灵敏度低。免疫电泳（immunoelectrphoresis）是利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离开来的特性与免疫扩散结合一起进行分析的方法。这种方法能提高分辨率和灵敏度。混合的蛋白质抗原在PH8．6时带负电荷，在电场的作用下，由负极向正极迁移，使混合的抗原组分得以分离，而抗体可以通过自由扩散，也可以通过电泳与分离的抗原形成相应的特异性沉淀线。从而提高免疫沉淀的灵敏度。常见的免疫电泳方法有血清免疫电泳，火箭电泳和对流免疫电泳(又称电渗析)。传统的免疫电泳即指血清免疫电泳，将抗原混合物(病人血清)在凝胶中用电泳分离后，沿电冰方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加(图7—13)。3．免疫电泳9抗原抗体的反应课件10抗原抗体的反应课件11抗原抗体的反应课件12火箭电泳(rocketelectrophoresis)，为单向免疫扩散与电泳结合的一种方法。已混合有抗体的凝胶上，做一小孔，加入抗原，电泳后，沿着电泳方向形成火箭型沉淀线，沉淀线的高度与抗原量成正比(图7—14)。火箭电泳可用于定量测定，例如用于测定人血清中的甲胎蛋白。火箭电泳(rocketelectrophoresis)，为134.免疫共沉淀免疫利用共沉淀是抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proteinA/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用proteinA/G预先结合在argarosebeads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。4.免疫共沉淀免疫利用共沉淀是抗原蛋白质和抗体14抗原抗体的反应课件15

5.免疫凝集颗粒性抗原（红细胞、细菌、乳胶颗粒等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。(1)直接凝集(directagglutination)

玻片凝集、试管凝集(2)间接凝集（indirectagglutination）

可溶性抗原或抗体包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应抗体或抗原混合出现的凝集现象。正向间接凝集试验反向间接凝集试验反向间接凝集抑制试验5.免疫凝集颗粒性抗原（红细胞、细菌16二、免疫标记1．放射免疫分析放射免疫分析法(radio—immunoassay，RIA)的应用始于60年代末，广泛用于激素、药物等小分子化合物的定量分析，是灵敏、可靠的免疫分析方法之一。常用来标记抗原或抗体的同位素有125I，131I，3H和35S。放射活性的检测液相反应体系用液体闪烁仪计数，而固相体系可用X射线胶片显影。125I为γ射线(0.035meV)，131I有硬β射线(0.608meV)和γ射线(0.36meV)两种，半衰期为60d，放射性碘标记常用氯胺T法(chloramines—T)。氯胺T是氯代酰胺类氧化剂，在水中不稳定，产生的氯离子将碘离子(I-)氧化为单质碘(I2)，单质碘与抗原或抗体分子上的苯丙氨酸及酪氨酸残基的苯环或组氨酸的咪唑基共价相连，使之发生碘化反应。二、免疫标记17氚(3H)因其放射性损伤小(软β射线、0.0185meV)，物理半衰期长(12—26年)而生物半衰期短，属低毒型放射性同位素，用于标记免疫分子更合适。常用N—琥珀酰亚胺[2，3—3H]丙酸酯标记抗原或抗体分子，其活泼酯基易和蛋白质的游离氨基反应：氚(3H)因其放射性损伤小(软β射线、0.0185meV)18抗原抗体的反应课件19标记反应完成后，需除去未反应的放射性试剂和其他产物，一般用电泳，沉淀，离子变换层析，高压液相层析及超速离心等方法将标记物纯化，但最方便的方法是凝胶过滤，透析及超滤。放射标记的抗原或抗体可直接用于抗原抗体反应，形成的抗原抗体反应复合物，用第—抗体或聚乙二醇沉淀分离后，测定其放射活性．用于定量抗原或抗体。为了提高灵敏度，应用竞争法进行抗原或抗体定量，其放射活性与被测抗原或抗体呈反比(图7—17)。标记反应完成后，需除去未反应的放射性试剂和其他产物，一般用电20抗原抗体的反应课件212．酶联免疫吸附试验同位素标记的免疫分析方法，虽然有较高的灵敏度，但同位素具有不稳定，需要特殊设备。安全性差，废物处理麻烦等缺点限制了其使用。非放射性标记方法逐步得到发展，其中酶标记免疫试验是广泛使用的方法。因酶促反应使测定的结果被放大，反应的灵敏度接近放射免疫分析法。用于标记的酶的种类也越来越多，较常用的有碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)、辣根过氧化物(horseradishperoxidase)、β半乳糖苷酶β—galactosidase)和脲酶(urease)等。酶免疫试验法(enzymeimmunoassay，EIA)有两类方法，一类为均相法，即抗原与抗体反应后，不必将结合的与游离的抗原或抗体分离，就可测定被测分子的含量。如酶放大免疫分折技术(enzymemultipliedimmunoassay，EMIT)，将小分子抗原连接在酶分子的活性位点附近，当抗体与这些抗原结合后，封闭了酶催化位点，使酶失去活性。2．酶联免疫吸附试验22如果被测溶液中元相应抗体，则酶能催化底物形成产物。