基因表达系统及技术

关于基因表达系统及技术第一页，共一百零五页，2022年，8月28日**基因表达系统1、大肠杆菌表达系统2、芽孢杆菌表达系统3、乳酸菌基因表达系统4、链霉菌基因表达系统5、酵母菌表达系统6、丝状真菌表达系统7、昆虫表达系统8、哺乳动物细胞表达系统9、植物生物反应器第二页，共一百零五页，2022年，8月28日1、大肠杆菌表达系统（GeneExpressionsysteminE.coli）

1）大肠杆菌表达系统的特点：（1）遗传背景清楚（2）目的基因表达水平高（3）培养周期短（4）抗感染能力强第三页，共一百零五页，2022年，8月28日2）大肠杆菌表达系统研究的发展趋势完善现有的表达系统；重组蛋白质的正确折叠；构象形成；蛋白质的分泌；菌体表面表达技术及其应用；重组蛋白质修饰加工。第四页，共一百零五页，2022年，8月28日真核基因在不同表达系统的表达表达白细胞介素IL-3(成熟蛋白)

大肠杆菌表达系统20-30u

地衣芽孢杆菌表达系统250-300u

酵母菌表达系统20u

哺如动物细胞2u第五页，共一百零五页，2022年，8月28日

2、芽胞杆菌表达系统（GeneExpressionsysteminBacillus）

1）特点枯草芽孢杆菌是非致病的土壤微生物，严格生长在有氧条件下。枯草芽孢杆菌遗传学相当先进，很多噬菌体和质粒适合用作克隆载体。芽孢杆菌可大量产生几种商品酶，如-淀粉酶，蛋白酶及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等，发酵技术发达。具有单层细胞膜组成较简单的细胞外壳。易于分离纯化分泌蛋白第六页，共一百零五页，2022年，8月28日2）枯草杆菌宿主菌株由于大肠杆菌的CaCl2转化法对枯草芽孢杆菌无效（1）选择可转化的菌株*168菌株及突变体：营养要求、芽孢形成和萌发、蛋白酶缺失、重组缺陷、限制/修饰系统缺陷、转座子插入（2）选择转化的方法感受态转化：原生质体转化：电转化：甘氨酸添加培养感受态其它方法，如转导、结合转移第七页，共一百零五页，2022年，8月28日3）、可作为宿主的其它菌种：嗜碱芽孢杆菌Bacillusabcalophilus

蛋白酶淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefacilus

-淀粉酶短芽孢杆菌Bacillusbrevis地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis

淀粉酶，抗真菌肽巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium

淀粉酶短小芽孢杆菌Bacilluspumilus

蛋白酶第八页，共一百零五页，2022年，8月28日球形芽孢杆菌Bacillussphaericus

灭蚊毒素蛋白嗜热芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus

高温-淀粉酶苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis

杀虫晶体蛋白耐碱的芽孢杆菌Bacillusalcalophilic

碱性蛋白酶炭疽芽孢杆菌Bacillusanthracis第九页，共一百零五页，2022年，8月28日4）枯草芽胞杆菌表达系统研究的发展趋势1、表达真核基因蛋白酶水解——缺陷型、抑制剂

2、表达商业用酶克隆基因的整合

3、表达杀虫晶体蛋白提高杀虫毒力，减少杀虫时间，增加广谱

4、利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加强在医药领域多个方面的应用第十页，共一百零五页，2022年，8月28日

3、乳酸菌基因表达系统（GeneExpressionsysteminLacticAcidBacteria）

1）特点：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。大多数不运动，少数以周毛运动。菌体常排列成链。在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳酸发酵，而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、CO２等物质的称为异型乳酸发酵。有微好氧菌和专性厌氧菌。第十一页，共一百零五页，2022年，8月28日LacticAcidBacteriaGenera:StreptococcusLeuconostocPediococcusLactobacillusEnterococcusLactococcusAlltheabovegeneragrowinchains.Manyareusedforthefoodindustry.第十二页，共一百零五页，2022年，8月28日2）理想乳酸菌表达载体的特征：1、稳定的遗传、传代能力（复制子）2、具有显性的转化筛选标记（Emr

