基因工程工具酶

关于基因工程工具酶第一页，共七十六页，2022年，8月28日DNA重组技术的基本工具“分子手术刀”“分子运输车”“分子缝合针”基因工程的工具酶

限制性内切酶I型限制性内切酶II型限制性内切酶III型限制性内切酶

DNA连接酶E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶

载体克隆载体表达载体第二页，共七十六页，2022年，8月28日一、基因工程的工具酶1、工具酶的概念与种类工具酶：凡是基因工程中应用的酶类通称为基因工程工具酶。修饰切连按用途为三类限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA修饰酶第三页，共七十六页，2022年，8月28日2、限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)

（1）限制性核酸内切酶的概念核酸酶：切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶叫做核酸酶。

限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA分子中特异的核苷酸序列（4~8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。第四页，共七十六页，2022年，8月28日（2）限制性核酸内切酶的发现"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics"TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978WernerArberSwitzerland1929~DanielNathansUSA1928~1999HamiltonO.SmithUSA1931~第五页，共七十六页，2022年，8月28日20世纪60年代在研究细菌的限制和修饰现象时被Linn和Arber发现。寄主限制与修饰现象(Restrictionandmodification)在E.coli

K上生长的λ噬体则表示为λ（K）。实验表明，用这种λ（K）噬菌体感染E.coli

B，形成噬菌斑的效率就很低因此λ（K）噬菌体受到了B菌体的限制。11第六页，共七十六页，2022年，8月28日限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片段。限制（Restriction）第七页，共七十六页，2022年，8月28日细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。修饰（Modification）①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基第八页，共七十六页，2022年，8月28日生物体内普遍存在的限制修饰现象。限制是restriction,修饰modification,所以把这一系统叫做：R/M体系。限制与修饰是由两种酶引起的，一种是甲基转移酶，一种是核酸内切酶。限制与修饰存在两方面的作用：一是保护自身的DNA不受限制，即不被切割；二是破坏外源DNA使之迅速降解。第九页，共七十六页，2022年，8月28日（3）限制性核酸内切酶的种类第十页，共七十六页，2022年，8月28日（4）限制性核酸内切酶的命名属名种名株名Haemophilusinfluenzae

d

嗜血流感杆菌d株HindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号

若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。第十一页，共七十六页，2022年，8月28日（5）限制性核酸内切酶的特征特异的识别序列、严格切割位点EcoRI的切割位点EcoRI的识别序列5′…GCTGAATTCGAG…3′3′…CGACTTAAGCTC…5′Cleavagesites识别４-8个相连的核苷酸

4个碱基识别位点：Sau3AⅠ↓GATC

5个碱基识别位点：EcoRⅡ↓CCWGG

NciⅠCC↓SGG6个碱基识别位点：EcoRⅠG↓AATTC识别序列与DNA的来源无关识别序列越长切割频率越小识别序列越短切割频率越大第十二页，共七十六页，2022年，8月28日识别序列特点——

回文结构(palindrome)EcoRI5′…GCTGAATTCGAG…3′3′…CGACTTAAGCTC…5′5’G↓G-A-T-C-C3’3’C-C-T-A-G↑G5’BamHI居然天上客客上天然居切点大多数在识别序列之内，也有的在序列两侧Sau3AⅠ5′…

↓GATC…3′EcoRⅡ5′…

↓CCWGG…3′

NciⅠ5′…

CC↓SGG…3′

EcoRⅠ5′…

G↓AATTC…3′

第十三页，共七十六页，2022年，8月28日切点大多数在识别序列之内，也有的在序列两侧Sau3AⅠ5′…

↓GATC…3′EcoRⅡ5′…

↓CCWGG…3′

NciⅠ5′…

CC↓SGG…3′

EcoRⅠ5′…

G↓AATTC…3′

限制酶切后产生两个末端末端结构：５’-Ｐ和３’-ＯＨ末端种类：平头末端和黏性末端３’-端突起和５’-端突起第十四页，共七十六页，2022年，8月28日PstI等产生的3′粘性末端5′…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3′3′…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5′PstI37℃5′…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3′3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’第十五页，共七十六页，2022年，8月28日３’-端突起