同一标记物也可以竞争方式检测抗原的含量，另一类为固相法，即将抗原或抗体吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，磁珠等表面，抗原与抗体反应后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物，即酶联免疫吸附试(enzyme—linkedimmunosorbentassay，ELISA)。ELISA有直接法、间接法及夹心法等不同反应方式。直接法(directELISA)是指用酶标记的抗原或抗体直接检测包被在酶标板上的抗体或抗原，被检抗原或抗体的量与产物颜色成正比(图7—18A)；间接法(indirectELISA)是将酶标记在第二抗体上，当抗原与第一抗体结合后，再用酶标第二抗体来检查第一抗体是合与抗原结合。有酶底物显色的反应为正反应，反之为负反应(图7—18B)。夹心法(sandwichELISA)先用一种未标记的抗体包被酶标板，用于捕获抗原分子，再用标记的具有相同抗原特性但来源于不同种类动物的抗体与之反应。也可用间接法中的第二抗体进行该项反应(间接夹心法)(图7—18C)。夹心法可用于检测抗原，尤其是小分子的抗原，也可以用于检测抗体。如果被测溶液中元相应抗体，则酶能催化底物形成产物。同一标记物23抗原抗体的反应课件24用酶标记的第二抗体进行间接ELISA，避免了用酶标记每一种抗原或抗体的复杂过程，因而得到更广泛的应用。常用的羊抗鼠IgG、羊抗免IgG及羊抗人IgG的酶交联物已经商品化，可根据需要选择合适酶标第二抗体。不同的酶催化的底物不同，显色产物的吸收波长也不一样(表17—4)。酶标比色仪呵进行光吸收的测量。斑点酶免疫试验(dot—ELISA)：ELISA一般是在液相中进行酶底物显色反应的，所以反应产物都是有色的可溶性化合物，便于用光吸收法测定反应的强度。dot—ELISA的原理与普通ELISA相同，只是把反应全部移到硝酸纤维素膜上进行，而不是在聚苯乙烯酶标板上进行。即把抗原、第一抗体、第二抗体都依次加到膜上，洗脱未反应物及封闭反应物以外的膜表面都与普通ELISA相同。最后的显色反应是用另外一类底物，这类底物反应的产物是不溶于水的有色沉淀物，如碱性磷酸酶的底物要用BCIP／NBT，而不能用pNPP。根据膜上沉淀物颜色有无与深浅判断反应的正负和量的多少。斑点扫描仪也可以帮助定量。dot—ELISA的优点是灵敏度比普通ELISA高10—100倍，与放射免疫的灵敏度水平相当。用酶标记的第二抗体进行间接ELISA，避免了用酶标记25抗原抗体的反应课件263．荧光与发光免疫分析用于标记抗体的荧光化合物有异硫青荧光素(FITC)和罗丹明(rhodamine)荧光素等，适用于抗原细胞和组织的定位分析。近年来用稀土元素(镧系元素)的铕离子(Eu3+)、铽离子(Tb3+)等代替荧光素标记抗体，将时间分辨技术引入生物检测领域，建立了时间分辨荧光免疫分析法(time—resolvedfluorommunoassay，TrFIA)，明显提高了荧光免疫分析技术的灵敏度和特异性。TrFIA的测定原理与荧光免疫分析法不同，当铕离子螯合物标记抗体后，抗体与固相化的特异性抗原结合，抗体上的Eu3+在紫外光(340nm)激发下，与增强液中的β二酮体重新形成—种微胶体螯合物，发出长寿命的高强度荧光(613nm)，比未激发时增强了100万倍(图7—19)，可用时间分辨荧光计记录下来。3．荧光与发光免疫分析27稀土元素的荧光激发波长范围较宽〔300—380nm)，有利于增高激发能，提高标记抗体的灵敏性；而发射波长很窄(613nm)，造成激发波长和发射波长之间的差别很大(270nm)，有利于降低背景，利用干涉滤片排除散射荧光的干扰。稀土元素产生的荧光不但强度高，而且半衰期长(10～100μs)，比普通荧光素高出5—6个数量级。利用延迟测量时间可消除来自样品，试剂等的干扰。稀土元素用双功能基团螯合剂，如异硫酸—苯基—乙二胺四乙酸可标记至抗体的酪氨酸和组氨酸残基上。标记方法简单方便，稳定性好，可使用1—2年的时间。稀土元素的荧光激发波长范围较宽〔300—380nm28发光免疫分析(luminescentimmunoassay，LIR)也是近年发展起来的一项免疫分析新技术。用发光物质标记抗体或抗原。其反应原理与ELISA、RIA、FIA等类似。根据发光物的来源不同，有化学发光(che’miluminessence)和生物发光(bioluminescence)不同方法。一些化学发光剂如荧光醇(1uminol)，可用于标记抗原或抗体，反应时发光剂发生高能化学反应，形成处于电子激发态的分子，当这些产物分子回到基态时，伴随着光子的释放，发生化学发光现象。荧光醇在标记过程中易丢失发光能力，异荧光醇(iso1uminol)相对更稳定一些。一些发光分子的发光反应需要阳离子或酶的催化，还有一些化学发光分子如吖啶酯(acridineester)则不需催化剂的作用，只需在酸性条件下用过氧化氢诱导化学发光。目前把化学发光剂与发光增强剂结合使用，使光强度达到X光胶片曝光的要求。发光免疫分析(luminescentimmunoa29抗原抗体的反应课件30生物发光常见的反应系统为虫荧素(luciferin)在虫荧酶(lucifase)的催化下，有ATP，Mg2+及O2存在．发生瞬时发光反应：发光反应可用瞬时荧光仪检测记录，也可用胶片显影。生物发光常见的反应系统为虫荧素(luciferin)在虫荧酶314．