）3、启动子的转录是可以调控4、具有多克隆酶切位点第十三页，共一百零五页，2022年，8月28日3）研究进展（1）食品发酵方面的应用第十四页，共一百零五页，2022年，8月28日（2）乳酸菌菌种鉴定REA（RestrictionEndonucleaseAnalysis）16SrRNA（PCR）SDS第十五页，共一百零五页，2022年，8月28日（3）抗微生物和食品腐败第十六页，共一百零五页，2022年，8月28日（4）细胞表面层和外多糖利用生物异构化方法从亚油酸生产具有生理活性的共轭亚油酸（CLA）异构体单体。筛选到一株产生9顺,11反共轭亚油酸的乳杆菌L1，建立了亚油酸制备技术，CLA小试发酵工艺，共轭亚油酸的HPLC纯化分离和毛细管电泳鉴定技术。

（5）蛋白质降解、多肽降解和脂降解第十七页，共一百零五页，2022年，8月28日（6）分子遗传学基因克隆表达调控染色体分析

InsulinGeneinsertedintoPlasmid

RecombinantDNAAbsorbedbyBacteria

BacteriaProducesInsulin

InsulinReadytobeAdministeredtoDiabeticPatients

第十八页，共一百零五页，2022年，8月28日（7）益生菌（PROBIOTICS）LactobacillusandBifidobacterium第十九页，共一百零五页，2022年，8月28日食品级基因修饰菌是指被导入源于同种或公认的安全的食品级微生物的基因，因此具有某种优良性状的用于发酵食品生产的微生物。1、功能性基因必须源于同种菌或公认的安全的食品级微生物；2、载体必须是食品级的，不得含有非食品级的功能性DNA片段；3、选择性标记不得选用各种抗生素抗性标记。应选用食品级的标记基因，如糖类利用标记、营养缺陷型标记等；4、宿主菌的遗传特性清楚且稳定，具有足够的安全性，应选用适当的分子生物学方法如DNA序列分析、杂交等确定宿主菌的遗传组成。第二十页，共一百零五页，2022年，8月28日食品级载体不但是GRAS微生物，而且不依靠抗生素抗性作为选择标记，因而更为安全，在食品、医药方面具有广泛的应用潜力。乳酸菌的食品级高效诱导分泌表达NICE系统是可控制的蛋白质生产的最理想的系统。第二十一页，共一百零五页，2022年，8月28日4、链霉菌基因表达系统

（GeneExpressionsystemin

Streptomyces

）

1）特点大多数来自于土壤能形成孢子的革兰氏阳性菌有复杂的形态（以无中隔分枝菌丝方式生长）和生理生命周期产生多种次级代谢产物基因组是大肠杆菌的两倍，

GC含量高，平均为74%第二十二页，共一百零五页，2022年，8月28日2）链霉菌的载体（1）高拷贝载体

pIJ10140-800拷贝硫链丝菌素（tsr），新霉素（neo），酪氨酸酶（mel）（2）低拷贝载体

pIJ9201-2拷贝广泛宿主能插入大于30kb的片段（3）穿梭载体pHJL210（SCP2*/pBR322）（4）柯斯载体（cosmid）构建基因文库第二十三页，共一百零五页，2022年，8月28日（5）接合转移载体

pBR322/pIJ101/RK2（IncP）（转移功能）（6）噬菌体载体

C31衍生的，如KC304，KC505（7）表达载体利用PtipA启动子构建的表达载体

pIJ6021（8）分泌载体利用S.longisporus分泌的枯草杆菌素抑制剂subtilisin（SSI）分泌和抑制丝氨酸蛋白酶特性构建如pIJ702第二十四页，共一百零五页，2022年，8月28日（9）其他载体（A）大容量载体细菌人工染色体BAC

利用F因子复制起始点/par元件，1-2拷贝，克隆100-300kb的片段（B）整合型载体利用pSAM2整合元件构建的pPM927（C）高表达载体整合高表达载体pCJR24，是利用天蓝色链霉菌A3中的激活调节基因actII-ORF4与actI基因启动子构建的第二十五页，共一百零五页，2022年，8月28日3）链霉菌基因转移的方法（1）原生质体转化转化率不高,制备过程中影响因素多,系统对外源DNA的限制修饰作用（2）接合转移

DNA以单链形式进入宿主菌大肠杆菌S17-1菌株,质粒RSF1010（3）电脉冲穿孔转化率比原生质体高10-100倍（4）噬菌体转导第二十六页，共一百零五页，2022年，8月28日4）链霉菌基因的调控和蛋白质的分泌表达（1）RNA聚合酶基因多样性天蓝色链霉菌有两种不同形式的RNA聚合酶全酶32