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’５’-端突起

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAG-5’平头末端（Bluntends）

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’第十六页，共七十六页，2022年，8月28日粘性末端的意义ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。①连接便利②粘性末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。③补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。第十七页，共七十六页，2022年，8月28日（6）同位酶、同尾酶与同裂酶同位酶：具有相同的识别序列，但是酶切位点不同。

SmaICCC↓GGGXmaIC↓CCGGG同尾酶：来源各异，识别序列不同，但切割后产生相同的黏性末端。

SalIG↓

TCGACXhoIC↓TCGAG同裂酶：能识别相同序列，且识别位点与切割位点均相同，但来源不同的两种或多种限制酶。

SstICCGC↓GGSacICCGC↓GG第十八页，共七十六页，2022年，8月28日（7）大部分II型核酸内切酶需要的反应条件不同的酶使用不同的类型反应体系Tris-HCl50mMpH7.4MgCl210mMDTT/BSA1mMVolume20-100μlTep.andTime37℃,1-1.5hr1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1μg标准DNA所需的酶量第十九页，共七十六页，2022年，8月28日（8）影响核酸内切限制酶活性的因素

①

DNA的纯度蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间第二十页，共七十六页，2022年，8月28日②

DNA样品的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等哺乳动物中的甲基化酶在5′CG3′序列中的C5位上引入甲基第二十一页，共七十六页，2022年，8月28日③酶切消化反应温度不同酶之间所需最适反应温度不同，且彼此间有相当大的变动范围。大多数酶标准反应温度都是37℃。例外：SmaⅠ25℃ApaⅠ30℃MaeⅠ45℃TaqⅠ65℃第二十二页，共七十六页，2022年，8月28日④

DNA的分子结构

DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超盘旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。第二十三页，共七十六页，2022年，8月28日⑤核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl，ß-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。不正确的NaCl或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。⑥酶切时间

通常酶切时间1－2小时，但大多数酶的活性可维持很长时间，我们可以酶切过夜。第二十四页，共七十六页，2022年，8月28日

高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的星号活性（Staractivity）现象，即限制酶在非标准反应条件下，能切割一些与之特异型识别顺序类似的序列，降低酶切的特异性，这种现象称为星号活性。⑦非适宜环境EcoRI在正常条件下识别并切割5′GAATTC3′序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5′PuPuATPyPy3′或者5′AATT3′第二十五页，共七十六页，2022年，8月28日抑制星号活性的方法

1)尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。2)尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。3)将离子浓度提高到100-150mM（若酶活性不受离子强度影响）。4)将反应缓冲液的pH值降到7.0。5)二价离子用Mg2+。第二十六页，共七十六页，2022年，8月28日不同的酶生产厂家适合各种不同反应的缓冲液TakaraNEBLTI(Gibcol-BRL)PromegaRocheMBI第二十七页，共七十六页，2022年，8月28日3、DNA连接酶（ligase）（1）DNA连接酶的概念

是指利用ATP分子中的-磷酸基团为能量，通过催化两条并排DNA链的5-磷酸基团和3-羟基之间，形成一个磷酸二酯键，而使两个DNA片段共价连接起来的特异的核酸酶。ATP依赖的DNA连接酶NAD＋依赖的DNA连接酶大多数原核生物DNA连接酶真核生物和病毒DNA连接酶，如T4DNA连接酶、真核生物DNA连接酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类型第二十八页，共七十六页，2022年，8月28日（2）DNA连接酶的特性DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的必须是双螺旋DNA的一部分。第二十九页，共七十六页，2022年，8月28日DNA连接酶只能连接DNA双螺旋骨架上的切口，而不能连接缺口。第三十页，共七十六页，2022年，8月28日T4DNA连接酶用途：