亲和标记的免疫分析金黄色葡萄球菌的A蛋白与IgGFc段有高度的亲和力。用酶、同位素、荧光素等标记A蛋白，替代第二抗体直接与抗体结合，可用于抗原抗体反应的分析。A蛋白对不同种动物来源的IgG均有亲和性，可用于多数抗原抗体反应的分析，但有些动物的IgG或少数亚类不与A蛋白结合，选择时应注意(见第三章)。生物素(biotin)是一种维生素，存在于多种生物组织中，也可以人工合成，能特异性地与来自卵蛋白的亲和素(avidin)或链霉菌的链亲合素(strepavidin)结合。生物素与亲和素有很高的亲和力，比抗原抗体结合的亲和力高104倍，并且一个亲和素分子可与多个生物素分子结合。4．亲和标记的免疫分析32全物素是小分子化合物(相对分子质量为224)，能通过双功能连接剂能与抗原、抗体、酶等大分子上氨基、羧基及糖基共价结合。—个大分子上可以标记数个生物素分子。链亲和素是相对分子质量为6．8×l04的大蛋白质，可用酶、荧光素等标记。标记后的生物素不影响其与亲和素的结合，因此在免疫分析中得到广泛的应用。一些不易制备抗体的生物大分子如核酸及多糖也常用亲和素—生物素复合物(avidinn—biotincomplex，ABC)系统检测。如用生物素标记核酸探针，用于核酸杂交的分析。此外，小分子药物地高辛(digoxin)也可用于标记许多生物大分子，再用地高辛作半抗原免疫获得的相应抗体进行检测。用生物素、地高辛等小分子化台物标记技术，在分子生物学实验中得到广泛的应用，统称为非放射性标记分析技术。

全物素是小分子化合物(相对分子质量为224)，能通过双功能连33三、免疫定位分析1、免疫荧光定位分析由于散射作用及生物材料所含天然荧光会影响荧光免疫分析(fluorescenceimmunoassay，FIA)的灵敏度和特异性。但不同发光颜色的荧光化合物标记抗体用于免疫细胞化学(immuno－cytochemistry)和免疫组织化学(immuno—histochemistry)检测，对某些有生物功能的分子在细胞或组织中的表达和定位仍是非常有效的方法之一。常用的荧光色素(fluorochrome)为异硫氰荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC)和异硫氰四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine，TRITC)等具有特殊的激发波长和发射波长(表7—5)。荧光色素用双功能交联剂标记至抗体的Fc段不影响其与细胞和组织中的抗原特异性结合。组织切片或细胞样品处理既要使抗原结构保持完整并且充分暴露，同时也要保持细胞或组织结构的完整性。荧光色素可以标记特异性抗体，也可标记第二抗体，A蛋白或亲和素。还可用不同的荧光色素标记不同的抗体，同时进行两种以上抗原分子的定位。荧光通过荧光显微镜来观察，组织切片和细胞上的荧光暴露在紫外光下，会迅速衰弱成淬灭，因此观察时要迅速，用荧光分析电脑软件进行记录分析可以得到更为准确而清晰的纳果。三、免疫定位分析34抗原抗体的反应课件35用荧光抗体鉴别淋巴细胞亚群，尤其是CD4+和CD8+T细胞亚群，在临床上具有重要意义。用荧光抗体标记的不同淋巴细胞亚群，根据荧光强度及种类的差异用流式细胞仪可将不同细胞群分离，称为荧光激活细胞分拣器(fluorescence－activatedcellsorter，FACS)(图7—20)。用两种特异性荧光抗体(抗CD4和抗CD8)标记淋巴细胞，则有4种不同标记强度的细胞。细胞通过FACS的喷嘴形成微滴，一个细胞形成一个微滴，当其通过激发光束时，产生的荧光信号被检测到，在记录的同时，将信号反馈至下方电极板，电极板根据荧光的强度和种类使微滴发生偏向，进入相应的收集管中。用FACS获得不同细胞亚群在淋巴细胞所占的比例及数量，并可收集不同亚群的细胞。用荧光抗体鉴别淋巴细胞亚群，尤其是CD4+和CD8+T细胞亚362．酶标记免疫定位酶标记免疫定位的方法及基本原理与dot—ELISA相同，所用的酶底物在反应后必须形成不溶于水的有色产物。酶标记免疫定位主要用于免疫组织化学进行组织和细胞内的抗原定位及免疫印迹分析以替代同位素标记的试验。(1)酶标免疫组织化学；免疫组织化学(immuuohistochemistry)的原理与dot－ELISA相同只是固相抗原为组织切片或细胞样品，用于标记抗体的酶和酶的底物见表7—6。2．酶标记免疫定位37抗原抗体的反应课件38抗原抗体的反应课件39组织切片的制备尽可能保持组织细胞的形态结构及抗原分子在细胞中的天然定位及构象，固定过程有助于结构的保护和稳定，使蛋白质肽链上的活性基团发生交联并破坏氢键。常用的福尔马林(40％甲醛)及其衍生物作固定剂，易损坏抗原结构，导致抗体的结合效率降低，甚至失去结合作用。因此采用更温和的固定方法，同时用蛋白酶如胰蛋白酶，胃蛋白酶及蛋白酶K等酶解处理，破坏蛋白质的交联作用，使组织的抗原决定簇充分暴露。石腊包理及一系列脱水过程也易使抗原结构破坏，改用环氧树酯包埋可以提高组织结构的分辨率，但仍对抗原结构有破坏作用。组织样品不经过固定处理直接采用冰冻切片技术，对抗原结构的破坏最少，但易导致细胞形态改变及不能长期保存而受到限制。此外植物细胞、种子、孢子及花粉等因紧密的细胞壁和其他胞内结构，易干扰酶标记抗体的结合及显色产物的形成，须用特殊的方法处理。而培养细胞可直接涂布在玻片上形成单层细胞，不需包埋切片处理，直接用于免疫组织化学反应。