（与大肠杆菌有保守性）和49

（发育阶段）多因子,双启动子研究表明天蓝色链霉菌至少有7个不同的因子,参与营养期,孢子形成,次级代谢等第二十七页，共一百零五页，2022年，8月28日（2）调节基因A、途径专一调节基因（pathwayspecificregulator）具有链霉菌调节蛋白新家族(SARP)正调控因子B、全局调节基因（globalregulator）调控所有抗生素生物合成的调节基因absA

编码双组分信号转导系统（3）调节因子小分子脂溶兼水溶的γ丁酰内酯作为激素样物质激发次级代谢和/或气生菌丝的形成第二十八页，共一百零五页，2022年，8月28日（4）链霉菌中的蛋白外泌系统蛋白分泌机制大多数链霉菌的外泌蛋白前蛋白中有N端信号序列，它们的外泌依靠Sec-介导的分泌系统。现已从链霉菌中已克隆了SecA，SecY，SecD，SecE和SecF类似物。SecA(Blancoetal.1998)属于膜相关的转位ATPase,它阻止分泌前蛋白形成三级结构前体，促进前蛋白定位于分泌的转位酶上。第二十九页，共一百零五页，2022年，8月28日蛋白的转位和穿膜链霉菌中蛋白的转位与穿膜机制尚未搞清，如将IL-2与tendamistat信号肽融合，在链霉菌中只有1/20翻译产物转位（translocation）至培养基和积累在胞内。第三十页，共一百零五页，2022年，8月28日5）影响链霉菌中基因表达的因素（1）启动子对外源基因表达的影响（2）信号肽对外源蛋白分泌的影响A、信号肽N末端氨基酸序列正电荷数对基因表达的影响B、信号肽切割位点后的氨基酸数对基因表达的影响C、信号肽和目的蛋白之间的距离对基因表达的影响第三十一页，共一百零五页，2022年，8月28日（3）密码子、SD序列和终止子等对基因表达的影响链霉菌中翻译起始密码子为ATG或GTG，终止密码子为TAA或TAG（4）DNA扩增序列对基因表达的影响（5）发酵条件对外源基因表达的影响第三十二页，共一百零五页，2022年，8月28日6）链霉菌表达系统优缺点及研究发展趋势（1）优点：链霉菌工业化培养条件成熟,适合于大规模产业化链霉菌基本为非致病菌,不产生内毒素可以进行高密度培养,在稳定期仍能维持异源蛋白的产生链霉菌可分泌胞外酶,利用信号肽可分泌外源蛋白链霉菌中有许多可利用的转录起始信号,利用它可以高表达外源基因第三十三页，共一百零五页，2022年，8月28日（2）缺点：由于研究链霉菌表达有生物活性的真核来源的蛋白还处于初级阶段,许多实验结果不具有普遍规律,存在的问题有下列方面高活性启动子信号肽切割位点的氨基酸序列蛋白酶的水解次级代谢可控制启动子翻译后加工第三十四页，共一百零五页，2022年，8月28日（3）研究发展趋势结合基因组学和转录组学,完善基因表达系统优化组合强启动子,信号和先导肽,从分子水平研究其结构元件与功能的关系在蛋白水平研究蛋白的分泌机理,特别是蛋白的转位和转膜机制研究次级代谢产物生物合成酶系的结构,构建新化合物文库,用于新药的开发第三十五页，共一百零五页，2022年，8月28日5、酵母菌表达系统

（GeneExpressionsysteminYeast

）

*1996年，完成了酵母基因组DNA（1.25x107bp)全序列测定工作。Division:buddingDonotformfilamentsSomeformfilamentsSomecanmate.第三十六页，共一百零五页，2022年，8月28日1）酵母菌基因表达系统的宿主特点：（1）安全无毒,不致病。（2）有较清楚的背景,容易遗传操作。（3）容易进行载体DNA的导入。（4）培养条件简单，容易进行高密度发酵。（5）有良好的蛋白质分泌能力。（6）有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。第三十七页，共一百零五页，2022年，8月28日2）酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）酿酒酵母是最早发展的真核基因表达系统。已表达和生产乙型肝炎疫苗、人胰岛素、干扰素等。酿酒酵母的不足之处：（1）发酵时会产生乙醇，乙醇的积累会影响酵母本身的生长，因此较难进行高密度发酵。（2）蛋白质的分泌能力较差。（3）虽然能进行蛋白质的糖基化修饰，但是与高等真核生物的相比，所形成的糖基侧链太长。