1）互补粘性末端的连接;2）平头末端的相连；

3）一条带有切口的双链DNA分子；

4）

DNA杂合体中ＲＮＡ链上的切口。E.coliDNA连接酶用途：1)互补粘性末端的连接;2)一条带有切口的双链DNA分子。第三十一页，共七十六页，2022年，8月28日（1）由ATP（或NAD+）提供AMP，形成酶-AMP复合物，同时释放出PPi或NMN；（3）连接机理（2）激活的AMP结合在DNA链5’端的磷酸基团上，产生含高能磷酸键的焦磷酸酯键；（3）与相邻DNA链3’羟基相连，形成磷酸二酯键，并释放出AMP。第三十二页，共七十六页，2022年，8月28日（4）不同末端连接策略①单酶切产生的相同黏性末端第三十三页，共七十六页，2022年，8月28日②双酶切产生的黏性末端第三十四页，共七十六页，2022年，8月28日③双酶切产生不同的5突出末端第三十五页，共七十六页，2022年，8月28日④双酶切产生不同的3突出末端第三十六页，共七十六页，2022年，8月28日⑤双酶切产生的5突出末端和3突出末端第三十七页，共七十六页，2022年，8月28日⑥平切产生的平末端第三十八页，共七十六页，2022年，8月28日平末端DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM第三十九页，共七十六页，2022年，8月28日常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法

同聚物加尾法第四十页，共七十六页，2022年，8月28日衔接物连接法衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。第四十一页，共七十六页，2022年，8月28日DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。第四十二页，共七十六页，2022年，8月28日Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20μlTep.andTime4-15℃,4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1μgλDNA（HindIII片段）所需的酶量（5）DNA连接酶的反应条件第四十三页，共七十六页，2022年，8月28日增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。插入片段与载体的浓度比例

反应温度插入片段浓度高，至少2︰1。一般14~16℃（6）影响DNA连接反应的因素

平末端DNA分子的连接最适反应的酶量为1~2个单位，粘末端的连接，酶量为0.1个单位较好。DNA连接酶用法与用量第四十四页，共七十六页，2022年，8月28日4、DNA聚合酶（ligase）（1）DNA聚合酶的概念和类型DNA聚合酶：指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3’-OH末端聚合DNA链的一类酶。DNA聚合酶的类型

根据DNA聚合酶所使用的模板不同，将其分为两类：（1）依赖于DNA的DNA聚合酶；（2）依赖于RNA的DNA聚合酶。第四十五页，共七十六页，2022年，8月28日大肠杆菌DNA聚合酶Klenowfragment(克列诺酶)T7DNA聚合酶T4DNA聚合酶修饰过的T7DNA聚合酶逆转录酶（2）常见DNA聚合酶及共有特点第四十六页，共七十六页，2022年，8月28日以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;需要模板和引物的存在;不能起始合成新的DNA链;催化dNTP加到生长中的DNA链的3'-OH末端;催化DNA合成的方向是5'→3'。共同特点主要区别持续合成能力和外切酶活性不同。

T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。第四十七页，共七十六页，2022年，8月28日DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高常用DNA聚合酶的特性比较第四十八页，共七十六页，2022年，8月28日（3）DNA聚合酶I大肠杆菌的DNA聚合酶I是一条约1000个aa的多肽链形成的单亚基蛋白，分子量109Da.三种活性：

聚合酶活性：将4种脱氧核糖核苷酸聚合为新的DNA链。

5’3’外切酶活性:

位于N端

3’

5’外切酶活性:

防止错配。第四十九页，共七十六页，2022年，8月28日①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③带有3’—OH游离端的引物④DNA模板DNA聚合酶I（PolI）的聚合活性反应条件-OH5’