组织切片的制备尽可能保持组织细胞的形态结构及抗原分子40(2)免疫印迹：免疫印迹用于体外蛋白质抗原的分析。蛋白质经SDS—PAGE分离后，不同相对分子质量的蛋白质呈现不同迁移率，在聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)上形成不同的条带。这些蛋白质条带转移至硝酸纤维膜(nitrocellulosemembrane)上，其相对位置和含量与凝胶中保持一致。结合在硝酸纤维膜上的蛋白质，类似于固相载体上吸附的抗原，可用酶标记的抗体进行与dot—ELISA相同的显色反应，确定目的蛋白质的有无或相对分子质量的大小(图7—21)。免疫印迹分析中标记抗体所用的酶及相应底物与免疫组织化学相同，此外也可以用同位素标记或者非同位素的ABC系统等进行标记以提高方法的灵敏度。免疫印迹法常用于生物工程中表达的一些微量蛋白质的检测。(2)免疫印迹：免疫印迹用于体外蛋白质抗原的分析。蛋白质经S41抗原抗体的反应课件423．免疫电子显微镜技术免疫电子显微镜(immuno－electromicroscope，IEM)技术是电子显微镜技术与免疫反应相结合的—项技术，大大提高了电镜观察的特异性。形态相同，但结构和组成不相同的生物粒子，如细胞器，病毒颗粒等用免疫电镜能有效地区分，尤其是对病毒等大颗粒抗原粒子和细胞超微结构的观察。免疫电子显微镜有两类方法。一类是用抗体直接与所要观察的抗原颗粒结合，这种结合可以在电镜的铜网上进行。先用抗体捕捉抗原，再用抗体进行装饰，或者只用抗体捕捉后用磷钨酸负染后观察。这种方法适合于观察病毒、细菌、细胞等大颗粒的抗原，一般不用于抗原的细胞组织定位。另一类方法是应用金标记抗体进行抗原的定位。3．免疫电子显微镜技术43应用大小不同的金颗粒(直径l—40nm)标记不同特异性的抗体，同时可以定位两种以上的组分或抗原决定簇在细胞内的分布。根据金颗粒多少还可以对特异性抗原成分的强度进行估计。金颗粒通过非共价电子稳定态吸附标记抗体，金标抗体可像普通抗体一样直接用以大颗粒抗原的装饰后观察，还可用于组织和细胞中抗原的定位观察，样品的切片制备要求与免疫组织化学相同。胶体金标记的抗体，也可用于光镜水平的免疫定位，但金颗粒必须大于20nm，标记抗体的浓度较高。金颗粒在光镜下呈淡红色，不易识别，用银染色液处理后，在金颗粒周围吸附大量的银颗粒，呈黑褐色．大大提高了灵敏度，这种技术称为免疫金银染色法(immunogoldsliverstaining，IGSS)，多用于细胞表面标志定位，免疫细胞亚群计数，白血病分型等。应用大小不同的金颗粒(直径l—40nm)标记不44四、抗原抗体反应的其他应用1．免疫亲和层析免疫亲和层析(immunoaffinitychromatography)是一种从多组分混和物中分离纯化单组分产物简便而有效的方法，比凝胶过滤和离子交换层析获得的产物纯度更高。免疫球蛋白的氨基在弱碱性条件下(如PH9．6的碳酸盐缓冲液中)能够与活化的琼脂糖(agarose)或葡聚糖(sepharose)上的琥珀酰胺或溴化氰基团交联，未被结合的基团用小分子的羟胺或非特异性蛋白质封闭。制备好的亲和固相材料用高pH和低PH，高盐和低盐的缓冲液反复平衡，除去非共价结合的蛋白质，使亲和固相材料稳定。亲和纯化常用两种方法将特异性蛋白抗原和非特异性蛋白质分离。一种是将待纯化样品与因相基质混和，过滤或离心除去未结合的杂蛋白，再改变缓冲液条件，使目的蛋白洗脱，这种方法称批量纯化法，一次可纯化多个样品。另一种更为常用的方法即柱层析法。将亲和固相基质装入柱中，待纯化的样品过柱后，特异性蛋白与基质上的抗体结合，未结合的非特异蛋白用缓冲液洗去，然后改变洗脱条件即缓冲液的PH和离子强度，将结合的特异性蛋白质洗脱下来(图7—22)。四、抗原抗体反应的其他应用45洗脱特异性结合抗原最常用的方法是改变PH。当PH低于2或高于11时，抗原与抗体便发生解离。用低或高PH缓冲液洗脱的抗原蛋白应迅速用碱或酸调PH至中性以防抗原破坏及活性丧失。用于免疫亲和层析的抗体，对抗原的亲和力并不是越高越好。亲和力高而结合速率常数(K+)和解离速率常数(K-)均小的抗体并不适用于亲和纯化(见第二节)，因为抗原抗体复合物形成和解离的速度慢，导致纯化效率低和柱使用寿命短。此外高离子强度，疏水条件的改变也能使抗原从抗体亲和柱上洗脱下来。异氰酸钾、氯化锰、表面活性剂及有机溶剂均可用于改变疏水条件。洗脱特异性结合抗原最常用的方法是改变PH。当PH低于46抗原抗体的反应课件472．生物感应器抗原抗体特异性结合的机理虽未完全阐明，但是已知抗原和抗体在相互结合后它们的结构发生了变化，一些次级键参与结构的变化。这种结构的改变通过电场效应的改变而检测到。生物感应器由3部分组成(图7—23)：生物受体、转导体和电子放大处理器。抗体是理想的生物受体，可通过直接或间接的方式连接至转导体上。抗原抗体反应可通过电化学、光学、压电(piezoelectric)和热量改变(calorimetric)等的变化表现出来，从而能被转导体直接或间接检测到。抗体可固定在场效晶体管(field－effecttransistor)的半导体门上。与抗原结合后引起电荷分布的改变从而开启场效管使信号传递给放大器。抗体也可以固定在光纤维的表面，光通过光纤维时发生反射产生瞬时波(evanescentwaves)，这种瞬时波是光纤维和液体界面间产生的电磁能(electromagneticenergy)，如果界面上吸附有分子，则发生能量的吸收，吸收的量与界面上吸附分子的量成正比。因此抗原抗体的结合可以检测到。