过度的糖基化会引起副作用。第三十八页，共一百零五页，2022年，8月28日3）毕赤酵母（Pichiapastoris）优点：（1）可以使发酵密度达到很高的水平；（2）分泌外源基因表达产物的能力强；（3）糖基化修饰功能更接近高等真核生物。不足：分子生物学的研究基础差，要对其进行遗传改造困难较大；不是一种食品微生物，发酵时又要添加甲醇，所以要用它来生产药品或食品还没有被广泛接受。发酵虽然能达到很高的密度，发酵周期一般较长。第三十九页，共一百零五页，2022年，8月28日4）酵母表达系统研究进展（1）外源基因在酵母中的高表达（A）提高和控制外源基因的转录水平*强启动子：磷酸甘油酸激酶基因的启动子（pgk1）*营养调节启动子：碳源调控的gal1，gal10基因，无机磷调控的poh5基因*温控调节启动子：sir3基因第四十页，共一百零五页，2022年，8月28日（B）提高表达载体的在细胞的拷贝数和稳定性*酵母菌的内源质粒：野生型2µ质粒*核糖体DNA：rDNA介导的多拷贝整合*单拷贝DNA片段：HIS4或AOX1介导（C）提高外源基因在酵母系统表达水平的其它因素蛋白质分泌的调控翻译效率；酵母偏爱密码子；蛋白酶降解；发酵密度第四十一页，共一百零五页，2022年，8月28日（2）提高外源基因表达产物的的质量（A）表达系统的遗传稳定性（B）胞内表达产物的加工和修饰（C）分泌表达产物的加工和修饰（3）酵母表达系统的新应用（A）酵母表达系统在人类基因组研究中应用

(a）人类基因的功能分析

（b）人类蛋白质相互作用网络图谱分析

（c）人类分泌蛋白质和受体基因的快速筛选（B）酵母表达系统在药物研究中的应用第四十二页，共一百零五页，2022年，8月28日

6、丝状真菌表达系统（GeneExpressionsysteminFilamentousFungi）

1）载体特点：天然质粒，多数为线性，仅在粗糙链孢霉发现有环状质粒。目前使用的载体还是以细菌质粒为基本结构。

1、营养选择性标记：argB

（精氨酸原养型）和amdS（乙酰胺利用）

2、显性选择性标记：G418（氨基糖苷类抗生素）

3、启动子：从真菌基因组中筛选强启动子,如cbh1（纤维素生物水解酶）gpd（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）第四十三页，共一百零五页，2022年，8月28日转化方法：（1）原生质体转化裂解酶Novozyme234，或与-葡萄醛酸糖苷酶混合使用；渗透压稳定剂（如氯化镁等无机盐或山梨醇、蔗糖等糖）；聚乙二醇（PEG）转化率低，仅为10-30转化子/ugDNA（2）电击转化

-葡萄醛酸糖苷酶预处理，电击条件，12.5kV/cm,电容25F,电阻400。（3）共转化两个质粒共转化在丝状真菌中有较高的整合频率。一个质粒携带目的基因，另一个有筛选标记。所筛选的转化子中90%含有目的基因。第四十四页，共一百零五页，2022年，8月28日2）基因的结构和功能

真菌的核通常为单倍体核，基因组小，约为大肠杆菌的7倍，酵母菌的2倍，仅为人类基因组的1%（一）基因转录（1）5’非编码区：核心启动子单元第四十五页，共一百零五页，2022年，8月28日（2）CAAT保守序列较高等的真核生物中，常在位于-80bp处，发现GC（C/T）CAATCT保守序列，丝状真菌常位于-100～-200bp区。（3）TATA保守序列常位于转录启始点上游-40～-100bp第四十六页，共一百零五页，2022年，8月28日（4）CT含量丰富区常位于-10～-60bp（平均-20bp）（5）转录起始点通常有2个以上的转录启始点（6）转录加工和翻译帽子结构（Cap），AUGC5‘-端不翻译mRNA约5～300bp，通常30～70bpCAATTATACTtspATG第四十七页，共一百零五页，2022年，8月28日（7）内含子68%的丝状真菌的基因含有内含子大多数的拼接位点5‘端GTPuNGPy3’端PyAG（8）3’非编码区