3’

dNTPs第五十页，共七十六页，2022年，8月28日标记①核酸探针（probe）

能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。用DNA聚合酶I制备探针已知序列的核酸片段显示位置与互补的待测序列杂交第五十一页，共七十六页，2022年，8月28日标记已知序列的核酸片段②探针的标记方式标记已知序列的核酸片段5’

3’

标记一端带有放射性的已知序列的核酸片段全序列标记第五十二页，共七十六页，2022年，8月28日③DNA聚合酶I对探针序列的标记切口转移法(nicktranslation)：放射性同位素标记：DNA聚合酶I同时具备5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。第五十三页，共七十六页，2022年，8月28日5’3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。切口切口5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

第五十四页，共七十六页，2022年，8月28日纯化的DNA片段DNaseI制造单链切口DNAPolI进行切口转移一种-32P-dNTP和dNTPs5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记第五十五页，共七十六页，2022年，8月28日（4）Klenowfragment用枯草杆菌蛋白酶处理PolI可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成为Klenowfragment。323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段605个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ第五十六页，共七十六页，2022年，8月28日②DNA3’末端标记在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。①3’端补平5’

5’

klenow补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。klenow主要用途第五十七页，共七十六页，2022年，8月28日3’隐蔽末端的DNA片段Klenowfragment补平根据末端的顺序选择一种-32P-dNTPs末端标记的DNA限制性内切酶切5’----G3’

3’----CTTAA5’

5’----GAA3’

3’----CTTAA5’

5’----GAATT3’

3’----CTTAA5’

5’----G3’

3’----CCTAG5’

5’----GG3’

3’----CCTAG5’

5’----GGATC3’

3’----CCTAG5’

EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h第五十八页，共七十六页，2022年，8月28日③cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物第五十九页，共七十六页，2022年，8月28日（5）逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。a、鸟类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶b、莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶主要种类5’3’聚合酶活性5’3’外切酶活性3’5’外切酶活性RNaseH活性末端转移酶活性酶活性第六十页，共七十六页，2022年，8月28日逆转录酶的用途①合成cDNA以oligodT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。3′AAAAAAAAAAAAAA5′mRNA5′TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-18反转录酶Mg2+dNTP3′AAAAAAAAAAAAAA5′mRNA5′TTTTTTTTTTTTTTTT3′cDNA第六十一页，共七十六页，2022年，8月28日②合成cDNA双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链3′5′mRNA③RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。5′3′cDNA3′5′mRNA5′3′cDNA反转录酶5′3′cDNAklenow3′5′mRNA第六十二页，共七十六页，2022年，8月28日（6）TaqDNA聚合酶1988年Saiki等从水生嗜热杆菌中提取到一种耐热TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪。该酶基因全长2.49kb，编码832个氨基酸。该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性。（天然酶）TaqDNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。第六十三页，共七十六页，2022年，8月28日酶活性与热稳定性酶蛋白分子量94KDa，比活性200000∪/mg，Taq酶的浓度通常为1~2.5∪/l，太多浪费并易导致非特异性扩增。热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温在92.5℃、95℃、97.5℃时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。

PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，TaqDNA聚合酶仍有65%的活性。第六十四页，共七十六页，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶是Mg2+

依赖性酶，对Mg2+

浓度非常敏感。Mg2+浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。Mg2+

能与dNTP结合而降低PCR反应液中游离的Mg2+

浓度，优化浓度一般反应中Mg2+

浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L。适当浓度的KCl能使TaqDNA聚合酶的催化活性提高50～60%。离子依赖性第六十五页，共七十六页，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶具有5′→3′聚合酶活性和5′→3ˊ外切酶活性，而无3′→5′外切活性，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能。TaqDNA聚合酶的碱基错配机率为2.1×10-4。TaqDNA聚合酶还具有逆转录酶活性.忠实性Taq酶的最适温度最适温度：72-78oC延伸速度：约1000nt/min酶分子最长延伸