2．生物感应器48如果在光纤维外包一层金属膜，光通过时则产生质子共振(plasmonresonance)，质子共振发生在特殊的入射角度，这个角度取决于金属膜上所交联的抗体介质的折射系数。未结合的抗体与抗原—抗体复合物能导致折射系数的改变。由此判定抗原与抗体的结合是否发生及发生的强度。如果在光纤维外包一层金属膜，光通过时则产生质子共49TheendThankyouTheendThankyou50第七章抗原抗体反应的应用第七章抗原抗体反应的应用51免疫沉淀与免疫凝集免疫标记免疫定位分析抗原抗体反应的其他应用免疫沉淀与免疫凝集52免疫分析方法是利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量或质的测定分析。这类分析方法具有特异、灵敏和快速的特点，有的可以表现出一个氨基酸分子的差异，如用单克隆抗体进行检测的方法；测定的量可以达到μg甚至ng的水平，如ELISA法，放射免疫法等；反应在几小时，几分钟甚至更短的时间可以看到测定的结果，如免疫沉淀法等。这类免疫分析的方法可以用于医学，免疫学中抗原抗体的分析(包括病原的诊断，免疫细胞表面分子的检测等)，而且可以广泛的用于生命科学的几乎各个领域，甚至于食品科学，环境科学及分析化学等更为广泛的学科领域。免疫分析方法是利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行53一、免疫沉淀与免疫凝集1．溶液中的沉淀反应在体外，当抗体与相应抗原二者浓度比例适当时，会发生免疫沉淀(immunoprecipitation)反应，表明两者之间有特异性反应。免疫沉淀反应广泛用于抗原或抗体的定性及定量分析。在液相中形成的沉淀不易观察判断，利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于判断，即环状沉淀试验(ringprecipitanttest)(图7—l0)。沉淀试验可以在玻璃管中进行，将小试管或毛管的底部加入抗原溶液，在上层轻轻铺上不同稀释倍数的抗体溶液，勿使界面破坏，为了使界面更好地形成，常在下层抗原溶液中加入10％的蔗糖或甘油。抗原抗体溶液置于37℃或4℃孵育后，在界面上形成白色沉淀线。玻片上沉淀的形成必须在显微镜下观察。一、免疫沉淀与免疫凝集54抗原抗体的反应课件552.凝胶扩散沉淀

抗原抗体可在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。抗原分子和抗体分子在凝胶介质中自由扩形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的一定扩散部位相遇形成沉淀线。凝胶沉淀可用于测定抗原或抗体的相对浓度，也可用于比较不同抗原的特异性、纯度及相互关系。最常用的方法为单向免疫扩散(radialimmunodiffusion)和双向免疫扩散(double－immunodiffusion)。2.凝胶扩散沉淀56单向扩散法又称Mancini法，将适当浓度的抗体混于琼脂(0．8％—1％)中，琼脂凝固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔开始向周围扩散，并在小孔周围合适的位置形成沉淀环。沉淀环的面积与抗原浓度呈正相关。通过与已知抗原浓度形成的沉淀环面积进行比较，可确定被测抗原的浓度(图7—11)。单扩散常用于测定血清中IgG、IgM、IgA及补体的含量。单扩散法的特点使用抗体浓度大，当抗原浓度低于5—10μg／mL则不适用。单向扩散法又称Mancini法，将适当浓度的抗体混于琼脂(57双扩散法又称为Ouchterlony法，在琼脂板中抗原和抗体分别从相邻的孔中向四周扩散，在抗原孔和抗体孔之间二者比例合适的部位形成沉淀线。琼脂双扩散常用于分析抗原间的血清学关系和抗体间差异，相邻孔中不同抗原与同一抗血清反应形成的沉淀线形状的变化显示抗原间是否存在共同的抗原决定簇。当两个抗原完全—致时，两条沉淀线完全融合(图7—12A)；如果两个抗原无共同抗原决定簇而抗血清中有针对两种抗原的抗体时，沉淀线互不干扰，呈交叉状(图7—12B)；当两个抗原只是部分抗原决定簇相同，还有其他不同的抗原决定簇，则沉淀线在后者一方形成突出的小刺(图7—12C)。此外，根据抗体或抗原的不同，可形成其他不同特征的沉淀线。Ouchterlony法灵敏度不高，形成沉淀线需较长时间(18—24h)。但在抗原分析方面很有实用价值。双扩散法又称为Ouchterlony法，在琼脂板中抗原和抗体583．免疫电泳免疫扩散沉淀形成需较长时间，且灵敏度低。免疫电泳（immunoelectrphoresis）是利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离开来的特性与免疫扩散结合一起进行分析的方法。这种方法能提高分辨率和灵敏度。混合的蛋白质抗原在PH8．6时带负电荷，在电场的作用下，由负极向正极迁移，使混合的抗原组分得以分离，而抗体可以通过自由扩散，也可以通过电泳与分离的抗原形成相应的特异性沉淀线。从而提高免疫沉淀的灵敏度。常见的免疫电泳方法有血清免疫电泳，火箭电泳和对流免疫电泳(又称电渗析)。传统的免疫电泳即指血清免疫电泳，将抗原混合物(病人血清)在凝胶中用电泳分离后，沿电冰方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加(图7—13)。3．