PolyA寡聚物第四十八页，共一百零五页，2022年，8月28日3）次级代谢产物的生产

（一）β-内酰胺抗生素青霉素、头孢菌素C（1）、生物合成基因克隆和调控研究（A)编码ACV合成酶的基因acvA(pcbAB)（-氨基己二酸-半胱氨酸-颉氨酸合成酶）葡萄糖调控，磷酸盐调控，铵调控（B）异青霉素N合成酶基因ipnA(pcbC)第四十九页，共一百零五页，2022年，8月28日（C）异青霉素N:酰基-辅酶A酰基转移酶(IAT)的基因aatA(penDE)（D）脱乙酰氧头孢菌素C合成酶/羟化酶(DAOC/DAC)双功能基因cefEF

（E）编码乙酰基-CoA:DAC乙酰基转移酶的基因cefG第五十页，共一百零五页，2022年，8月28日(2)、应用(A)增加基因量提高产量(B)引入血红蛋白基因增加抗生素产量(C)工程菌直接合成7-ACA或7-ADCA（二）多肽代谢物具有抗微生物和其他药理学活性如：线状多肽—由绿色木霉产生的丙甲菌素第五十一页，共一百零五页，2022年，8月28日4）发展趋势

1、通过基因工程技术改良丝状真菌表达系统，扩大遗传背景的深入了解。2、研究丝状真菌自身的自我复制序列，提高DNA转化率。3、研究转录水平，翻译水平和翻译后加工的调控，增加产量。4、研究代谢网络的调节关键点，最大限度的表达次级代谢产物，胞外酶，外源蛋白第五十二页，共一百零五页，2022年，8月28日昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰、加工以及转移外源蛋白的能力。利用重组杆状病毒在昆虫细胞系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达系统，而另一类新型的昆虫细胞表达系统，则是建立在对果蝇等昆虫细胞进行稳定转化的基础之上的，在稳定性和表达效率方面有着更为突出的优点。7、昆虫细胞表达系统（GeneExpressionsysteminInsectCells）第五十三页，共一百零五页，2022年，8月28日目前使用杆状病毒表达系统克隆和表达了许多外源基因，例如：H5N1亚型禽流感病毒血凝素、人骨形成蛋白2、人类细小病毒B19壳蛋白VP2，人尿激酶原cDNA、信号肽引导源基因等。抗体分子有鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、单链抗体及人单克隆抗体等多种抗体分子，还将抗体分子与尿激酶型纤溶酶原激活物等肿瘤相关蛋白进行了融合表达，这些抗体分子多数能正确组装，完成糖基化过程，具有相当的活性。第五十四页，共一百零五页，2022年，8月28日1）昆虫表达系统的特点重组蛋白具有完整的生物学功能为高表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。

能进行翻译后的加工修饰

对蛋白质进行完整的翻译后加工，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致。第五十五页，共一百零五页，2022年，8月28日表达水平高

与其它真核表达系统相比较，此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50%。

能容纳大分子的插入片段

杆状病毒粒子可以扩大，并能包装大的基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因长度的上限。

能同时表达多个基因

杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。对脊椎动物安全

第五十六页，共一百零五页，2022年，8月28日3）昆虫杆状病毒的一般概念

（1）昆虫杆状病毒是已知昆虫病毒中的最大类群，是研究最多、实用意义最大的昆虫病毒。它们是很多昆虫病的病原，如家蚕的脓病，同时也是农林主要害虫的控制因子，对它的研究具有重要的意义，目前对杆状病毒的研究日益广泛和深入。第五十七页，共一百零五页，2022年，8月28日（2）杆状病毒的分类杆状病毒因其病毒粒子呈杆状而得名。杆状病毒科（Baculoviridae）分为①包含体杆状病毒亚科(Eubaculoverinae),又称真杆状病毒亚科；②非包含体杆状病毒亚科(Nudibaculoverinae)。包含体杆状病毒亚科根据其包含体的多少和形态分为核型多角体病毒属（NuclearPolyhedrosisVirus，NPV）和颗粒病毒属（GranulosisVirus，GV）第五十八页，共一百零五页，2022年，8月28日NPV属按囊膜内核衣壳数目的多少分成1）单粒包埋核型多角体病毒（SNPV）代表种：家蚕核型多角体病毒（BmNPV）2）多粒包埋核型多角体病毒（MNPV）代表种：苜蓿尺蠖核型多角体病毒（AcMNPV）自从1983年Summers等人构建了第一个AcMNPV重组病毒表达外源基因以来，杆状病毒表达系统的分子生物学及应用研究取得了飞速发展。第五十九页，共一百零五页，2022年，8月28日（3）杆状病毒的基因结构以AcMNPV为例杆状病毒基因组是共价闭合环状的dsDNA，其基因组全长134kb，共有337个开放阅读框，其中可以编码多肽的区段共有137个。