免疫电泳59抗原抗体的反应课件60抗原抗体的反应课件61抗原抗体的反应课件62火箭电泳(rocketelectrophoresis)，为单向免疫扩散与电泳结合的一种方法。已混合有抗体的凝胶上，做一小孔，加入抗原，电泳后，沿着电泳方向形成火箭型沉淀线，沉淀线的高度与抗原量成正比(图7—14)。火箭电泳可用于定量测定，例如用于测定人血清中的甲胎蛋白。火箭电泳(rocketelectrophoresis)，为634.免疫共沉淀免疫利用共沉淀是抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proteinA/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用proteinA/G预先结合在argarosebeads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。4.免疫共沉淀免疫利用共沉淀是抗原蛋白质和抗体64抗原抗体的反应课件65

5.免疫凝集颗粒性抗原（红细胞、细菌、乳胶颗粒等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。(1)直接凝集(directagglutination)

玻片凝集、试管凝集(2)间接凝集（indirectagglutination）

可溶性抗原或抗体包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应抗体或抗原混合出现的凝集现象。正向间接凝集试验反向间接凝集试验反向间接凝集抑制试验5.免疫凝集颗粒性抗原（红细胞、细菌66二、免疫标记1．放射免疫分析放射免疫分析法(radio—immunoassay，RIA)的应用始于60年代末，广泛用于激素、药物等小分子化合物的定量分析，是灵敏、可靠的免疫分析方法之一。常用来标记抗原或抗体的同位素有125I，131I，3H和35S。放射活性的检测液相反应体系用液体闪烁仪计数，而固相体系可用X射线胶片显影。125I为γ射线(0.035meV)，131I有硬β射线(0.608meV)和γ射线(0.36meV)两种，半衰期为60d，放射性碘标记常用氯胺T法(chloramines—T)。氯胺T是氯代酰胺类氧化剂，在水中不稳定，产生的氯离子将碘离子(I-)氧化为单质碘(I2)，单质碘与抗原或抗体分子上的苯丙氨酸及酪氨酸残基的苯环或组氨酸的咪唑基共价相连，使之发生碘化反应。二、免疫标记67氚(3H)因其放射性损伤小(软β射线、0.0185meV)，物理半衰期长(12—26年)而生物半衰期短，属低毒型放射性同位素，用于标记免疫分子更合适。常用N—琥珀酰亚胺[2，3—3H]丙酸酯标记抗原或抗体分子，其活泼酯基易和蛋白质的游离氨基反应：氚(3H)因其放射性损伤小(软β射线、0.0185meV)68抗原抗体的反应课件69标记反应完成后，需除去未反应的放射性试剂和其他产物，一般用电泳，沉淀，离子变换层析，高压液相层析及超速离心等方法将标记物纯化，但最方便的方法是凝胶过滤，透析及超滤。放射标记的抗原或抗体可直接用于抗原抗体反应，形成的抗原抗体反应复合物，用第—抗体或聚乙二醇沉淀分离后，测定其放射活性．用于定量抗原或抗体。为了提高灵敏度，应用竞争法进行抗原或抗体定量，其放射活性与被测抗原或抗体呈反比(图7—17)。标记反应完成后，需除去未反应的放射性试剂和其他产物，一般用电70抗原抗体的反应课件712．酶联免疫吸附试验同位素标记的免疫分析方法，虽然有较高的灵敏度，但同位素具有不稳定，需要特殊设备。安全性差，废物处理麻烦等缺点限制了其使用。非放射性标记方法逐步得到发展，其中酶标记免疫试验是广泛使用的方法。因酶促反应使测定的结果被放大，反应的灵敏度接近放射免疫分析法。用于标记的酶的种类也越来越多，较常用的有碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)、辣根过氧化物(horseradishperoxidase)、β半乳糖苷酶β—galactosidase)和脲酶(urease)等。酶免疫试验法(enzymeimmunoassay，EIA)有两类方法，一类为均相法，即抗原与抗体反应后，不必将结合的与游离的抗原或抗体分离，就可测定被测分子的含量。如酶放大免疫分折技术(enzymemultipliedimmunoassay，EMIT)，将小分子抗原连接在酶分子的活性位点附近，当抗体与这些抗原结合后，封闭了酶催化位点，使酶失去活性。2．酶联免疫吸附试验72如果被测溶液中元相应抗体，则酶能催化底物形成产物。同一标记物也可以竞争方式检测抗原的含量，另一类为固相法，即将抗原或抗体吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，磁珠等表面，抗原与抗体反应后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物，即酶联免疫吸附试(enzyme—linkedimmunosorbentassay，ELISA)。ELISA有直接法、间接法及夹心法等不同反应方式。直接法(directELISA)是指用酶标记的抗原或抗体直接检测包被在酶标板上的抗体或抗原，被检抗原或抗体的量与产物颜色成正比(图7—18A)；间接法(indirectELISA)是将酶标记在第二抗体上，当抗原与第一抗体结合后，再用酶标第二抗体来检查第一抗体是合与抗原结合。