生理条件下，DNA与富含Arg的碱性蛋白结合，此DNA－蛋白复合体由39KD的衣壳蛋白组成的外被所包围，形成一个核壳体。若干个核壳体外面在包被一层脂蛋白外被就成为病毒颗粒。几个病毒颗粒聚集成一簇，嵌在晶状基质中成为一个多角体包含体。第六十页，共一百零五页，2022年，8月28日（4）杆状病毒表达载体昆虫杆状病毒表达载体系统通常由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成。其技术路线分以下几步:（A）将外源片段克隆到载体质粒中，置于杆状病毒启动子控制之下，上下游各有一段与亲本病毒DNA相匹配的侧翼序列，构建成转移载体；（B）把转移载体和野生型病毒共转染入昆虫细胞，通过同源重组将外源片段插入到病毒基因组，以特定的筛选标记和方法获得重组病毒。（C）当重组病毒在受体细胞内复制时，外源片段也得到了表达。最后空斑纯化重组病毒，扩大培养，分离、纯化所表达的外源蛋白。第六十一页，共一百零五页，2022年，8月28日转移载体构建由于AcMNPV基因组的巨大，不可能用单一的限制性酶切位点来对它进行操作，所以目前使用的杆状病毒表达载体系统大多采用构建转移载体（transfervector）。将病毒非必需基因polh基因克隆到一个大肠杆菌质粒中，利用限制性内切酶和DNA外切酶或者PCR的方法，除去部分或全部polh基因编码序列，保留完整的启动子部分和多角体基因下游序列，即多角体基因侧翼序列，之间加入单一或者多克隆位点，可以插入外源基因。第六十二页，共一百零五页，2022年，8月28日杆状病毒分子量大，不能象质粒载体一样利用多克隆位点进行基因重组，而只能利用杆状病毒和带有目的基因序列的质粒载体进行共转染。以野生型杆状病毒ＤＮＡ(ＡＣＭＮＰＶ)进行共转染时重组率极低,仅有0.1%.第六十三页，共一百零五页，2022年，8月28日利用线形化的病毒载体可将重组率提高到30%。在部分载体中引入了β-半乳糖苷酶基因后可以利用插入失活结合蓝白斑进行重组体的筛选。BaculogoldTM是一种缺失衣壳蛋白编码序列ＯＲＦ1629部分序列的缺失致死型突变体,此ＤＮＡ与基于多角体蛋白位点的转移载体对细胞进行共转染时,只有发生同源重组的病毒才有复制能力.第六十四页，共一百零五页，2022年，8月28日果蝇表达系统(Drosophilaexpressionsystem，DES)包含表达载体和相应的选择载体。通过表达载体和选择载体的共转染,可在3～4周时间内获得表达重组蛋白的稳定转染的细胞系.而且通过优化表达载体和选择载体的比例,可以得到含有高拷贝数目的基因的细胞系,从而提高目的蛋白的表达量。第六十五页，共一百零五页，2022年，8月28日

以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目昆虫细胞中复制，不能在其他昆虫细胞(如果蝇细胞)中复制，然而研究表明在一定条件下，杆状病毒也能感染果蝇细胞。在果蝇细胞中，杆状病毒的多角体基因启动子几乎不发生作用，利用的是果蝇启动子如Hsp70启动子、肌动蛋白5C启动子、金属硫蛋白基因启动子等，其中，Hsp70启动子的作用最强。重组杆状病毒感染果蝇细胞后不会引起宿主细胞的裂解，且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似，因此，杆状病毒-果蝇系统是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。第六十六页，共一百零五页，2022年，8月28日4）昆虫细胞培养和重组蛋白表达