有酶底物显色的反应为正反应，反之为负反应(图7—18B)。夹心法(sandwichELISA)先用一种未标记的抗体包被酶标板，用于捕获抗原分子，再用标记的具有相同抗原特性但来源于不同种类动物的抗体与之反应。也可用间接法中的第二抗体进行该项反应(间接夹心法)(图7—18C)。夹心法可用于检测抗原，尤其是小分子的抗原，也可以用于检测抗体。如果被测溶液中元相应抗体，则酶能催化底物形成产物。同一标记物73抗原抗体的反应课件74用酶标记的第二抗体进行间接ELISA，避免了用酶标记每一种抗原或抗体的复杂过程，因而得到更广泛的应用。常用的羊抗鼠IgG、羊抗免IgG及羊抗人IgG的酶交联物已经商品化，可根据需要选择合适酶标第二抗体。不同的酶催化的底物不同，显色产物的吸收波长也不一样(表17—4)。酶标比色仪呵进行光吸收的测量。斑点酶免疫试验(dot—ELISA)：ELISA一般是在液相中进行酶底物显色反应的，所以反应产物都是有色的可溶性化合物，便于用光吸收法测定反应的强度。dot—ELISA的原理与普通ELISA相同，只是把反应全部移到硝酸纤维素膜上进行，而不是在聚苯乙烯酶标板上进行。即把抗原、第一抗体、第二抗体都依次加到膜上，洗脱未反应物及封闭反应物以外的膜表面都与普通ELISA相同。最后的显色反应是用另外一类底物，这类底物反应的产物是不溶于水的有色沉淀物，如碱性磷酸酶的底物要用BCIP／NBT，而不能用pNPP。根据膜上沉淀物颜色有无与深浅判断反应的正负和量的多少。斑点扫描仪也可以帮助定量。dot—ELISA的优点是灵敏度比普通ELISA高10—100倍，与放射免疫的灵敏度水平相当。用酶标记的第二抗体进行间接ELISA，避免了用酶标记75抗原抗体的反应课件763．荧光与发光免疫分析用于标记抗体的荧光化合物有异硫青荧光素(FITC)和罗丹明(rhodamine)荧光素等，适用于抗原细胞和组织的定位分析。近年来用稀土元素(镧系元素)的铕离子(Eu3+)、铽离子(Tb3+)等代替荧光素标记抗体，将时间分辨技术引入生物检测领域，建立了时间分辨荧光免疫分析法(time—resolvedfluorommunoassay，TrFIA)，明显提高了荧光免疫分析技术的灵敏度和特异性。TrFIA的测定原理与荧光免疫分析法不同，当铕离子螯合物标记抗体后，抗体与固相化的特异性抗原结合，抗体上的Eu3+在紫外光(340nm)激发下，与增强液中的β二酮体重新形成—种微胶体螯合物，发出长寿命的高强度荧光(613nm)，比未激发时增强了100万倍(图7—19)，可用时间分辨荧光计记录下来。3．荧光与发光免疫分析77稀土元素的荧光激发波长范围较宽〔300—380nm)，有利于增高激发能，提高标记抗体的灵敏性；而发射波长很窄(613nm)，造成激发波长和发射波长之间的差别很大(270nm)，有利于降低背景，利用干涉滤片排除散射荧光的干扰。稀土元素产生的荧光不但强度高，而且半衰期长(10～100μs)，比普通荧光素高出5—6个数量级。利用延迟测量时间可消除来自样品，试剂等的干扰。稀土元素用双功能基团螯合剂，如异硫酸—苯基—乙二胺四乙酸可标记至抗体的酪氨酸和组氨酸残基上。标记方法简单方便，稳定性好，可使用1—2年的时间。稀土元素的荧光激发波长范围较宽〔300—380nm78发光免疫分析(luminescentimmunoassay，LIR)也是近年发展起来的一项免疫分析新技术。用发光物质标记抗体或抗原。其反应原理与ELISA、RIA、FIA等类似。根据发光物的来源不同，有化学发光(che’miluminessence)和生物发光(bioluminescence)不同方法。一些化学发光剂如荧光醇(1uminol)，可用于标记抗原或抗体，反应时发光剂发生高能化学反应，形成处于电子激发态的分子，当这些产物分子回到基态时，伴随着光子的释放，发生化学发光现象。荧光醇在标记过程中易丢失发光能力，异荧光醇(iso1uminol)相对更稳定一些。一些发光分子的发光反应需要阳离子或酶的催化，还有一些化学发光分子如吖啶酯(acridineester)则不需催化剂的作用，只需在酸性条件下用过氧化氢诱导化学发光。目前把化学发光剂与发光增强剂结合使用，使光强度达到X光胶片曝光的要求。发光免疫分析(luminescentimmunoa79抗原抗体的反应课件80生物发光常见的反应系统为虫荧素(luciferin)在虫荧酶(lucifase)的催化下，有ATP，Mg2+及O2存在．发生瞬时发光反应：发光反应可用瞬时荧光仪检测记录，也可用胶片显影。生物发光常见的反应系统为虫荧素(luciferin)在虫荧酶814．亲和标记的免疫分析金黄色葡萄球菌的A蛋白与IgGFc段有高度的亲和力。用酶、同位素、荧光素等标记A蛋白，替代第二抗体直接与抗体结合，可用于抗原抗体反应的分析。A蛋白对不同种动物来源的IgG均有亲和性，可用于多数抗原抗体反应的分析，但有些动物的IgG或少数亚类不与A蛋白结合，选择时应注意(见第三章)。生物素(biotin)是一种维生素，存在于多种生物组织中，也可以人工合成，能特异性地与来自卵蛋白的亲和素(avidin)或链霉菌的链亲合素(strepavidin)结合。生物素与亲和素有很高的亲和力，比抗原抗体结合的亲和力高104倍，并且一个亲和素分子可与多个生物素分子结合。4．亲和标记的免疫分析82全物素是小分子化合物(相对分子质量为224)，能通过双功能连接剂能与抗原、抗体、酶等大分子上氨基、羧基及糖基共价结合。—个大分子上可以标记数个生物素分子。链亲和素是相对分子质量为6．8×l04的大蛋白质，可用酶、荧光素等标记。标记后的生物素不影响其与亲和素的结合，因此在免疫分析中得到广泛的应用。一些不易制备抗体的生物大分子如核酸及多糖也常用亲和素—生物素复合物(avidinn—biotincomplex，ABC)系统检测。如用生物素标记核酸探针，用于核酸杂交的分析。此外，小分子药物地高辛(digoxin)也可用于标记许多生物大分子，再用地高辛作半抗原免疫获得的相应抗体进行检测。用生物素、地高辛等小分子化台物标记技术，在分子生物学实验中得到广泛的应用，统称为非放射性标记分析技术。