（1）昆虫细胞的培养基和培养条件所有的昆虫细胞培养基都含有基本盐类，糖类，氨基酸，有机酸，维生素以及微量元素。通常用的商品培养基有Grace培养基，呈粉状。配制培养基的时候要加入10％胎牛血清（FBS）和酵母水解物（YL）和水解乳蛋白（LH）昆虫细胞一般在27℃生长最佳，培养基pH是6.2，无需CO2。多数昆虫细胞的倍增时间是18－22h第六十七页，共一百零五页，2022年，8月28日（2）昆虫细胞的大规模悬浮培养昆虫细胞比较容易在实验室小规模水平上（100－1000ml），在磁力搅拌瓶中生长，其密度一般可以达到3×106/ml，活力在95％以上。氧的供给：在成批培养的密闭容器中需解决通氧，而且在培养感染重组病毒的昆虫细胞时耗氧量比未感染的要高。细胞保护：由于昆虫细胞对于剪切力和产生气泡的敏感性，细胞容易破裂，化合物PluronicF－68可以保护细胞因上述原因造成的损伤。其它因素：还有好多因素要考虑，如反应器的设计，细胞密度，培养基成分，病毒感染的条件等。第六十八页，共一百零五页，2022年，8月28日

（3）病毒感染和基因表达由于昆虫细胞杆状病毒表达系统生产外源蛋白是一种间歇性的程序进行生产的，因为所有细胞都会因病毒感染而引起病理性死亡，因此，在生产时往往需要至少有两个反应器：第一个反应器培养正常的昆虫细胞，第二个反应器用于病毒接种感染表达。第六十九页，共一百零五页，2022年，8月28日

利用杆状病毒的极早期基因ie基因启动子构建转移载体，由于病毒极早期基因启动子的转录可以直接利用宿主细胞的RNApolymeraseII，所以用这样的质粒直接转化昆虫细胞，使昆虫细胞能够持续表达外源蛋白。第七十页，共一百零五页，2022年，8月28日5）杆状病毒表达载体系统的新应用（1）广泛用于在昆虫细胞中表达各种重组蛋白。昆虫杆状病毒表达载体系统于20世纪80年代初期问世以来，在20多年的时间里已成为生产与研究各种原核、真核蛋白有力而普及的工具。第七十一页，共一百零五页，2022年，8月28日（2）用于杆状病毒表面的蛋白展示，建立蛋白库，简化单克隆抗体的纯化和蛋白与受体相互作用的研究。有潜力的应用是病毒表面的蛋白展示功能（proteindisplay）。将外源基因插入到杆状病毒表面糖蛋白gp67的信号肽与成熟蛋白编码序列之间，不破坏它本身的转运及膜融合功能，从而作为载体将外源蛋白展示在病毒粒子表面。第七十二页，共一百零五页，2022年，8月28日（3）构建含有哺乳动物启动子的重组杆状病毒，转导哺乳动物细胞，作为良好的基因转移载体，用于基因转移和基因治疗。杆状病毒可以被非宿主细胞如哺乳动物细胞所吞饮，但是不能在非宿主细胞中复制。带有哺乳动物启动子的重组杆状病毒可以转导原代培养的肝细胞，并表达报告基因。根据杆状病毒在哺乳动物细胞中的特点，作为基因传递载体，可以将带有p53基因的重组杆状病毒转导Saos－2humanosteosarcoma细胞，100％的转化细胞都能表达p53基因，这就为体内利用基因治疗法治疗癌症等疾病提供了途径。第七十三页，共一百零五页，2022年，8月28日

尽管昆虫杆状病毒表达系统存在一些不足之处，但它在农业、基础分子生物学以及医学领域都具有极其重要的作用。利用不断发展的新技术将其改造为较高效的杀虫剂仍然具有极其诱人的前景。另外，随着对这一表达系统本身的基础理论研究的不断深入，其调控机理也将越来越清晰明了，新的调控因子及强的增强子也可能被找到，这将极大地提高蛋白的表达效率。第七十四页，共一百零五页，2022年，8月28日8、哺乳动物细胞表达系统（GeneExpressionsysteminMammals）

1）特点糖基化等翻译后修饰。能够指导蛋白质的正确折叠，目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白。第七十五页，共一百零五页，2022年，8月28日2）表达载体病毒载体：以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(SFV)载体等。第七十六页，共一百零五页，2022年，8月28日第七十七页，共一百零五页，2022年，8月28日第七十八页，共一百零五页，2022年，8月28日3）高效表达载体构建（1）转录水平调控（A）利用病毒源性和细胞源性的强启动子，如mCMV、hCMV、hEF-lα、人的c-fos、鸡胞浆-β肌动蛋白等启动子。CMV启动子在细胞处于S期、生长迅速时，转录活性最高；但在大规模生产的中、后期，外源基因的表达水平下降。此时，pEF-1α启动子的转录起始效率更强。第七十九页，共一百零五页，2022年，8月28日（B）利用启动子、增强子元件构建杂合启动子Masayuki等发现CMV增强子能提高hEF-1α启动子控制下的目的基因表达量4-9倍。Kim等发现将hEF-1α启动子的第1个内含子置于mCMV启动子与目的基因(荧光素酶)之间能极大地提高目的基因在CHO细胞中的表达，使荧光素酶的表达量提高了8.2倍。第八十页，共一百零五页，2022年，8月28日（C）提高宿主细胞转录因子的表达水平EGF能提高EF-1αmRNA的转录量和蛋白质的表达。Reza等将用作结合DNA的结构域-锌指结构和VP16蛋白的转录激活结构域融合构建了人工转录激活因子，将CMV启动子的转录效率提高了2倍多。第八十一页，共一百零五页，2022年，8月28日（2）翻译水平的调控

mRNA寿命、mRNA的翻译起始效率和翻译产物的加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要的影响。（A）内部核糖体进入位点(IRES)能使同一mRNA中除第1个基因之外的其他基因也得到有效表达。（B）翻译增强子可提高翻译效率。（C）使用宿主细胞偏爱的密码子来对目的基因的密码子进行优化。第八十二页，共一百零五页，2022年，8月28日（3）整合位点的优化目的基因在CHO细胞染色体上整合位点区域的状态对于目的基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中的稳定性起着决定性的作用。只有那些整合位点处于染色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的基因。第八十三页，共一百零五页，2022年，8月28日（A）选择基因(如neo)的弱化表达，使大量整合在低表达整合位点的细胞由于选择标记基因表达量不够而在选择培基条件下死亡。（B）在载体上添加染色体上的某些特定序列(如骨架/基质附着区)，使表达载体整合到宿主细胞的染色体后能模拟染色体的高转录活跃区。第八十四页，共一百零五页，2022年，8月28日3）宿主细胞常用的几种用于表达重组蛋白的细胞株BHK-21细胞CHO-K1细胞C127细胞MDCK细胞Namalwa细胞Vero细胞鼠骨髓瘤细胞COS细胞骨髓瘤细胞株(如Sp2/0和J558L)不同的细胞对重组蛋白的修饰可能会稍有差别。第八十五页，共一百零五页，2022年，8月28日发现新细胞株：来源于Madin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株(MDCK)，表达分泌型的基质金属蛋白酶MMP13。高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％～l0％，而同样的载体在CHO细胞中仅得到低水平的表达。第八十六页，共一百零五页，2022年，8月28日对现有细胞株进行遗传改造：基于腺病毒E1A蛋白可反式激活CMV启动子，Cockett等建立了稳定表达E1A的CHO细胞株，在该细胞中重组前胶原酶的产量与CHO细胞相比增加了12倍。第八十七页，共一百零五页，2022年，8月28日4)常用的细胞表达系统(1)CHO/DHFR和CHO/NEOSPLA

表达系统（2）C127/BPV-1系统（3）骨髓瘤细胞表达系统第八十八页，共一百零五页，2022年，8月28日5）表达系统方式（1）瞬时表达系统：宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂。简捷，实验周期短，规模大。技术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等。第八十九页，共一百零五页，2022年，8月28日（2）稳定表达系统：载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。第九十页，共一百零五页，2022年，8月28日（3）诱导表达系统：目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以开放。早期—糖皮质激素、重金属离子—特异性低、毒性高。近年—非哺乳动物细胞来源的调控蛋白—外源基因表达低、诱导效应高。第九十一页，共一百零五页，2022年，8月28日6）基因的导入方法光穿孔法冲击波法基因枪法穿孔法磷酸钙共沉淀法脂质体法抗体转染法其他第九十二页，共一百零五页，2022年，8月28日7）展望（一）改进表达载体，提高表达水平和产量

1.采用更强的启动子和增强子

2.更好地利用扩增系统获寻找高表达位点

3.采用和改造更好的宿主细胞（二）利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本

1.采用“代谢工程”改造工程细胞

2.改进培养工艺，降低生产成本（三）抑制细胞调亡，延长培养时间（四）采用“糖基化”工程，提高产品质量第九十三页，共一百零五页，2022年，8月28日9、植物生物反应器（PlantBioreactor）植物生物反应器是指通