全物素是小分子化合物(相对分子质量为224)，能通过双功能连83三、免疫定位分析1、免疫荧光定位分析由于散射作用及生物材料所含天然荧光会影响荧光免疫分析(fluorescenceimmunoassay，FIA)的灵敏度和特异性。但不同发光颜色的荧光化合物标记抗体用于免疫细胞化学(immuno－cytochemistry)和免疫组织化学(immuno—histochemistry)检测，对某些有生物功能的分子在细胞或组织中的表达和定位仍是非常有效的方法之一。常用的荧光色素(fluorochrome)为异硫氰荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC)和异硫氰四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine，TRITC)等具有特殊的激发波长和发射波长(表7—5)。荧光色素用双功能交联剂标记至抗体的Fc段不影响其与细胞和组织中的抗原特异性结合。组织切片或细胞样品处理既要使抗原结构保持完整并且充分暴露，同时也要保持细胞或组织结构的完整性。荧光色素可以标记特异性抗体，也可标记第二抗体，A蛋白或亲和素。还可用不同的荧光色素标记不同的抗体，同时进行两种以上抗原分子的定位。荧光通过荧光显微镜来观察，组织切片和细胞上的荧光暴露在紫外光下，会迅速衰弱成淬灭，因此观察时要迅速，用荧光分析电脑软件进行记录分析可以得到更为准确而清晰的纳果。三、免疫定位分析84抗原抗体的反应课件85用荧光抗体鉴别淋巴细胞亚群，尤其是CD4+和CD8+T细胞亚群，在临床上具有重要意义。用荧光抗体标记的不同淋巴细胞亚群，根据荧光强度及种类的差异用流式细胞仪可将不同细胞群分离，称为荧光激活细胞分拣器(fluorescence－activatedcellsorter，FACS)(图7—20)。用两种特异性荧光抗体(抗CD4和抗CD8)标记淋巴细胞，则有4种不同标记强度的细胞。细胞通过FACS的喷嘴形成微滴，一个细胞形成一个微滴，当其通过激发光束时，产生的荧光信号被检测到，在记录的同时，将信号反馈至下方电极板，电极板根据荧光的强度和种类使微滴发生偏向，进入相应的收集管中。用FACS获得不同细胞亚群在淋巴细胞所占的比例及数量，并可收集不同亚群的细胞。用荧光抗体鉴别淋巴细胞亚群，尤其是CD4+和CD8+T细胞亚862．酶标记免疫定位酶标记免疫定位的方法及基本原理与dot—ELISA相同，所用的酶底物在反应后必须形成不溶于水的有色产物。酶标记免疫定位主要用于免疫组织化学进行组织和细胞内的抗原定位及免疫印迹分析以替代同位素标记的试验。(1)酶标免疫组织化学；免疫组织化学(immuuohistochemistry)的原理与dot－ELISA相同只是固相抗原为组织切片或细胞样品，用于标记抗体的酶和酶的底物见表7—6。2．酶标记免疫定位87抗原抗体的反应课件88抗原抗体的反应课件89组织切片的制备尽可能保持组织细胞的形态结构及抗原分子在细胞中的天然定位及构象，固定过程有助于结构的保护和稳定，使蛋白质肽链上的活性基团发生交联并破坏氢键。常用的福尔马林(40％甲醛)及其衍生物作固定剂，易损坏抗原结构，导致抗体的结合效率降低，甚至失去结合作用。因此采用更温和的固定方法，同时用蛋白酶如胰蛋白酶，胃蛋白酶及蛋白酶K等酶解处理，破坏蛋白质的交联作用，使组织的抗原决定簇充分暴露。石腊包理及一系列脱水过程也易使抗原结构破坏，改用环氧树酯包埋可以提高组织结构的分辨率，但仍对抗原结构有破坏作用。组织样品不经过固定处理直接采用冰冻切片技术，对抗原结构的破坏最少，但易导致细胞形态改变及不能长期保存而受到限制。此外植物细胞、种子、孢子及花粉等因紧密的细胞壁和其他胞内结构，易干扰酶标记抗体的结合及显色产物的形成，须用特殊的方法处理。而培养细胞可直接涂布在玻片上形成单层细胞，不需包埋切片处理，直接用于免疫组织化学反应。组织切片的制备尽可能保持组织细胞的形态结构及抗原分子90(2)免疫印迹：免疫印迹用于体外蛋白质抗原的分析。蛋白质经SDS—PAGE分离后，不同相对分子质量的蛋白质呈现不同迁移率，在聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)上形成不同的条带。这些蛋白质条带转移至硝酸纤维膜(nitrocellulosemembrane)上，其相对位置和含量与凝胶中保持一致。结合在硝酸纤维膜上的蛋白质，类似于固相载体上吸附的抗原，可用酶标记的抗体进行与dot—ELISA相同的显色反应，确定目的蛋白质的有无或相对分子质量的大小(图7—21)。免疫印迹分析中标记抗体所用的酶及相应底物与免疫组织化学相同，此外也可以用同位素标记或者非同位素的ABC系统等进行标记以提高方法的灵敏度。免疫印迹法常用于生物工程中表达的一些微量蛋白质的检测。(2